葉位與採收期對葉菜甘藷葉片之總酚含量及DPPH自由基清除能力之影響
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(2) 99. 探討甘藷葉片之抗氧化特性. 膳食纖維、必需脂肪酸等(Huang et al. 2006, Liao et al. 2011)。臺灣葉菜用甘藷台農 71 號 可週年栽培，適合機械採收，且採收期長， 約 2 至 4 週即可開始採收，嫩梢葉質地細柔 適口性佳(Lee et al. 1996, Lai 2007)。 隨著養生風氣的盛行，許多學者乃進行 抗氧化物質之研究，而甘藷莖葉即為一富含 多種生物活性化合物的蔬菜，此類抗氧化物 質在許多研究中更顯示與抗氧化作用呈現正 相關。經食用後可在人體內轉化並維持生理 機能，所以食物中含有的抗氧化物可以直接 被吸收，具有降低人體內自由基氧化傷害的 效果(Kano et al. 2005, Huang et al. 2006, Teow et al. 2007, Carvalho et al. 2010, Johnson and Pace 2010, Liao et al. 2011)。然 而作物在生長發育中有不同表現，研究顯示 葉位對作物的抗氧化物質含量、自由基清除 能力在不同葉位存有差異，如萵苣及茶葉之 報告皆顯示其抗氧化物質含量及活性受到葉 位 及 採收 期影 響 ，且 差異 顯 著 (Chen et al. 2003, Cano and Arnao 2005, Chiu and Lin, 2005, Mamati et al. 2006)。 本試驗主要在探討葉位及採收期對葉菜 用甘藷台農 71 號葉片總酚含量及 DPPH 自由 基清除能力的影響，期供未來決定較佳採收 時間及分級分類之參考。. 材料與方法 一、試驗材料及取樣方法 本試驗以由行政院農業委員會農業試驗 所(以下簡稱‘農試所’)選育之葉菜用甘藷品種 台農 71 號(TNG 71)為試驗材料，春作於 2011 年 4 月種植，秋作則於同年 9 月種植，兩期 作皆栽植於農試所嘉義農業試驗分所之試驗 田區，試區共三塊。栽培及管理採用一般慣 行法，扦插初期灌溉後，視田間土壤濕度進 行適度灌溉，以不超過田間容許量為度。生 長期間不施用肥料，試區之土壤 pH 值介於 4.79~5.05，有機質含量介於 1.83~1.93 %，有 效 性 磷 、 鉀 、 鈣 及 鎂 分 別 介 於 45~55 mg. kg-1、20~27 mg kg-1、488~509 mg kg-1 及 59~63 mg kg-1。種植 4 wk 後採摘一次，經 隔 4 wk 再採摘一次，共採摘 2 次。採集以逢 機方式進行，為完全隨機設計，三重覆。. 二、甘藷葉檢品溶液之製備 分別秤取甘藷不同葉位之葉片鮮重 3 g， 並 加 入 15 mL 80% 甲 醇 (liquid chromatography, Merck)溶液且置於超音波 儀器中震盪 15 min，取上清液離心 30 min， 加速度為 400 g，再取一次上清液以 0.22 μm 微孔過濾膜過濾後，將 80%甲醇萃取液定量 至 5 mL 存於樣品瓶中並儲藏於-20℃冰箱 中。. 三、總酚含量分析 參考 Taga et al. (1984)方法，檢測甘藷葉 片 80%甲醇萃取液之抗氧化物質含量：取 200 μL 甘藷葉片萃取液於抽風櫥內加入 200 μL Folin-Ciocalteus (2N, Merck)，振盪後置於 室溫下作用 5 min，再加入 3 次水稀釋後加入 600 μL 的 20%碳酸鈉(GR, Merck)水溶液，室 溫下靜置 10 min 後再離心 10 min，加速度為 400 g，同時以 gallic acid (HPLC, Fluka)作標 準曲線於波長 730 nm 測吸光值。. 四、DPPH 自由基清除能力試驗 參考 Shimada et al. (1992)方法，檢測甘 藷 葉 片 80% 甲 醇 萃 取 液 對 DPPH ( ≧ 90, Sigma)之清除效率：取 200 μL 甘藷葉片甲醇 萃取液加入 600 μL DPPH 甲醇溶液中，均勻 混 合 30 min 後 ， 同時以 Trolox (≧ 98%, Aldrich)作標準曲線於波長 517 nm 下測吸光 值。. 結果與討論 一、葉位對總酚含量及 DPPH 自由基清 除能力之影響 2011 年葉菜用甘藷春作之葉位總酚含量 變方分析結果如 Table 1，由變方分析結果發 現葉菜甘藷台農 71 號葉位對於總酚含量及.
