國
立
交
通
大
學
奈米科技研究所
碩
碩
碩
碩
士
士
士
士
論
論
論
論
文
文
文
文
渥曼青黴素降低氧化鋅奈米粒子之細胞毒性與細胞外
形之影響
Wortmannin ameliorates Zinc oxide
nanoparticles-induced cytotoxicity and morphological
abnormality in NIH-3T3 cell
研 究 生：邱士紋
學 號：9352514
指導教授：黃國華 副教授
渥曼青黴素降低氧化鋅奈米粒子之細胞毒性與細胞外形之
影響
Wortmannin ameliorates Zinc oxide nanoparticles-induced
cytotoxicity and morphological abnormality in NIH-3T3 cell
研 究 生：邱士紋 Student: Shi-Wen Chiu
指導教授：黃國華 副教授 Advisor：Guewha Steven Huang 國 立 交 通 大 學
奈 米 科 技 研 究 所 碩 士 論 文
A Thesis
Submitted to Institute of Nanotechnology College of Engineering
National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements
for the Degree of Master
in
Institute of Nanotechnology
June 2006
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
i
中文摘要
奈米材料因其優越的電子、發光及催化特性而備受歡迎，但是奈 米級大小的金屬、陶瓷及有機材料似乎也展現出奈米尺度特有的毒 性，奈米級的粒子甚至可能污染環境或是危害人類生命。 本文藉由觀察不同尺寸氧化鋅(ZnO)奈米微粒對於小鼠胚胎纖維 母細胞(NIH-3T3)細胞的死亡率與對細胞 morphology 影響得知氧化鋅 微粒的尺寸與毒性關聯性，並希望在藉由 Wortmannin 作用下，能夠 降低氧化鋅毒性，更進一步希望能使細胞 morphology 恢復正常。ii
英文摘要
Nano-sized materials are often greeted for their extraordinary electronic, light-emitting, and catalytic properties. But their unique physical characteristics raise concerns that nanometer scale of metals, ceramics, and organics could prove uniquely toxic as well. Nano-sized particles could be environmental pollution or even the loss of human life.
In this study, we investigated the cytotoxicity among different size of Zinc Oxide Nanoparticles in Mouse fibroblast cell (NIH-3T3). We found that the viability and morphology of NIH-3T3 cell were affected by incorporation of ZnO nanoparticle. This effect was size and dose-dependent. Application of the cytotoxicity and morphological abnormality of NIH-3T3 cell were by means of Wortmannin.
iii
誌 謝
一路走來遇到很多貴人相助成就現在的我，雖然沒有什麼了不起 的成就，但也要從交大領到碩士學位的證書了。我常有感慨，總覺得 時間在來不及意識到之前即溜走，尤其是在交大這兩年快樂的研究生 活，首先先感謝我的指導老師 黃國華 教授，這兩年在實驗想法、簡 報技巧及閱讀 paper 上給予很大的幫助及指導，更要感謝師母 洪孟 燕 小姐，幾乎是作為我這兩年精神上的導師，不論在待人接物、人 情世故及私人生活上，將她豐富的人生閱歷及精闢的人生見地毫不藏 私的與我分享，使我懂得人必須具備道德勇氣，更使我了解做人處事 的奧秘。當然最重要的不能忘了每個星期師母親手掌廚的愛心下午 餐，師母的手藝不是好吃兩個字可以形容，因為佈滿其中的愛，每個 星期不厭其煩的從竹南趕來，即每次不同的精挑特選素材，才是更讓 人感動的。 這兩年是我求學生涯中最多與同儕接觸的一段時光，包含耀楠學 長、凱明學長、孟德學長、文宏學長、佳慧學姊、維揚、老李、阿虎、 Mouse、大勳、嘉偉、志杰、永昌、禮閣及柯博實驗室的大家，其中 最感謝像小天使一般的耀楠學長，簡直是天上掉下來的禮物，大方提 供無塵室及耗材給我們使用，以及在實驗設計與方法給予深具建設性 的建議，並總在實驗瓶頸時適時給予援助，就有如水滸傳裡的宋濤一iv 般，總是扮演著及時雨的角色。而凱明學長總是駕駛著他的名貴坐駕 不辭辛勞地載著我們到處玩透透及享受美食，並且總在我失落時分享 逆向且正面的想法見解，總讓我耳目一新且精神振奮。孟德學長則是 在電腦問題及購買 3C 產品時給予很大的幫助。 再來就是我實驗上的夥伴陳維揚，這兩年拖著微恙的身軀在實 驗、生活及精神上給予我最大的幫助，感謝他總是容忍我的任性及壞 脾氣，維揚可謂我的星海羅盤，一輩子的朋友。老李、阿虎及 Mouse 在實驗上也給予我們不少的幫助，大勳及柯博實驗室的各位則是在生 活及娛樂上充實了我這兩年的研究生活，希望大家畢業後可以繼續保 持聯絡。碩一的學弟們，尤其是嘉偉，在實驗上也幫了我們不少，畢 業就在不遠的前方，學弟們，加油！ 最後一定要感謝的就是我的家人及我的好友溢芸，感謝我的爸 媽、大姐及二姐在我的求學生涯一直資助我做為我的後盾，使我可以 專心讀書及金錢上不虞匱乏！也要感謝我的超級好朋友溢芸，認識妳 真好，讓我的人生超美妙！ 其實要感激的人多到族繁不及備載，沒辦法一一娓娓道來，總之 我是個受上天眷顧的人，遇到的每個人都是我的貴人，感恩的心永遠 存在我心中，凡走過必留下痕跡，大家不是我生命中的過客，在我心 裡皆留下一道刻痕，久久不散，最後希望大家都幸福快樂。
v
目
錄
中文摘要 i 英文摘要 ii 致謝 iii 目錄 v 圖目錄 vii 一、 緒論 1 1.1 前言 1 1.2 研究動機與目的 2 二、 文獻回顧 4 2.1 奈米毒理學 4 2.2 現行奈米粒子的研究 6 2.2.1. 皮膚對 NP 的吸附和對皮膚的毒性 6 2.2.2 NP 進入飲用水的後果 7 2.2.3 NP 進入生物體肺部對組織影響的研究 8 2.2.4 NP 對環境的影響 8 2.2.5 NP 對心血管.腦神經.呼吸.免疫系統等的研究 9 三、 材料與方法 10 3.1 實驗材料 10 3.1.1 癌細胞株 10 3.1.2 耗材 11 3.1.3 三種氧化鋅粒子 11 3.1.4 氧化鋁、氧化鈦 12 3.2 實驗藥品 12 3.3 實驗儀器 12 3.4 實驗方法 13 3.4.1 纖維母細胞（NIH 3T3）之培養與繼代 13 3.4.2 細胞計數與存活測試 14 3.4.3 透析(dialysis) 16 3.4.4 MTT assay 實驗流程 17 3.4.5 SEM 試片之固定 18 3.5 NIH-3T3 細胞攝入氧化鋅奈米粒子試驗 19 3.5.1 氧化鋅奈米粒子在不同濃度下之 MTT assay 細胞活性測試 19 3.5.2 三管半致死濃度氧化鋅奈米粒子細胞培養液之配製 20
