PMEEE、PMEEE1 和 PMEEN，以 PMEEE 為有效之分層
(IC50=27.1
µ
g/ml) ，其活性測試結果如下表(Table 9.)。Table 9. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated withPMEE, PMEEN, PMEEE1 and PMEEE for 96 hrs
Conc. MTT assays（%） NBT assays（%）
HL-60 cells（2×104/ml）were treated with PMEE ,PMEEN, PMEEE1 and PMEEE for 96 hrs.
Data was presented as mean ± SD from three separate experiments.
p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control
經由第一次測試得知，PMEEE 為有效之分層，故配合分離，將其通 過矽膠管柱層析，再次分為六個收集層， 結果證明在第一層(PMEEE-1) 及第二層(PMEEE-2)有強烈的抗增殖活性產生，第三收集層則為葛雌素所 在處，活性並沒有前兩者強。故先從前兩層開始分離，第三層繼續分離葛 雌素標準品，活性測試結果如下：(Table 10)
Table 10. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-(1~6) for 96 hrs
Conc. MTT assays（%） NBT assays（%）
HL-60 cells（2×104/ml）were treated with PMEEE 1~6 for 96 hrs. Data was presented as mean ± SD from three separate experiments. p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；
compared with control
將 PMEEE-1 的分層再經矽膠管柱層析，分為四個收集層，
PMEEE-1-1、PMEEE-1-3 及 PMEEE-1-4 為有效分層，PMEEE-1-(1~4)的 活性測試結果如下表：(Table)，但由於量少其中化合物較複雜及 PMEEE-2 的作用較強，故本研究先將其針對 PMEEE-1-(1~4)的繼續活性分離訂於未 來的目標，先致力於分離 PMEEE-2 的化合物。
Table 11. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-1-(1~4) for 96 hrs
Conc（μg/ml） MTT assays（%） NBT assays（%）
Control 0 100.0±1.1 4.5 ± 0.5
HL-60 cells（2×104/ml）were treated with PMEEE-1-(1~4）for 96 hrs.
Data was presented as mean ± SD from three separate experiments.
p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control.
PMEEE-2 通過矽膠管柱層析，分為四個分層 PMEEE-2-(1~4)，得知 PMEEE-2-1 及 PMEEE-2-2 有較強的抗增殖活性。故依循此指標，繼續向 下分層，PMEEE-2-1 及 PMEEE-2-2 分別依照分離的方法，進行純化的步 驟，以求細分至可獲得純化合物。PMEEE-3 在葛雌素分離過程則有沈澱 產生，通過 LH-20 管柱層析後，分離出化合物為 PMEEE-3flaf，經光譜鑑 定為 Daidzein，有不錯的抗增殖活性及些可能有許分化活性。
Table 12. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-2-(1~4), PMEEE-3flaf for 96 hrs
Conc.（μg/ml） MTT assays（%） NBT assays（%）
Control 0 100.0±1.1 1.3 ± 0.3
HL-60 cells（2×104/ml）were treated with PMEEE-2-(1~4),PMEEE3flaf for 96 hrs.
Data was presented as mean ± SD from three separate experiments.
p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control.
PMEEE-2-1 及 PMEEE-2-2 的分離層如下表 (Table.13.)，
PMEEE-2-1-1、PMEEE-2-1-2、PMEEE-2-2-E 及 PMEEE-2-2-fh 都有不錯 的活性，其中 PMEEE-2-1-2 及 PMEEE-2-1-3 有很強的抗增殖活性，經由 TLC 再次比對成分，可考慮合併，故合併後再次用管柱分離收集。而在 PMEEE-2-2-E 中經過再次純化後，得到 Daidzein 及光譜確定結構的 Genitein。
Table 13. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-2-(1~4), PMEEE-2-2-E, PMEEE-2-2fh for 96 hrs
Conc. (μg/ml） MTT assays（%） NBT assays（%）
HL-60 cells（2×104/ml）were treated with PMEEE-2-1-(1~4) and PMEEE-2-2-E(fh) for 96 hrs.Data was presented as mean ± SD from three separate experiments.
p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control.
PMEEE-2-1-2 及 PMEEE-2-2-3 通過管柱層析後，分為五個部分。前 四個部分的皆在 IC50＝20（μg/ml），具有相當的研究價值，但是，很遺 憾的是，本研究後續目前仍在進行中，目前無較多資料。另一部份，在分 離葛雌素的過程中，亦把第二次分離而得的葛雌素前一段分離層，測得其 抗增殖活性亦有不錯的效果。
Table 14. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with PMEEE-2-1-2,3-(1~5), PreMi for 96 hrs
Conc（μg/ml） MTT assays（%） NBT assays（%）
Control 0 100.0±1.1 3.8 ± 1.3
PMEEE-2-1-2.2-5 2.5 5
HL-60 cells（2×104/ml）were treated with PMEEE-2-1-2,3-(1-5) ,PreMifor 96 hrs.
Data was presented as mean ± SD from three separate experiments.
* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control.
基於對於化合物抗增殖及分化活性的探討，本研究將分離獲得四個 化合物 Miroestrol、Daidzein、Genistein 和 Puerarin，加上本實驗室已有的 Genistin 及由 Wanko.購得的 Daidzin，本實驗利用 retinoic acid 做 positive control，其活性茲整理如下表(table 15.)。
Table 15. MTT assay and NBT assay on HL-60 cells treated with all compounds for 96 hrs
Conc（μg/ml） MTT assays（%） NBT assays（%）
Control 0 100.0±1.1 0.7 ± 0.3
HL-60 cells（2×104/ml）were treated with Genistein, Genistin,Daidzein, Daidzin, Puerarin,Miroestrol for 96 hrs. Data was presented as mean ± SD from three separate experiments.* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；compared with control.
本次利用 HL-60 細胞株，經過 MTT assay 及 NBT assay，分離所得的
四個化合物，Puerarin 幾乎無活性，Genistein 及 Genistin 對 HL-60 細胞株 研究呈現出有較強抗增殖活性，而且 Genistein 可能有分化的活性產生，
Daidzein 及 Daidzin 則抗增殖活性效果較弱，但接可能有分化的效果產 生，六個化合物的抗增殖活性強度依序如下：
Genistein ( IC50= 20.7μM ) > Genistin ( IC50= 23.1μM ) >
Daidzin ( IC50＝ 61.1μM) > Daidzein ( IC50＝ 87.8μM) >
Miroestrol ( IC50＝113.4μM) > Puerarin
此外，Genistin 及 Daidzin 亦呈現頗強之活性，而這些活性成分同樣地也 是本實驗所設定之定量指標成分，再次驗證了本研究尋找之定量指標成分 的正確性。
至於，尋找 PMEEE-1-(1~4)、PMEEE-2-1 及 PMEEE-2-2fh 分離部分之 活性成分，仍在分離階段，相信也必定有相當強的活性成分存在。此部分 研究仍在進行中。