活性成分定量方法 壹、配製標準品

第四節 泰葛組織培養方法 壹、植物組織切片：

泰葛種子置於 1/2MS 培養基，待長成幼苗後(約七天)，將子葉（種 子）、幼莖葉和葉三部分，分別切成約長約置入含有 kinetin 2 ppm 及 Picrolam 1 ppm 的 B5 培養基中，使其誘發產生愈傷組織。

貳、愈傷組織的產生：

子葉（種子）、幼莖葉和葉三部分，在含有 BA 2 ppm 及 Picrolam 1 ppm 的 B5 培養基中，長出愈傷組織之後，一個月繼代至含有 kinetin 1 ppm 及 Picrolam 1 ppm 的 B5 培養基中，不斷地繼代培養，一年後取出愈傷組織 作含量測定。

第五節 活性成分定量方法 壹、配製標準品

（1）Miroestrol

精稱 10mg 的 Miroestrol 標準品，溶於甲醇，配成 10ml 標準品 母液，再稀釋成十倍，分別取 0.1ml、0.05ml、0.025ml、0.0125ml 放

至定量瓶。

（2）Puerarin

精稱 11.16mg 的 Puerarin 標準品，溶於適量甲醇與水，配成 10ml 標準品母液，再稀釋成十倍，分別取 1ml、0.2ml、0.1ml、0.05ml 放 至定量瓶。

（3）Daidzin

精稱 10.5mg 的 Daidzin 標準品，溶於甲醇，配成 10ml 標準品母 液，再稀釋成五倍，分別取 1ml、0.1ml、0.02ml、0.01ml 放至定量瓶。

（4）Genistin

精稱 10mg 的 Genistin 標準品，溶於 70﹪甲醇，配成 10ml 標準 品母液，再稀釋成十倍，分別取 0.2ml、0.1ml、0.025ml、0.0125ml 放至定量瓶。

（5）Daidzein

精稱 10mg 的 Daidzein 標準品，溶於甲醇，配成 10ml 標準品母 液，再稀釋成五十倍，分別取 1ml、0.5ml、0.1ml、0.05ml 放至定量 瓶。

（6）Genistein

精稱 9.75mg 的 Genistein 標準品，溶於甲醇，配成 25ml 標準品 母液，再稀釋成十倍，分別取 1ml、0.5ml、0.1ml、0.05ml 放至定量 瓶。

貳、檢量線之繪製

六種指標成分的各種濃度其檢量液經 HPLC 分析後，所得之 area 數 據（重複三次分析之平均值）進行直線迴歸，繪成檢量線並得迴歸直線之 方程式。

參.中藥材檢品之製備 1.泰葛

a.原生植物（PM）

精稱泰葛乾燥品 10g，以五次甲醇萃取，四次 70﹪甲醇萃取，四次 50﹪甲醇萃取的方式，每次加熱 60℃一小時，乾燥濃縮秤重，取 46.2mg 溶於適量甲醇，放至 10ml 定量瓶，超音波加熱振盪，放冷至室溫，加甲 醇至刻度

b.市場品（PM1）

精稱泰葛市場品 10g，以五次甲醇萃取，四次 70﹪甲醇萃取，四次 50﹪甲醇萃取的方式，每次加熱 60℃一小時，乾燥濃縮秤重，取 31mg 溶於適量甲醇，放至 10ml 定量瓶，超音波加熱振盪，放冷至室溫，加甲 醇至刻度

2.川葛（PL）

a.市場品 1（PL1）

精稱川葛市場品 1 10g，以五次甲醇萃取，四次 70﹪甲醇萃取，四次 50﹪甲醇萃取的方式，每次加熱 60℃一小時，乾燥濃縮秤重，取 28.1mg 溶於適量甲醇，放至 5ml 定量瓶，超音波加熱振盪，放冷至室溫，加甲 醇至刻度

b.市場品 2（PL2）

精稱川葛市場品 2 10g，以五次甲醇萃取，四次 70﹪甲醇萃取，四 次 50﹪甲醇萃取的方式，每次加熱 60℃一小時，乾燥濃縮秤重，取 62.7mg 溶於適量甲醇，放至 10ml 定量瓶，超音波加熱振盪，放冷至室溫，加甲 醇至刻度

c.市場品 3（PL3）

精稱川葛市場品 3 10g，以五次甲醇萃取，四次 70﹪甲醇萃取，四 次 50﹪甲醇萃取的方式，每次加熱 60℃一小時，乾燥濃縮秤重，取 33.3mg 溶於適量甲醇，放至 5ml 定量瓶，超音波加熱振盪，放冷至室溫，加甲 醇至刻度