(3) 100. Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 9, June 2012. DPPH 自由基清除能力均有顯著性影響，而 秋作之葉位總酚含量變方分析結果如 Table 2，亦發現葉位對於總酚含量及 DPPH 自由基 清除能力均有顯著性影響，顯示葉菜用甘藷 無論在春作或秋作，總酚含量及 DPPH 自由 基清除能力皆受不同葉位之顯著影響。 春作葉位間之總酚含量及 DPPH 自由基 清除能力差異顯著性測驗結果如 Table 3，就 春作採收之葉菜用甘藷總酚含量而言，以頂 芽之 54.2 mg gallic acid 100 g-1 最高，其次為 第一葉之 50.4 mg gallic acid 100 g-1，而以第 六葉之 2.40 mg gallic acid 100 g-1 最低，次低 者為第三葉之 3.72 mg gallic acid 100 g-1、第 五葉之 3.79 mg gallic acid 100 g-1、第四葉之 3.88 mg gallic acid 100 g-1 及第二葉之 3.95 mg gallic acid 100 g-1，而此五者與前二者(頂 芽、第一葉)有顯著差異存在。而秋作之總酚. 含量及 DPPH 自由基清除能力差異顯著性測 驗結果如 Table 4，表現相似。 就春作採收之葉菜用甘藷 DPPH 自由基 清除能力而言，以頂芽及第一葉之 118.8 mg Trolox 100 g-1 及 113.7 mg Trolox 100 g-1 最 佳 ，其 次為第 四葉之 61.7 mg Trolox 100 g-1，而以第六葉之 27.8 mg Trolox 100 g-1 最 差，次差者為第五葉之 43.1 mg Trolox 100 g-1、第三葉之 43.6 mg Trolox 100 g-1 及第二 葉之 51.0 mg Trolox 100 g-1，而此五者與前 二者(頂芽、第一葉)有顯著差異存在。而秋作 表現相似。無論在春作或秋作，其最大總酚 含量及最佳 DPPH 清除率皆存於頂芽及第一 葉，與其餘葉位均有顯著差異存在。 葉位之相關研究中，Cano and Arnao (2005)調查三種不同萵苣品種之抗氧化活性 的差異，以及不同葉位(莖部、內葉、中葉、. Table 1. ANOVA of total phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in different leaf positions and harvest times in Spring Crop. MS SOV. DF. Total phenolics. Free radical scavenging. content. activity of DPPH. Leaf position (L). 6. 3416.6***. Harvest time (H). 1. 0.709. 488.4**. LxH. 6. 3.272. 472.9***. Error. 28. Total. 41. 7795.1***. *, ** and *** denote significant at 5%, 1% and 0.1%, respectively. Table 2. ANOVA of total phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in different leaf positions and harvest times in Fall Crop. MS SOV Leaf position (L). DF 6. Harvest time (H). 1. LxH. 6. Error. 28. Total. 41. Total phenolics. Free radical scavenging. content. activity of DPPH. 3892.7*** 4.76 13.07***. *, ** and *** denote significant at 5%, 1% and 0.1%, respectively.. 6069.5*** 5.23 482.9.