vi 3.5.3 NIH-3T3 攝入三種氧化鋅奈米粒子之 SEM 膠片觀察 21 3.6 Wortmannin 對攝入氧化鋅奈米粒子細胞之實驗 22 3.6.1 Wortmannin 對正常細胞的 SEM 膠片觀察 22 3.6.2 Wortmannin 對改善攝入氧化鋅奈米粒子細胞之 MTT assay 23 3.6.3 Wortmannin 對攝入氧化鋅奈米粒子之 SEM 膠片觀察 24 四、 理論 26 4.1 細胞記數 26 4.2 MTT assay 原理 26 4.3 透析原理 28 4.4 Wortmannin 原理 29 五、 實驗結果 31 5.1 粒徑分析 31 5.2 NIH-3T3 細胞生長週期 34 5.3 攝入氧化鋅奈米粒子 MTT assay 細胞活性測試 35 5.4 Wortmannin 對攝入氧化鋅奈米粒子細胞毒性之影響 38 5.5 Wortmannin 的 SEM 40 六、 結論與未來展望 48 七、 參考文獻 49
vii
圖目錄
圖 2-1 富勒烯分子 5 圖 3-1 200 倍顯微鏡下的小鼠胚胎纖維母細胞 10 圖 3-2 200 倍 SEM 下的小鼠胚胎纖維母細胞 11 圖 3-3 ZnO 三種尺寸奈米粒子 SEM 圖 11 圖 3-4 Al2O3、TiO2的 SEM 12 圖 4-1 MTT 化學結構式 27 圖 4-2 細胞生長曲線 28 圖 4-3 細胞骨架 29 圖 4-4 Wortmannin化學結構式 30 圖 5-1 透析圖 31 圖 5-2 細胞生長曲線 34 圖 5-3 MTT 細胞存活曲線 36 圖 5-4 Wortmannin MTT assay 38 圖 5-5.1 24 小時不同條件下之 SEM 40 圖 5-5.2 24 小時不同條件下之 SEM 41 圖 5-6.1 48 小時不同條件下之 SEM 42 圖 5-6.2 48 小時不同條件下之 SEM 43 圖 5-7.1 72 小時不同條件下之 SEM 44 圖 5-7.2 72 小時不同條件下之 SEM 45 圖 5-8 細胞局部放大圖 461
第一章 序論
1.1 前言 奈米科技是一種多元運用的新興科技，它的觸角廣及化學、光學、 紡織、藥妝、食品等領域，帶來極大商機與利益，因而引起各國政府、 研究人員及企業的熱情參與；不過，它的負面影響亦不容小覷。 目前國內對奈米科學的應用科技抱予相當大的信心，卻鮮少注到 其背後所潛藏的可能危機。直到近幾年科學家開始從事自然界及人合 成的奈米超微粒子之毒理實驗，問題才隱約顯現出來。超微粒子(Ultrafine particles, UFPs)即為奈米粒子(Nanosized
particles, NSPs)，指尺度大小在 100nm 以下任何形狀的粒子，並不以 化學性質來分類。奈米粒子可分為自然產生與人為製造。自然產生在 分散相中呈現不同的粒子 大小；人為奈米粒子在分散相則大小均勻， 後者將因現今奈米科技快速成長而大量增加，如 2003 年三菱公司 (Mitsubishi)在日本設置第一家富勒烯 (fullerene)工廠，目標量產數以 噸計的富勒烯，作為產業與科學方面應用。奈米產品的上市與相關應 用的推廣，將使奈米粒子逐步與人類接觸，如具特殊光學活性的奈米 二氧化鈦，已被利用於清潔消毒劑與皮膚防曬原料。
2 根據最新科學研究顯示：當物質縮小到奈米級尺寸，表面積增大， 暴露於表面及界面的原子數增多，表面位能急速提高，粒子表面的活 性大幅改變，許多新奇獨特的介觀特性(mesoscopic)因而出現，甚至 可能具有毒性；倘這些粒子進入人體，將可能對健康造成損害。 不過，我們應該明辨：絕大多數奈米科技對於健康並沒有新危 害。因為當奈米粒子被固定或蝕刻於大型物體時，不會瀰漫在環境對 人體造成損害；換言之，真正 對人體及環境將造成威脅，而有必立 即加以管制者，僅包括少數會自由活動(free)，飄散或移動於環境中， 經由呼吸或直接穿透皮膚進入人體的奈米粒子而已。 1.2 研究動機與目的 由於近年來奈米科技發展迅速，許多奈米材料問世，但這些材對 於人體細胞影響始終沒有被明確探討，因此希望藉由本實驗能探討於 奈米粒子是否對人體細胞有所傷害以使得從事奈米材料製造的人能 有所預防，另一方面探討對於人體內癌症細胞是否有所影響，以期能 將奈米材料運用於癌症的治療以造福人群。 目前各國對 nanoparticle 的研究都著重在於對生物體細胞毒性 影響機制,而無討論到對於 morphology 的改變，因此這使得我們對於
3
細胞 morphology 是否因奈米粒子的毒性或作用而有所改變產生濃厚
的興趣，為了了解這個現象因此我們利用掃描式電子顯微鏡（scanning
electron microscope, SEM）來當做我們觀察的工具，以期能觀察出細
胞表面微小的變化。而當細胞的 morphology 因奈米粒子毒性而有所
變化或進而產生細胞死亡現象時，我們是否可以利用某種藥物使得細
胞死亡減緩以及使細胞 morphology 恢復正常，這些是我們在這實驗
4
第二章 文獻回顧
2.1 奈米毒理學 奈米毒理學(nanotoxicology)是一門因應而起的新興領域，在國 內，奈米物質以及奈米技術的安全性，對健康的影響等已受到廣泛重 視。它涵蓋了生物技術，奈米技術，化學和物理的學科，既是國際科 學前沿，也是與人類健康和生活環境密切相關的重要社會問題，但目 前大家對奈米技術對健康和環境的影響還了解的很少。圍繞奈米技術 的生物安全性，已開發國家皆已積極展開研究。 在 2004 年，美國 Rice 大學和喬治亞理工學院的研究人員發現 巴克球對人類細胞的毒性與巴克球表面是否黏有其他分子有密切的 關係。這是第一次對巴克球對單個人類細胞的毒性進行研究。研究的 結果可以幫助科學家在實際應用中利用這種材料的毒性。這項研究涉 及奈米 C 60 及由 C 60 分子組成的奈米級聚合體（通常在水中形成） 的富勒烯分子。5 圖 2-1 富勒烯分子 研究人員測試了這兩種材料對兩種人類細胞，肝癌細胞和真皮纖 維原細胞的毒性。結果發現奈米 C 60 對人類真皮細胞的毒性遠大於 C 60 (OH) 24 ，而且表面修飾度越高的分子，毒性越低。研究人員推 測富勒烯分子能殺死細胞是因為它能產生氧化劑氧化細胞膜。他們相 信，表面修飾度較高的 C 60 的 毒性較低是因為它們產生氧化劑的能 力被降低。使半數真皮細胞死亡所需的奈米 C 60 的濃度是 20ppb
(patrs per billion) 。而對 C 3 、 Na +
2-3 [C 60 O 7-9 (OH) 12-15 ] (2-3) -
、 C60
(OH) 24 ，這個數字分別是 10,000ppb 、 40,000ppb 和 >5,000,000
