藥理試驗方法

壹、溶液的配製

˙PBS 1X ( Phosphate Buffered Saline )

秤取 NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.15 g，KH2PO4 0.2 g 溶於

去離子水中至 1000 ml，過濾，並調整 pH = 7.0 ~ 7.4。

˙NBT solution ( Nitroblue tetrazolium )

秤取 NBT 粉末 20 mg 溶於 20 ml 1×Hanks balanced salt solution 中，最後再加入 PMA 100μg。

˙MTT solution

秤取 MTT 粉末溶於去離子水中使最後濃度為 5 mg / ml。

貳、人類前骨髓性血癌細胞( HL-60 cells )的培養 ¹⁰²

HL-60 cells 培養在溫度 37℃、溼度 95 %、5 % CO2的培養箱中。

並用含有 10 % 胎牛血清( Fetal bovine serum, FBS )、1 % L-glutamine、100 unit / ml Penicillin 和 100 ul / ml Streptomycin 的培養基( RPMI-1640

medium )培養之。期間不定期用 Trypan blue 染色，在顯微鏡下以細胞計 數盤數之，以控制細胞數落在 1~2 ×10⁵ / ml 之間；並確定其存活率約 95

% 左右。而且在每次不同實驗進行之前，細胞至少都要先培養 2~8 天，

以維持細胞生長之穩定度。

參、泰葛粗萃物及化合物的加藥處理( treatment )

泰葛分離化合物用 Dimethyl sulfoxide( DMSO )溶解之；將一系列 不同濃度的藥物儲放在-20℃冰箱內，待加藥時再解凍之。加藥時，DMSO 的濃度需控制在千分之一以下，以避免溶媒 DMSO 本身對 HL-60 cells 的 影響⁷⁵。

肆、泰葛粗萃物及化合物對人類前骨髓性血癌細胞( HL-60 cells )增殖作 用之影響 ^103-104

將 HL-60cells 以 1.5 ×10

1 % L-glutamine、100 unit / ml Penicillin 和 100 ul / ml Streptomycin 的培養 基( RPMI-1640 medium )中；並分別置入 24-wells 培養皿使最後體積為 1ml。每 well 中加入 1μl 的各種不同濃度細胞分化誘導劑。於溫度 37℃、

溼度 95 %、5 % CO2 的培養箱中培養固定時間之後, 分別取出作 MTT-proliferation assay 實驗。

首先自每 well 取出已去除培養基之 50μl 細胞液置入 96-wells plates 中，加入 10μl MTT solution ( 5 mg / ml )於 37℃培養箱中放置 4 小時。接 著用 DMSO( 150 ml / well )溶解細胞膜，最後以 ELASA Reader 於波長 570 nm 的條件下測得 OD570 值。

Proliferation ( % ) = Sample OD570 / Cont. OD570 ×100 %

伍、泰葛粗萃物及化合物對人類前骨髓性血癌細胞( HL-60 cells )分化作 用之影響

Morphology assay ¹⁰⁵

將 HL-60 cells 以 1.5 ×10⁴ / ml 密度培養在含有 10 % 胎牛血清 ( FBS )、1 % L-glutamine、100 unit / ml Penicillin 和 100 ul / ml

Streptomycin 的培養基( RPMI-1640 medium )中；並分別置入 24-wells 培 養皿使最後體積為 1ml。每 well 中加入 1μl 的各種不同濃度細胞分化誘 導劑。於溫度 37℃、溼度 95 %、5 % CO2的培養箱中培養固定時間之後, 分別取出作 Morphology assay 實驗。

首先自每 well 中取出 800μl 細胞液置入 1.5 ml離心管，以轉速 1200 r.p.m 離心 5 分鐘去除上清液；再用 200μl HBSS ( Hanks balanced salt solution )洗之，接著再用轉速 1200 r.p.m 離心 5 分鐘去除上清液。然後取 5μl 細胞液滴至蓋玻片中心待製作細胞抹片，並於室溫下等細胞抹片完 全乾燥後準備染色。在已乾燥的細胞抹片上先滴 0.8 ml Liu A solution 反 應 10 秒鐘，接著再加入 1.5 ml Liu B solution 與 Lius A solution 充分混合 反應 30 秒鐘；直到液面呈現金屬光澤，即可用大量的蒸餾水將染劑沖去。

將細胞抹片於室溫下陰乾再用封片油將染完色的細胞抹片固定；最後於顯 微鏡下觀察其分類並攝影之。

NBT Reduction Assay ¹⁰⁶

將 HL-60 cells 以 1.5 ×10 ⁴ / ml 密度培養在含有 10 % 胎牛血清 ( FBS )、100 unit / ml Penicillin 和 100 ul / ml Streptomycin 的培養基 ( RPMI-1640 medium )中；並分別置入 24-wells 培養皿中使最後體積為 1ml。每 well 中加入 1μl 的各種不同濃度細胞分化劑。於溫度 37℃、溼 度 95 %、5 % CO2的培養箱中培養固定時間之後，分別取出作 NBT reduction assay 實驗。

首先自每 well 中取出 750μl 細胞液置入 1.5 ml 離心管，以轉速 1500 r.p.m 離心 5 分鐘去除上清液；再用 200μl HBSS ( Hanks balanced salt solution )洗之，接著再用轉速 1500 r.p.m 離心 5 分鐘去除上清液。加入 70 μl NBT solution ( 1 mg / ml nitroblue tetrazolium ( NBT ) & 200μl / ml phorbol 12- myristate 13- acetate ( PMA )混和液)，於溫度 37℃的培養箱中 培養 30 分鐘；取出後以轉速 1500 r.p.m 離心 5 分鐘去除上清液；再用 100 μl HBSS 洗之，接著加入 70 % Ethanol 固定細胞，最後於顯微鏡下以細 胞計數盤數之( 細胞數至少要 200 顆 )。

Differentiation ( % ) =細胞質呈紫黑色細胞總數 / 全部的細胞總數 ×100

%

第四節 泰葛組織培養方法