(4) 101. 探討甘藷葉片之抗氧化特性. Table 3. Significant tests of differences among leaf positions in total phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in Spring Crop. Leaf position Apical bud 1st leaf 2nd leaf 3rd leaf 4th leaf 5th leaf 6th leaf LSD0.05. Total phenolics content (mg Gallic acid 100 g-1 fw) 54.2a* 50.4b 3.95c 3.72cd 3.88c 3.79cd 2.40d 1.47. Free radical scavenging activity of DPPH (mg Trolox 100 g-1 fw) 118.8a 113.7a 51.0c 43.6c 61.7b 43.1c 27.8d 9.13. * Values with the same letters in each column are not significant difference at P ≦0.05 by LSD test. Table 4. Significant tests of differences among leaf positions in total phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in Fall Crop. Leaf position Apical bud 1st leaf 2nd leaf 3rd leaf 4th leaf 5th leaf 6th leaf LSD0.05. Total phenolics content (mg Gallic acid 100 g-1 fw) 60.4a* 50.3b 5.49c 3.20d 3.40d 3.40d 2.22d 1.78. Free radical scavenging activity of DPPH (mg Trolox 100 g-1 fw) 117.8a 108.1a 61.2b 52.1bc 41.6c 50.5bc 41.9c 12.7. * Values with the same letters in each column are not significant difference at P ≦0.05 by LSD test.. 外葉)間之總酚含量，其結果顯示葉位之脂溶 性抗氧化物質有差異存在，推估其對成熟之 葉有保護作用；而茶葉研究中亦發現抗氧化 成份受不同葉位之影響，Chiu and Lin (2005) 採摘茶樹青心烏龍之一心二葉(幼葉)及第 10 至 15 片完全展開葉(老葉)，以 HPLC 分析茶 多酚(polyphenolic)之含量，指出在青心烏龍 幼葉中含有較高之表沒食子兒茶素及沒食子 酸 酯 (epigallocatechin gallate; EGCG) ； Mamati et al. (2006)指出在小葉種茶樹中之 表沒食子兒茶素(epigallocaechin; EGC)及表 兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate; ECG) 含量隨葉齡增加而下降，而 EGCG 在第一葉 及第二葉含量最高；本試驗結果顯示，無論 春作或秋作，頂芽總酚含量皆為最高，其次 為第一葉，相較之下，下位葉之總酚含量較. 低。推估可能之因素有二：(1)此顯著差異存 在之原因乃是初生之嫩芽及第一葉對環境耐 受性較差，易受栽培環境影響，故植體將酚 類物質累積於此以增加其對環境之耐受性； (2)頂芽及第一葉易受環境刺激，進而誘導酚 類物質合成，隨成熟葉之表皮發育逐漸完全 而使總酚物質逐漸被分解而減少。惟目前尚 無相關之研究，仍有待未來進行試驗以進一 步探討。. 二、 採收期及葉位與採收期交感對總酚 含量及 DPPH 自由基清除能力之影 響 春作葉菜用甘藷不同採收期之總酚含量 變方分析結果如 Table 1，結果顯示採收期對 總酚含量未有顯著影響，然採收期對 DPPH.