ppb 。（Thomas J Webster et. al.2004）
同年相同一批人又發現水溶性富勒烯細胞毒性在表面的衍生化
6 、等級的劑量，一種 C60 的聚集物-四種物質的最後衍生物，比一些 高水溶性的衍生物還來的毒（C 3 、Na + 2-3 [C60O7-9(OH)12-15] (2-3)-C 60 (OH) 24 ），細胞暴露在富勒烯後都產生細胞膜上的氧化傷害，導致細 胞死亡。他們也發現在含有水溶性富勒烯的四週環境中，可以產生環 氧類的陰離子，也證實含氧自由基會造成細胞膜損害，最後會導致細 胞死亡。這份研究是針對一些需要提高富勒烯毒性 的應用，像是殺 菌劑、治療癌症等等，也可以作為原始富勒烯所產生不當的生物反應 作補救。(Christie M Sayes et. al. 2004)
2005 年 Nancy A. Monteiro-Rivierea 利 用 microwave plasma enhanced chemical vapor deposition system 製成奈米碳管薄膜。之後將 人類表皮角質細胞 (HEK) 個別暴露在 0.1, 0.2, 0.4 mg/ml 的多壁奈 米碳管 (MWCNT) 中 1, 2, 4, 8, 12, 24 48 小時後，使用 transmission electron microscopy 觀察 HEK ，可得知在所有的時間點下 MWCNT 均存在於 HEK 的細胞質的液泡中，並引起了 HEKs 釋放出會引起 發炎反應的細胞分裂素白細胞介素 8 （ proinflammatory cytokine interleukin 8 ）。這些結果明顯指出奈米碳管尚未能有效地發展應用 在生物學上，而在奈米碳管製造過程中的暴露下， MWCNT 有能力 存在於人類表皮細胞中並引起發炎反應。(Nancy A. Monteiro-Riviere et. al. 2005)
2.2 現行奈米粒子的研究
2.2.1.皮膚對 NP 的吸附和對皮膚的毒性
奈 米 微 粒 可 能 會 透 過 皮 膚 吸 收 而 進 入 人 體 ， 主 要 是 奈 米
7 否 會 經 由 皮 膚 吸 收 進 入 人 體 ， 增 加 產 生 氫 氧 自 由 基 (hydroxyl radicals)的 風 險，進 而 導 致 氧 化 與 破 壞 DNA 的 問 題，目 前 仍 具 爭 議。依 據 歐 盟 所 屬 化 妝 品 與 非 食 品 科 學 委 員 會 (SCCNFP) 對 奈 米 防 曬 乳 所 使 用 之 TiO2 的 說 明 是，以 目 前 工 業 界 所 使 用 的 大 小、包 覆 或 沒 包 覆、防 水 或 親 水 性 的 TiO2是 安 全 的，不 過 要 求 在 工 業 界 使 用 奈 米 級 的 TiO2 時 要 進 行 額 外 的 試 驗 以 便 規 範 它 的 安 全 問 題 。 (ETC Group 2003) 2.2.2 NP 進入飲用水的後果 2004年，南方衛理公會大學也首次找到奈米微粒可能給水生物種 造成毒副作用的證據，他們在研究中將九條年幼的黑鱸魚放入容量十 公升的魚缸內，讓其接觸水溶性C６０。C６０是由６０個碳原子組成的 碳同素異形體，呈現為類似微型足球的籠狀結構，這種結構又稱 buckyball，其直徑通常只有人類頭髮的幾千分之一。 研究中黑鱸魚所接觸的 C６０濃度為０.５PPM（１PPM 為百萬分 之一）。四十八小時後對這些魚腦組織樣本的分析發現，它們腦部所 受損傷比處於不含 C６０的清水中的黑鱸魚要嚴重十七倍。損傷主要表 現為脂質的過氧化反應，它能導致脂質分解，削弱細胞膜正常功能。 研究中還發現，接觸 C６０布基球會改變黑鱸魚肝臟部位一些基因的表 達。發現奈米碳巴基球會對魚腦產生大範圍破壞，並會改變黑鱸魚幼
8 苗肝臟細胞的基因。這是人類首次找到奈米微粒可能給水生物種造成 毒 性 副 作 用 的 證 據 ， 在 美 挑 起 新 一 波 奈 米 技 術 利 弊 之 爭 。 (Eva Oberdörster 2004) 2.2.3 NP 進入生物體肺部對組織影響的研究 奈米製程使用大量的奈米微粒，可能造成人體健康的負面影響，報告 中指出研究人員使用多種不同的奈米微粒進行動物毒理實驗，結果顯 示這些奈米微粒對造成肺部紅腫的程度從普通刺激反應到非常嚴 重，甚至會造成心臟血管系統的危害皆有可能。而造成紅腫反應的程 度主要與單位質量的微粒表面積大小成正相關，特別是小於 50 nm 的 奈米微粒。同時這麼小的微粒(10~50 nm)也可能從呼吸道滲出到其它 器官，造成嚴重的傷害。然而還有很多的問題，尚未得到解答，包括 奈米微粒如何對這些器官造成傷害，所以更多的研究須要再進行，才
能了解其中的機制。（Gunter Oberdorster et. al. 2003）
2.2.4 NP 對環境的影響
隨著奈米材料製程的發展，奈米微粒的排放與可能的健康危害，
必須加以探討，未來管制的標準應該以數目濃度為單位。大氣中的微
粒分佈常是三峰分佈，奈米微粒的直徑在 18 nm 附近，32~67%由有
9
害，特別是剛生成的奈米微粒，主要在於高表面積與反應性。可行的
控制技術為奈米纖維過濾技術，帶電纖維過濾技術及加強帶電功能的
靜電除塵器。（Chein H. and Chen D. 2002）
2.2.5 NP 對心血管.腦神經.呼吸.免疫系統等的研究 超細微粒（<0.1µm）在大氣中無所不在而且具有特別的物理化學 性質，因此對人體健康造成潛在危害。為了瞭解超細微粒的潛在健康 風險，我們進行了健康成人的超細微粒（0.04, 0.06, 0.08 and 0.10 µm） 呼吸劑量研究，在正常的呼吸狀況下（置換體積 500 mL 以及呼吸量 250 mL/s），呼吸管道以每 50 ml 為一間隔，總體積 50~500 mL，量 測所吸入超細微粒的沉積量。結果發現，呼吸管道的沉積區域變化相 當大，沉積量最高的區域在於離口腔 150~200 mL 的區域，最高的區 域隨著粒徑減小而往口腔靠近。單位面積的沉積量在肺部前端達到最 高，越深入肺部單位面積的沉積量越低，最高值大約為平均值的 5~7 倍（女性），這個結果顯示，局部區域的高沉積劑量將會是人體健康
10
第三章 材料與方法
3.1 實驗材料
3.1.1. 癌細胞株:小鼠胚胎纖維母細胞 資料表(新竹食品工業研究
所)
Cell Name NIH/3T3
Cell Type Mouse NIH/Swiss embryo, contact-inhibited
Species Mus musculus (mouse) Cell Morphology Fibroblast
Growth property Adherent
Culture Medium 90% Dulbecco's modified Eagle's medium with 4 mM L-glutamine adjusted to
contain 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose + 10% calf serum SubCulture
Procedure
trypsin-EDTA; NOTE: Do not allow the cells to become confluent, subculture once per week.