3.台葛

a.台灣葛根市售品 1（PT）

精稱市售台灣葛根市售品 10g，以五次甲醇萃取，四次 70﹪甲醇萃 取，四次 50﹪甲醇萃取的方式，每次加熱 60℃一小時，乾燥濃縮秤重，

取 32.3mg 溶於適量甲醇，放至 10ml 定量瓶，超音波加熱振盪，放冷至 室溫，加甲醇至刻度

b.台灣葛根市售品 2（PP）

精稱市售台灣葛根 10g，以五次甲醇萃取，四次 70﹪甲醇萃取，四 次 50﹪甲醇萃取的方式，每次加熱 60℃一小時，乾燥濃縮秤重，取 69.2mg 溶於適量甲醇，放至 10ml 定量瓶，超音波加熱振盪，放冷至室 溫，加甲醇至刻度

＊其餘檢品配製步驟以此類推 肆.分析條件之評估

（1）精密度（precision）

精確稱取標準品，以適量甲醇稀釋成四種不同濃度，先進行此四 個樣品之層析並完成直線迴歸，於同日內晨、午、晚及連續六日內之 異日間各進行一次層析，然後以先前獲得的迴歸直線方程式求得每次 的實驗濃度值。以三次同日內和三次異日間分析值分別求取平均值

（mean）、標準差（standard deviation，S.D.）及相對標準差（relative standard deviation，R.S.D.）。

（2）偵測極限（Detection limit）

逐步稀釋標準品溶液，注入偵測，直到 signal/noise＝3/1 以上，

計算注入量及其濃度。

（3）回收率試驗（recovery）

取定過六種指標成分含量的中藥材檢品（泰葛原生植物，泰葛 市場品，市售川葛檢品 1、2、3，台灣葛根市售品，台灣葛根市售品）， 分別加入已知濃度的標準品溶液，混合振盪一分鐘，然後重新層析定 量，所測得之六種指標成分增加量除以已知的標準品添加量即為回收 率。

貳、總黃酮分析方法

1.紫外分光光度法測定波長確定

分別測定葛根素和樣品在甲醇中的紫外吸收光譜圖，結果在 250nm 波長處有最大吸收，且光譜圖基本相同（圖）確定以 250nm 為測定波長

2.配製標準品溶液及製作檢量線

對照標準品溶液配製（濃度為 1mg/50ml、1mg/250ml、1mg/500ml、

1mg/1000ml、1mg/2000ml）

精稱 10mg 的 Puerarin 標準品，溶於甲醇，配成 10ml 標準品母液，

超音波振盪，放冷至室溫，再稀釋成 50 倍、250 倍、500 倍、1000 倍、

2000 倍，分別取放至定量瓶

3.檢量線製作

將各種濃度的對照品其檢量液經紫外分光光度法分析後，所得之吸光 度數值（重複三次分析之平均值）進行直線迴歸，繪成檢量線並得迴歸直 線之方程式。

4.樣品溶液配製

精稱樣品，以五次甲醇萃取，四次 70﹪甲醇萃取，四次 50﹪甲醇萃 取的方式，每次加熱 60℃一小時，乾燥濃縮秤重，取樣品溶於甲醇，放 至定量瓶，超音波加熱振盪，放冷至室溫，加甲醇至刻度

葛根總黃酮含量測定

稱取生藥適當量取量加入甲醇溶解之移至容量瓶中超音波震盪加甲 醇至刻度用甲醇作空白對照在波長測定吸收度，通過紫外光譜可將不同品 種的葛根，根據其峰形、峰位、導數光譜的振幅高度比的不同

5.回收率試驗

將定過含量的中藥材檢品分別加入已知濃度的標準品溶液，混 合振盪一分鐘，然後重新層析定量，所測得之總黃酮增加量除 以已知的對照品添加量即為回收率。

6.精密度試驗

精確稱取標準品，以甲醇稀釋成五種不同濃度，先進行分析並完成直 線迴歸，於同日內每個小時各進行一次層析，然後以先前獲得的迴歸直線 方程式求得每次的實驗濃度值。以三次同日內和三次異日間分析值分別求 取平均值（mean）、標準差（standard deviation，S.D.）及相對標準差

（relativestandard deviation，R.S.D.）