(5) 102. Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 9, June 2012. DPPH 自由基清除能力之最佳交感條件為頂 芽之第一次和第二次採收及第一葉之第一次 和第二次採收，再者為第四葉之第一次和第 二次採收、第二葉之第一次和第二次採收及 第三葉之第二次採收，而以第三葉及第五葉 之第一次採收、第六葉之第一次及第二次採 收之 DPPH 自由基清除能力最差。 秋作葉位及採收期之交感對總酚含量及 DPPH 自由基清除能力之差異比較試驗結果 如 Table 7，秋作總酚含量之最佳交感條件為 頂芽之第一次和第二次採收，其次為第一葉. 自由基清除能力則有顯著影響。而葉位與採 收期交感對春作之 DPPH 自由基清除能力 (Table 1)，以及秋作之總酚含量，則有顯著 影響(Table 2)。 春作不同採收期之總酚含量及 DPPH 自 由基清除能力差異顯著性測驗結果如 Table 5，以春作第二次採收之 69.1 mg Trolox 100 g-1 較佳，其次為第一次採收之 62.3 mg Trolox 100 g-1，兩者間有顯著差異存在。春作葉位 及採收期之交感對總酚含量及 DPPH 自由基 清除能力之差異比較試驗結果如 Table 6，. Table 5. Significant tests of differences between harvest time in total phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in Spring Crop. Harvest time 1st harvest time 2nd harvest time LSD0.05. Total phenolics content (mg Gallic acid 100 g-1 fw) 17.3 17.6 ns. Free radical scavenging activity of DPPH (mg Trolox 100 g-1 fw) 62.3b* 69.1a 4.88. * Values with the same letters in each column are not significant difference at P ≦ 0.05 by LSD test. Table 6. Significant tests of differences among leaf position and harvest time combinations in phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in Spring Crop. L x Hx. Total phenolics content (mg Gallic acid 100. g-1. fw). Free radical scavenging activity of DPPH (mg Trolox 100 g-1 fw). Apical bud, lst harvest time. 53.2. 119.0a*. Apical bud, 2nd harvest time. 55.2. 118.6a. 1st leaf, lst harvest time. 51.7. 114.5a. 1st leaf, 2nd harvest time. 49.2. 112.9a. 2nd leaf, lst harvest time. 3.9. 49.0c. 2nd leaf, 2nd harvest time. 4.00. 53.1c. 3rd leaf, lst harvest time. 2.6. 25.8d. 3rd leaf, 2nd harvest time. 4.1. 61.4bc. 4th leaf, lst harvest time. 4.1. 68.9b. 4th leaf, 2nd harvest time. 3.7. 54.5c. 5th leaf, lst harvest time. 3.2. 29.7d. 5th leaf, 2nd harvest time. 4.4. 56.4bc. 6th leaf, lst harvest time. 2.4. 29.0d. 6th leaf, 2nd harvest time. 2.4. 26.6d. LSD0.05. ns. 14.2. * Values with the same letters in each column are not significant difference at P ≦0.05 by LSD test. x L x H: Interaction of leaf position and harvest time..