Freezed Medium 93% culture medium + 7% DMSO
圖3-1 200倍顯微鏡下的小鼠胚胎纖維母細胞(新竹
11
圖3-2 200倍SEM下的小鼠胚胎纖維母細胞
3.1.2 耗材
培養皿、DMEM、胎牛血清(Fetal calf serum) 、抗生素(penicillin) 、
trypsin-EDTA、L -glutamine 、Trypan blue、1×PBS、去離子水
(Deionized water) 、酒精(alcohol )95%
3.1.3 三種尺寸之ZnO奈米粒子:20nm、150nm、700nm (a) (b) (c)
12
3.1.4 Al2O3、TiO2
(a) （b）
圖3-4 （a）Al2O3 （b）TiO2的SEM
3. 2 實驗藥品
戊二醛(Glutaraldehyde) 、細胞軟骨劑( Cytochalasin D)、細胞軟骨劑
(Wortmannin)、 MTT
(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-y]-2,5-dihenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) 、DMSO、 OsO4
3. 3 實驗儀器
高溫滅菌鍋 (Autoclave) 、二氧化碳培養箱(CO2 incubator)、無菌無
塵操作台(Laminar flow) 、桌上型高速離心機、SEM、ELISA reader、
13
3.4 實驗方法
3.4.1纖維母細胞（NIH-3T3）之培養與繼代：
NIH-3T3 細胞培養液配製
1. 配製原則為:
90%DMEM + 10%Calf serum + 1.5 g/L L-glutamine +0.1% penicillin-streptomycin 2. 首先先用 70%酒精清理無菌操作台，再將所需配置的藥品置於操 作台裡。 3. 取一個已經過高壓滅菌鍋滅菌乾淨的 500mL 血清瓶作為培養液的 存取瓶。 4. 先用電動真空抽取器抽 450mL DMEM 至血清瓶中。
5. 再依序加入 50mL Calf serum、10mL L-glutamine 及 5mL penicillin
至血清瓶中。 6. 以上即完成所需的細胞培養液，並將血清瓶保存在 4℃下。 細胞培養 將纖維母細胞養於T-25 flask 中，加入15mL細胞培養液，置入 37℃ ， 5 ﹪ CO2 培養箱（incubator） 中培養， 以倒立式顯微鏡 觀察其生長情形，每隔三天換一次培養基。若發現細胞太滿的時候就 要繼代，以免細胞死亡。當細胞生長量達八成時即可繼代分盤。 細胞繼代
14
1.準備trypsin-EDTA 及culture medium
2.利用電動吸取器將 T-25 flask 中的舊medium吸起丟棄，再於flask 中加入2c.c. trypsin-EDTA。 3.置入37℃ ，5 ﹪ CO2 培養箱（ incubator ） 中等五分鐘。 4.當細胞都脫落成圓形時再加入大約5mL medium 的量到flask 中沖 一沖，再吸到15 c.c.離心管中，再放入離心機中用1000rpm 旋轉5 分鐘，須注意細胞是否全部沉澱。若離心不夠，可以再離心一次。 5.將15c.c.離心管取出，噴70%酒精再放入無菌操作檯中，將上清液 完全吸乾，不可吸到細胞。
6.吸取3-5c.c. culture medium 加入離心管，再利用pipette將細胞均勻
打散。 7.把所得細胞適量的分到數個新 flask 繼續培養。 3.4.2 細胞計數與存活測試 血球計數盤一般有二個 chambers，每個 chamber 中細刻九個 1mm2 大正方形，其中四個角落之正方形再細刻十六個小格，深度均為 0.1mm。當 chamber 上方蓋上蓋玻片後，每個大正方形之體積為 1mm2 x 0.1mm=1.0 x10-4mL。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘 以稀釋倍數，再乘以 104，即為每 mL 中之細胞數目。
15
材料：
1. 0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2. 血球計數盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip)
3. 計數器 (counter)
4. 低倍倒立顯微鏡
5. 血球計數盤（counting chamber）
步驟：
1.剪一小片 parafilm，約 1.5cm×5cm
2.以 pipette 吸取各 10µL 細胞懸浮液及 0.4 % trypan blue，並分別
滴於 parafilm 上面，以 pipetting 方式將其均勻混合。 3.取 10µL 混合液自血球計數盤 chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻 片，於一百倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍 色。 4.計數四個大方格之細胞總數，再除 4，乘以稀釋倍數﹙至少乘以 2，因與 trypan blue 等體積混合﹚，最後乘以 104，即為每 mL 中 細胞懸浮液之細胞數。若細胞位於線上，只計上線與右線之細胞
16 ﹙或計下線與左線之細胞﹚。 四大格*細胞總數 x 2 x 104 / 4= 細胞數/mL *每一大格的體積 = 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 mL 3.4.3 透析(dialysis) 實驗藥品
EDTA、 NaHCO3、DMEM、三種尺寸的 ZnO 奈米粒子
實驗材料
1. 透析膜、透析夾、去離子水(Deionized water) 、燒杯、磁石、夾子、 剪刀、pipette
實驗儀器
Water bath、Hot plate、電子天秤 實驗步驟 1. 用電子天秤秤量所需的 EDTA 及 NaHCO3 重量溶於去離子水中。 2. 將燒杯中含有藥品 EDTA 1mM 及 NaHCO3 2%(w/w)的去離子水放 在 hot plate 上，放入磁石調整轉數指標為五，使兩種藥品加速均 勻溶解在水中。 3. 剪一段實驗所需的透析膜長度，用夾子將其置於已均勻溶解 EDTA 1mM 及 NaHCO3 2%(w/w)的去離子水燒杯中。 4. 將燒杯置於設定溫度為 60℃的 Water bath 中四小時。 5. 取出透析膜置於另一個裝了乾淨去離子水的燒杯中，用 hot plate 將其煮沸 2～3 分鐘。 6. 用剪刀將透析膜均分三份，每份都先用透析夾夾緊一端開口，再 將溶有 ZnO 奈米粒子的 DMEM 注入其中後，再用夾子夾緊另一 端開口。
17
7. 將夾有 ZnO 奈米粒子 DMEM 溶液的透析膜置於體積比為 1:200 的 純 DMEM 溶液的燒杯中四小時，此動作重複兩次。
8. 最後將夾有三種 ZnO 奈米粒子 DMEM 溶液的透析膜用 pipette 吸 出分別排至於三管 50c.c.離心管中，即完成透析。 9. 最後我們完成的三管 ZnO 奈米粒子原液濃度皆為 10-3g/mL。 3.4.4 MTT assay實驗流程 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)配製 將MTT(Sigma M5655)100mg黃色粉末溶在20c.c.的去離子水中，形成 5mg/c.c.的MTT淡黃色透明溶液以待備用，避光並保存於4℃。
1.於96-well culture plate中加入含1×106/well細胞數的細胞培養液2 00µL 。 2.培養24hr之後除了control組之外其餘well中的medium改為 含奈米粒子之培養液。 3.當取樣時間到時，於每 well 加入 5vol％的 MTT 即 20µL （時間未到者不用加）。 4.再放入培養箱等待四小時，將 well 中所有液體抽乾，於每 well 中
再加入 200µL DMSO，與 well 中的藍紫色沉澱物用 pipette 吸排將
其混合均勻呈透明藍紫色混合液。
5.再將 well 中藍紫色 DMSO 混合液抽到另一盤 96-well culture plate
18
6.將含這些混合液的96-well culture plate在570nm下以ELISA Reader
讀取OD吸光值。
3.4.5 SEM 試片之固定（Ajay Kumar Gupta et. al. 2003）
1.將細胞長在置有 SEM 觀測膠片(13mm glass coverslips) 的 24- well
culture plate 上。
2.自培養箱取出24- well culture plate，放入無菌操作檯中，將預觀測
的SEM膠片用鑷子transfer至另一個全新的24- well culture plate。
3.加入含有1.5% glutaraldehyde的前固定液中固定三十分鐘。 4.經過三十分鐘固定後將前固定液suction乾淨，用PBS wash三次，每 次五分鐘。 5.加入含有2% OsO4的後固定液中固定三十分鐘。 6.同上step 4。 7.依序以不同酒精濃度20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%至100%的無水酒精來進行脫水動作，每次五分鐘。 8.將100%的無水酒精suction掉後，加入hexamethyldisilazane (HMDS) 放置於通風櫥進行最後一道脫水反應，使其自然乾燥。 Note:以上任一步驟務必使液體蓋滿整個膠片。
19 9.乾燥完後貼在載台上，進行鍍白金。 10.利用掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察sample。 3.5 NIH-3T3細胞攝入氧化鋅奈米粒子之實驗 3.5.1 三種氧化鋅奈米粒子在不同濃度下之MTT assay細胞活性測試 1. 先以trypsin-EDTA作用收集細胞液，待離心後吸乾上清液，將沉澱 的細胞與細胞培養液混合均勻，以trypan blue及血球計數盤計算細 胞數目。
2. 在96-well culture plate中加入含1×106/well細胞數的細胞培養液 200µL培養24小時。 3. 二十四小時後，除了控制組的細胞培養液之外，從三種氧化鋅奈 米粒子之1000ppm原液中抽取固定的12個濃度為實驗組，其濃度順 序為:5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60及70ppm，控制組 及實驗組皆為8重覆，取樣時間皆為12、24、48及72小時。 4. 到達取樣時間時，於每 well 加入 20µL 的 MTT，再放入培養箱等 待四小時，之後將 well 中所有液體抽乾，於每 well 中再加入 200µL
DMSO，與 well 中的藍紫色沉澱物用 pipette 吸排將其混合均勻呈
透明藍紫色混合液。
5. 再將 well 中藍紫色 DMSO 混合液抽到另一盤 96-well culture plate
20 Reader 讀取 OD 吸光值。 3.5.2 三管半致死濃度氧化鋅奈米粒子細胞培養液之配製 1. 首先先由 MTT assay 細胞活性測試中分別找出添加三種氧化鋅奈 米粒子後細胞的半致死劑量濃度，半致死劑量濃度各為:20nm 氧化 鋅奈米粒子為 9ppm，150nm 的為 12ppm，700nm 的為 16ppm。 2. 先將無菌操作台用 70%酒精清理乾淨，再放入細胞培養液及三管 新的 50c.c.離心管及三管奈米粒子濃度皆為 1000ppm 的原液。 3. 用電動真空抽取器先抽一些細胞培養液至一 50c.c.離心管中。 4. 再從 20nm 的氧化鋅奈米粒子原液抽取 45µL 至離心管，再補細胞 培養液使總體積為 50c.c.，即完成含有 20nm 氧化鋅奈米粒子之半 致死劑量濃度的細胞培養液。 5. 用相同方法，從 150nm 的氧化鋅奈米粒子原液抽取 60µL 至離心 管，再補細胞培養液使總體積為 50c.c.，即完成含有 150nm 氧化 鋅奈米粒子之半致死劑量濃度的細胞培養液。 6. 用相同方法，從 700nm 的氧化鋅奈米粒子原液抽取 80µL 至離心 管，再補細胞培養液使總體積為 50c.c.，即完成含有 700nm 氧化 鋅奈米粒子之半致死劑量濃度的細胞培養液。
21 3.5.3 NIH-3T3 攝入三種氧化鋅奈米粒子之 SEM 膠片觀察 1. 取出八分滿盤之細胞，吸除培養液，加入1mL trypsin-EDTA 37℃ 下作用五分鐘，收集細胞液，當細胞都脫落成圓形時再加入大約 5mL medium 的量到flask 中沖一沖，再吸到15 c.c.離心管中，再 放入離心機中用1000rpm 旋轉五分鐘(須注意細胞是否全部沉 澱。若離心不夠，可以再離心一次)。 2. 取出15 c.c.離心管，稀釋倍數並利用trypan blue及血球計數盤計算 細胞數目。
3. 放置SEM膠片(13mm glass coverslips)於欲觀察的24-well culture
plate上，依照5×105/well 濃度將所收集的細胞液分至24-well culture plate，加入NIH-3T3細胞培養液1mL(含10% calf seurm)，先