(6) 103. 探討甘藷葉片之抗氧化特性. Table 7. Significant tests of differences among leaf position and harvest time combinations in phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in Fall Crop. L x Hx. Total phenolics content (mg Gallic acid 100. g-1. fw). Free radical scavenging activity of DPPH(mg Trolox 100 g-1 fw). Apical bud, lst harvest time. 60.6a*. 119.3. Apical bud, 2nd harvest time. 60.3a. 116.2. 1st leaf, lst harvest time. 53.7b. 108.0. 1st leaf, 2nd harvest time. 46.8c. 108.1. 2nd leaf, lst harvest time. 4.1e. 48.6. 2nd leaf, 2nd harvest time. 6.9d. 73.8. 3rd leaf, lst harvest time. 3.4e. 65.9. 3rd leaf, 2nd harvest time. 3.0e. 38.3. 4th leaf, lst harvest time. 3.3e. 33.5. 4th leaf, 2nd harvest time. 3.5e. 36.3. 5th leaf, lst harvest time. 3.5e. 58.6. 5th leaf, 2nd harvest time. 3.3e. 42.4. 6th leaf, lst harvest time. 2.1e. 41.9. 6th leaf, 2nd harvest time. 2.3e. 42.0. LSD0.05. 2.5. ns. * Values with the same letters in each column are not significant difference at P ≦0.05 by LSD test. x L x H: Interaction of leaf position and harvest time.. 之第一次採收，再者為第一葉之第二次採 收、第二葉之第二次採收，其餘葉位皆次之 且無顯著差異。 採收期之相關研究中，Liu et al. (2007) 調查萵苣在不同採收期之總酚含量及其抗氧 化活性，結果顯示其總酚含量與抗氧化活性 皆存在顯著差異，以七月採摘萵苣之總酚含 量及抗氧化活性較九月採摘為佳，學者推估 萵苣之總酚含量及抗氧化活性受到環境之影 響。在茶樹採摘時期及抗氧化成分研究中， 顯示抗氧化成份受不同採摘時期之影響， Chiu and Lin (2005)發 現 在 四 季 中 兒 茶 素 EGCG 變 化 以 秋 冬 季 高 於 春 夏 季 之 含 量 。 Huang et al. (2003)以青心大冇 四季精製茶 為試驗材料，比較不同採收季節兒茶素含量 之變化，以 HPLC 調查茶多元酚之含量，發 現冬茶(110.6 mg g-1)與夏茶(110.4 mg g-1)的 兒茶素含量較高，而秋茶(105.5 mg g-1)及春 茶(99.0 mg g-1)較低。Wu et al. (2007)採摘一. 心二葉茶菁觀察不同採摘季節間兒茶素含量 之變化，發現總兒茶素、EGCG 及 EGC 之含 量變化均以夏季含量顯著低於其他季節。本 試驗之結果僅發現採收期對春作葉菜用甘藷 台農 71 號有顯著影響，且未發現採收期對總 酚含量變化之規律。推估葉菜用甘藷台農 71 號之葉片可能對環境變異較不敏感，然目前 尚無相關之研究可供比較，未來仍須繼續進 一步探討其他葉菜甘藷品種之採收期對總酚 含量之影響。. 三、總酚含量與自由基清除能力之關係 春作葉菜用甘藷之總酚含量與自由基清 除能力之相關分析結果如 Fig. 1，結果顯示總 酚含量與抗氧化能力呈正相關，從圖中可得 知總酚含量愈高者，自由基清除能力愈佳。 相較之下，總酚含量愈低者，自由基清除能 力較弱且不穏定，秋作亦有相似之情形(Fig. 2)。Huang et al. (2006)指出 DPPH 自由基清.
(7) 104. Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 9, June 2012. 除 能 力 與 總 酚 含 量 呈 現 極 顯 著 正 相 關 (r = 0.71**)，而 Padda and Picha (2008)亦指出抗 氧化活性與總酚含量呈現極顯著正相關(r =. 0.98**)，兩項研究中總酚含量的多寡與抗氧 化活性能力之間具有高度相關性，與本試驗 之結果相似(Fig. 1 及 Fig. 2)。. 140 120. Scavenging activity of DPPH radical (mg Trolox 100 g-1). 100 80 60 40 20 0. 0. 10. 20. 30. 40. 50. Total phenolics content (mg Gallic acid 100 g-1). 60. Fig. 1. Correlation between total phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in Spring Crop. 140 120. Scavenging activity of DPPH radical (mg Trolox 100 g-1). 100 80 60 40 20 0. 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Total phenolics content (mg Gallic acid 100 g-1). 70. Fig. 2. Correlation between total phenolics content and free radical scavenging activity of DPPH in Fall Crop..