置於37℃、5% CO2 培養箱中培養24小時。 4. 因取樣時間為24、48及72小時，故24小時後，除留下一組控制組 之外，將其餘well中的培養液全部吸除掉，分別置換上含有三種氧 化鋅奈米粒子的半致死劑量濃度的細胞培養液1mL，即20nm的氧 化鋅奈米粒子濃度為9ppm，150nm的為12ppm，700nm的為16ppm。 5. 分別依取樣時間於24、48及72小時後，做SEM膠片取樣做細胞固 定。
22 3.6 Wortmannin對攝入氧化鋅奈米粒子細胞之實驗 Wortmannin的配製 將1mg的Wortmannin白色粉末溶在40µL DMSO溶液中，形成濃度為 2.5×10-2g/mL的原液，用錫箔紙包起來避光並保存在-20℃。 3.6.1 Wortmannin對正常細胞的SEM膠片觀察 1.先以trypsin-EDTA作用收集細胞液，待離心後吸乾上清液，將沉澱 的細胞與細胞培養液混合均勻，以trypan blue及血球計數盤計算細 胞數目。
2.放置SEM膠片(13mm glass coverslips)於欲觀察的24-well culture
plate上，依照5×105/well 細胞數濃度將所收集的細胞液分至24-well culture plate，加入NIH-3T3細胞培養液1mL(含10% calf seurm)，先
置於37℃、5% CO2 培養箱中培養24小時。 3. 抽取Wortmannin原液用DMEM溶液稀釋成3×10-8g/mL的細胞培養 液以待備用(需避光) 。 4. 24小時後，除控制組之外，將其餘well中的培養液全部吸除掉，全 置換上含有3×10-8g/mL的Wortmannin之細胞培養液1mL。 5.分別依取樣時間於24、48及72小時後，做SEM膠片取樣之細胞固定。
23
3.6.2 Wortmannin對改善攝入氧化鋅奈米粒子細胞之MTT assay 測試
1.先以trypsin-EDTA作用收集細胞液，待離心後吸乾上清液，將沉澱
的細胞與細胞培養液混合均勻，以trypan blue及血球計數盤計算細
胞數目。
2.在96-well culture plate中加入含1×106/well細胞數的細胞培養液 200µL培養24小時。
3. 抽取Wortmannin原液用DMEM溶液稀釋成3×10-8g/mL的細胞培養 液，及分別含有3×10-8g/mL之Wortmannin和三種奈米粒子的半致 死劑量濃度的三管細胞培養液以待備用(以上四管皆需避光) 。 （Anke Di et. al. 2003）
4. 24小時後，除了控制組的細胞培養液之外，將所有實驗組well的細 胞培養液抽乾，皆添加200µL的Wortmannin細胞培養液。 5. 30分鐘後，除了控制組的細胞培養液之外，將所有實驗組well的細 胞培養液抽乾，分別添加含有3×10-8g/mL之Wortmannin和三種奈米 粒子的半致死劑量濃度的三管細胞培養液200µL，控制組及實驗組 皆為12重覆，取樣時間皆為12、24、48及72小時。 6. 到達取樣時間時，於每 well 加入 20µL 的 MTT，再放入培養箱等 待 4 小時，之後將 well 中所有液體抽乾，於每 well 中再加入 200µL
DMSO，與 well 中的藍紫色沉澱物用 pipette 吸排將其混合均勻呈
24
7. 再將 well 中藍紫色 DMSO 混合液抽到另一盤 96-well culture plate
中，將含這些混合液的 96-well culture plate 在 570nm 下以 ELISA
Reader 讀取 OD 吸光值。
3.6.3 Wortmannin 對攝入氧化鋅奈米粒子之 SEM 膠片觀察
1.先以trypsin-EDTA作用收集細胞液，待離心後吸乾上清液，將沉澱
的細胞與細胞培養液混合均勻，以trypan blue及血球計數盤計算細
胞數目
2.放置SEM膠片(13mm glass coverslips)於欲觀察的24-well culture
plate上，依照5×105/well 細胞數濃度將所收集的細胞液分至24-well culture plate，加入NIH-3T3細胞培養液1mL(含10% calf seurm)，先
置於37℃、5% CO2 培養箱中培養24小時。 3. 抽取Wortmannin原液用DMEM溶液稀釋成3×10-8g/mL的細胞培養 液，及分別含有3×10-8g/mL之Wortmannin和三種耐米粒子的半致 死劑量濃度的三管細胞培養液以待備用(以上四管皆需避光) 。 4. 24小時後，除了控制組的細胞培養液之外，將所有實驗組well的細 胞培養液抽乾，皆添加1mL的Wortmannin細胞培養液。 5. 30分鐘後，除控制組之外，將其餘well中的培養液全部吸除掉，分
25
別置換成含有3×10-8g/mL之Wortmannin和三種耐米粒子的半致死 劑量濃度的三管細胞培養液1mL。
26
第四章 理論
4. 1 細胞記數目的：利用血球計數盤，測量培養中的活細胞數目。
原理：
Trypan Blue 是一種常被使用於細胞染色的染料。Trypan Blue 無
法穿透活細胞的細胞膜，但是當細胞受傷或死亡，細胞膜破損時， Trypan Blue 則可以滲入細胞膜進入細胞內，使細胞染成藍色。利用 此一特點，配合血球計數盤的使用，則可以在顯微鏡底下，分辨出細 胞樣本中的活細胞與死細胞，以方便細胞計數。 4. 2 MTT assay 原理 四唑鹽比色試驗(MTT)是一種檢測細胞存活和生長的方法。這種 方法靈敏度高、重複性好、無放射性污染等，所以常用於細胞活力的 檢測。此法的主要原理是︰MTT 為黃色化合物，是一種接受氫離子 的染料由於活細胞線粒體中的脫氫酵素(dehydrogenase) 將 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 之 tetrazolium環切斷，藍色沉澱物formazan 形成，顏色由淡黃色轉為難 溶的深藍紫色結晶物，並沈積在細胞中，而死細胞粒腺體不含脫氫酵 素，所以MTT 顏色並不會產生變化，仍為淡黃色。