(8) 105. 探討甘藷葉片之抗氧化特性. 在甘藷葉部抗氧化活性研究中，Huang et al. (2006)和 Liao et al. (2011)提及除了總酚 含量對自由基清除能力有差異之外，水溶性 抗氧化物質、脂溶性抗氧化物質及其他酚酸 衍生物在自由基清除率及機能性皆有差異存 在(Islam et al. 2003, Teow et al. 2007)，且品 種(系)間之抗氧化能力受其他酚類化合物及 胡蘿蔔素含量影響，因此具有不同程度的抗 氧化能力(Teow et al. 2007)。此外，Laura et al. (2004)和 Carvalho et al. (2010)報告中提及葉 片受到強光照射或逆境影響時會啟動合成花 青素等，學者推測光照能激活多酚類化合物 合成基因之表現，使甘藷莖葉在長時間及長 日照處理下，葉片外觀生成紫色斑點，其作 用被視為光保護效應，可協助植物產生抗 性 ， 進 而 適 應 生 長 環 境 (Merzlyak and Chivkunova 2000, Ramirez-Tortosa et al. 2001, Metwally et al. 2003, Albert et al. 2009)。本試驗之結果顯示總酚含量愈高者， 其 DPPH 自由基清除能力愈佳，而下位葉之 DPPH 自由基清除能力變異大之原因推估有 二：(1)下位葉之總酚物質隨表皮發育完善而 逐漸轉化成其他酚酸物質，而不同酚酸間之 抗氧化能力有差異存在；(2)抗氧化物質之極 性可能隨發育時間增加而轉化，進而適應環 境之變異，然本試驗萃取時僅使用 80%甲醇 作為溶劑，未來可針對抗氧化物質之極性變 化加以探討。 許多報告中皆指出蔬菜具有維持人體生 理機能之功效，其中酚類物質是研究最廣泛 的次級代謝物之一。由於其具有天然抗氧化 活性，在許多研究中證實此類物質對人體有 益，具有清除自由基、增強免疫系統、降低 脂質過氧化、抑制低密度膽固醇、消炎、降低 血醣等化學預防作用(chemoprevention)，更 可幫助人體代謝致癌物質或其產物(Chen et al. 2005, Jung et al. 2006, Huang et al. 2007, Chen et al. 2008)。本試驗結果顯示，葉位對 總酚含量及 DPPH 自由基清除能力有顯著影 響，採收期則未對總酚含量有顯著影響，而. 葉位及採收期交感對春作之 DPPH 自由基清 除能力及秋作之總酚含量有顯著影響。未來 隨著科學及生物技術的進步，逐漸釐清酚類 物質的種類、含量、結構、代謝途徑及基因 調控模式，將有助於酚類物質的合成及利 用。又隨著萃取技術之進步，未來可望增加 提取酚類物質之效率與純度並廣泛應用於生 活保健用途。. 引用文獻 Albert NW, DH Lewis, H Zhang, LJ Irving, PE Jameson, KM Davies (2009) Light-induced vegetative anthocyanin pigmentation in Petunia. J. Exp. Bot. 60:2191-2202. Cano A, MB Arnao (2005) Hydrophilic and lipophilic antioxidant activity in different leaves of three lettuce varieties. Intl. J. Food Prop. 8:521-528. Carvalho IS, T Cavaco, LM Carvalho, P Duque (2010) Effect of photoperiod on flavonoid pathway activity in sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] leaves. Food Chem. 118: 384-390. Chen CM, SC Li, YL Lin, CY Hsu, MJ Shieh, JF Liu (2005) Consumption of purple sweet potato leaves modulates human immune response: T-lymphocyte functions, lytic activity of natural killer cell and antibody production. World J. Gastroenterol. 11:5777-5781. Chen CM, YL Lin, CY Chen, CY Hsu, MJ Shieh, JF Liu (2008) Consumption of purple sweet potato leaves decreases lipid peroxidation and DNA damage in humans. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 17: 408-414. Chen, CN, CM Liang, JR Lai, YJ Tsai, JS Tasy, JK Lin (2003) Capillary electrophoretic determination of theanine, caffeine, and catechins in fresh tea leaves and oolong tea and their effects on rat neurossphere adhesion and migration. J. Agric. Food Chem. 51:7495-7503. Chiu FL, JK Lin (2005) HLPC analysis of naturally occurring methylated catachins, 3”- and 4”methyl-epigallocatechin gallate in various fresh tea leaves and commercial teas and their potent inhibitory effects on inducible nitric oxide.
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