27 圖4-1 MTT化學結構式 去培養液後二甲基亞(DMSO)能溶解細胞中的紫色結晶物，並用聯免 疫檢測，以multiscan reader(ELISA) 讀取波長570 nm 之吸收值，可間 接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內，MTT結晶物形成的量與細 胞數成正比。此法已廣泛用於一些生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤 藥物的篩選、細胞毒性試驗和腫瘤放射敏感性的測定等。用此法測細 胞活力，為保證結果的準確性，最好在試驗前測定每種細胞的貼壁 率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，再確定每孔細 胞接種數和培養時間，以保證培養終止時不至過滿。另外，試驗時應 設空白對照，比色時，以空白孔調零。MTT測定所得數據在扣除背景 值後，結果可繪製成圖表，下方圖X軸為樣品的稀釋倍數由低到高排 列，即樣品濃度由高到低。Y軸則為細胞生理活性效應，一般為吸光 值。圖例為典型的細胞增生或抗病毒化合物劑量反應曲線，呈下降型 曲線。相反地，如果是測定抑制細胞增生、或是細胞殺傷效應，則反 應曲線為上昇型。從此一量效依賴曲線研究人員可定出50%有效劑量
28 （ED50） 圖 4-2 細胞生長曲線 計算公式如下 4. 3 透析原理 透析是指溶質從半透膜的一側透過膜至另一側的過程，任何天然 的(如腹膜)或人造的半透膜，只要該膜含有使一定大小的溶質透過的 孔徑，那這些溶質就可以透過彌散和對流從膜的一側移動到膜的另一 側。例如腹膜透析是指人體內的“毒物”包括代謝產物、藥物、外源性 毒物，只要其原子量或分子量大小適當，就能夠透過透析清除出體 外。其基本原理是彌散和對流。彌散就是半透膜兩側液體各自所含溶 質濃度梯度及它 所形成的不同滲透濃度，溶質從濃度高的一側透過 半透膜向濃度低的一側移動。對流也稱超濾，是指溶質和溶劑因透析
29 膜兩側的靜水壓和滲透壓梯度的不同而跨膜轉運的過程。 4. 4 Wortmannin原理 細胞中含有細胞骨架，這是由由三種纖維構成，其粗細不同。 最粗的為微管（Microtubule）直徑介於兩者之間的是中間絲 （intermediate filament）最細的為微絲（Microfilament） 圖 4-3 細胞骨架 細胞骨架的功能如下： 1. 維持細胞形狀：如紅血球和神經細胞的特殊形狀。
30 2. 改變細胞形狀：由於組成細胞骨架的蛋白質分子可以重新組合， 因此可以改變細胞形狀。 3. 使細胞具運動能力：組成鞭毛、纖毛，並可延伸至偽足內。 4. 使胞器能在細胞質內移動：胞器會延細胞骨架所提供的軌道，移 動到目的地。 Wortmannin 是一種真菌的代謝物，它具有穿透細胞的能力，並且
對 PI3 kinase 是一種不可逆的抑制劑。PI3 kinase 是細胞內與脂質訊息 傳遞有關的酵素，它參與許多和細胞生成、轉形、分化、存活及胰島 素作用有關的調控。他阻擋了 PI3 kinase 的催化活性，並且不會影響 到上游信號，例如﹕胰島素受器的 tyrosin kinase 的活性。Wortmannin 也具備抑制 myosin light chain kinase 以及 PI4 kinase 活性的能力。此 狀況下 Wortmannin 的濃度約需一百倍於抑制 PI3 kinase 所需的濃度。
（Edward H. Walker et. al. 2000）
31
第五章 實驗結果
5.1 粒徑分析 奈米粒子在培養液內間彼此會互相聚集因此粒徑會遠大於理論 值，又因為合成的奈米粒子表面會有許多不必要化學成分，因此藉由 透析可以使得附著於奈米粒子表面不必要的成分藉由透析而析出因 此透析前後奈米粒子尺寸會有不同，由圖可知透析前 20nm 粒徑約 180nm 左右而透析後降為 90nm 左右；透析前 150nm 粒徑約 500nm 左右而透析後降為 190nm 左右；同樣的 700nm 透析前約 2500nm 而 透析後約 2000nm。（a）20nm 透析前 （b）20nm 透析後
32
（c）150nm 透析前 （d）150nm 透析後
33
（g）透析前與透析後粒徑比較
圖 5-1（a）20nm 透析前（b）20nm 透析後（c）150nm 透析前
（d）150nm 透析後（e）700nm 透析前（f）700nm 透析後
34
5.2 NIH-3T3 細胞生長週期
圖 5-2 細胞存活曲線
由細胞生長曲線我們可以發現正常細胞於 96 小時時達生長頂 峰，當 96 小時以後細胞慢慢地逐漸凋亡，是因為細胞培養液的顏色 由原來的深粉紅色慢慢變成黃橘色，表示培養液養份已經逐漸消耗完 畢，而細胞產生過量代謝產物累積對細胞體產生毒害作用，使得細胞 凋亡速度加快，所以一般細胞培養通常在第三天也就是 72 小時左右 就必須重新分盤加入新的培養液，使得細胞有足夠生長空間與充足的 養分來成長。35 5.3 攝入氧化鋅奈米粒子MTT assay細胞活性測試 三種氧化鋅奈米粒子在不同濃度下之細胞活性測試 在本實驗中，我們分別對三種尺寸的奈米粒子做不同時間及不同 濃度下對細胞活性的影響，由下圖的結果可知，低濃度劑量(～<9ppm) 的奈米粒子對細胞活性沒有產生任何毒性而使細胞凋亡，而半致死劑 量濃度(LC50)在四個實驗時間點皆介於9～18ppm之間，超過半致死 劑量濃度(20ppm)則幾乎全部因奈米粒子的毒性而凋亡。我們也發現 隨著奈米粒子作用時間的增加，半致死劑量有往左位移的趨勢，即細 胞數量隨著粒子作用時間的增加逐漸凋亡減少，因此僅需較小的粒子 濃度即可達到半致死劑量。此外我們也發現奈米粒子的尺寸越小，對 細胞的毒性越大，應該是因為粒子越小，表面活性越大的關係所導致。
36
（a）12 小時
37
（c）48 小時
（d）72 小時
圖 5-3（a）12 小時 （b）24 小時 （c）48 小時（d）72
小時 MTT 細胞存活曲線
38
5.4 Wortmannin 對攝入半致死濃度氧化鋅奈米粒子細胞毒性之影響
（a）20nm
39
（c）700nm
圖 5-4 Wortmannin MTT assay （a）20nm（b）150nm
（c）700nm 氧化鋅奈米粒子
由
Wortmannin 的 MTT 測試我們可以發現在 24 小時內， Wortmannin 對於三種尺寸的奈米粒子對細胞所造成的毒性皆有一 定的減緩作用。由圖 5-4（a）、（b）可以發現攝入 20nm 及 150nm 的奈米粒子在 72 小時的全程實驗時間中，有加入 Wortmannin 的 細胞存活率很明顯的高於只有氧化鋅奈米粒子之細胞。而圖 5-4 （c）則是在 24 小時內有較少的減緩作用，但是在 48 小時以後可 以發現加入 Wortmannin 的細胞存活率反而低於單純只加奈米粒子 的存活率，對於這種情形我們推測有可能是於 24 小時內攝入 700nm 的奈米粒子之 Wortmannin 已經被細胞吸收作用殆盡，所以40 療效減低並且由於 Wortmannin 本身亦有一定的細胞毒性，在此時 因為療效已消失且 Wortmannin 的毒性亦顯現出來，再加上奈米粒 子的毒性雙重作用下使得細胞存活率比只有攝入奈米粒子的細胞 還要低。 5. 5 Wortmannin 的 SEM (a) (b) (c) (d) 圖 5-5.1 24 小時之 SEM(a)正常 (b)只添加 Wortmannin(c) 、(d)分為攝 入 20nm 氧化鋅及再添加 Wortmannin 的細胞
41 (a) (b)
(c) (d)
圖 5-5.2 24 小時之 SEM(a)、(c)分別攝入 150nm 及 700nm (b)Wortmannin+150nm 、(d) Wortmannin+700nm 氧化鋅的細胞
42 (a) (b)
(c) (d)
圖 5-6.1 48 小時之 SEM(a)正常 (b)只添加 Wortmannin(c) 、(d)分為 攝入 20nm 氧化鋅及再添加 Wortmannin 的細胞
43 (a) (b)
(c) (d)
圖 5-6.2 48 小時之 SEM(a)、(c)分別攝入 150nm 及 700nm (b)Wortmannin+150nm 、(d) Wortmannin+700nm 氧化鋅的細胞
44 (a) (b)
(c) (d)
圖 5-7.1 72 小時之 SEM(a)正常 (b)只添加 Wortmannin(c) 、(d)分為 攝入 20nm 氧化鋅及再添加 Wortmannin 的細胞
45 (a) (b)
(c) (d)
圖 5-7.2 72 小時之 SEM(a)、(c)分別攝入 150nm 及 700nm (b)Wortmannin+150nm 、(d) Wortmannin+700nm 氧化鋅的細胞
46 藉由以上圖 5-5、圖 5-6 及圖 5-7 細胞的 SEM 圖，我們可以明顯 發現無論是 20nm、150nm 或是 700nm 的氧化鋅奈米粒子均會使得 細胞的 morphology 產生改變，尤其 48 小時的 SEM 圖 5-6.1(c)及圖 5-6.2(a)、(c)可以很明顯的看出細胞培養液中加入奈米粒子時(圖 5-8)，細胞會產生圓形的類似 Endocytosis 或是 Exocytosis 的現象。 (a) (b) (c) 這些圓形的類似腫瘤的外型平均直徑大約數 µm，這個大小遠大 於我們所使用的奈米粒子直徑，因此我們推論這個東西不是奈米粒 子，而有可能是奈米粒子對於細胞造成的毒性而使 morphology 產生 改變，亦有可能是細胞的 Endocytosis 或是 Exocytosis，但是目前我 圖 5-8（a）20nm ZnO 中細胞局部 放大（b）150nm ZnO 中細胞局部 放大（c）700nm ZnO 中細胞局部 放大
47 們尚無法確認。而除了這種細胞上特殊形貌的發生之外，我們也發現 細胞周圍的延伸觸角也消失了，細胞與細胞之間幾乎毫無空隙的緊密 連接，細胞也變的較為扁平，幾乎可說是看不到細胞了，我們推測可 能是添加了奈米粒子使細胞骨架產生改變，甚至是導致了細胞凋亡 (apoptosis) ，這與我們的 MTT assay 結果是相符的。 而由圖 5-5.1(d)、5-5.2(b) 、(d) 、圖 5-6.1(d) 、圖 5-6.2(b) 、(d) 、 圖 5-7.1(d) 及圖 5-7.1(b) 、(d)均可發現當含奈米粒子的細胞培養液添 加 Wortmannin 時，可以發現原先細胞表面的圓形 morphology 消失 了，有些細胞甚至恢復了較接近原先正常的 morphology，由此我們可 知 Wortmannin 對於奈米粒子毒性有改善的效果，這個現象的原理是 以後所必須探討的，而若培養液中只有 Wortmannin 而無奈米粒子 時，也可以發現細胞的 morphology 圖 5-5.1(b) 、圖 5-6.1(b) 及圖 5-7.1(b) 也 是 有 相 當 程 度 的 改 變 ， 這 亦 可 證 實 我 們 之 前 所 說 的 Wortmannin 也是有細胞毒性的。
48
第六章 結論與未來展望
結論
1. 同種奈米粒子,相同濃度下,尺寸越小,毒性越大。
2. 加入氧化鋅奈米粒子後,細胞形貌產生特殊的變化。
3. 渥曼青黴素在 24 小時內可改善氧化鋅奈米粒子的
毒性解救細胞,且可使特殊的形貌消失。
未來展望
目前各界對於氧化鋅奈米粒子的研究大多著重於其光學特性,例 如應用在光觸媒、太陽能電池及防曬隔離乳液上, 較少討論其攝入至 人體的一些毒化反應,而我們證實了氧化鋅奈米粒子具細胞毒性,且 會改變細胞的形貌,但關於其對細胞的毒理分子機制作用了解甚少。 希望未來的學弟妹們可以解決我們尚未解開的謎團,不只是氧化 鋅,甚至是其他的奈米粒子,建立一套奈米粒子對細胞作用的完整分 子機制,成為實驗室重要的智慧財產。49
第七章 參考文獻
1. Thomas J Webster ,Michael C Waid “Nano-biotechnology：carbon nanofibres as improved neural and orthopaedic implants” ,Nanotechnology,15,pp. 48-54,2004.
2. Christie M Sayes, Joun D. Fortner, Wenh Guo, Delina Lyon, Adina M. Boyd, Kevin D. Ausman, Yizhi J, Tao Balaji Sitharaman, Lon J. Wilson, Joseph B. Hughes, Jennifer L. West, and Vicki L. Colvin,“The differential Cytotoxicity of Water-soluble Fullerenes ” ,Nano Letters, 4, pp. 1881-1887, 2004.
3. Nancy A. Monteiro-Riviere, Robert J. Nemanich, Alfred O. Inman , Yunyu Y. Wang , Jim E. Riviere ,“Multi-walled carbon nanotube interactions with human epidermal keratinocytes”, Toxicology Letters, 155,pp. 377-384 , March 2005.
4. ETC Group,“No Small Matter II: The Case for a Global Moratorium:Size Matters!” , Occasional Paper Series, 7, pp. 1-14, April 2003.
5. Eva Oberdörster,“Manufactured Nanomaterials (Fullerenes, C60) Induce Oxidative Stressin the Brain of Juvenile Largemouth Bass”, Environmental Health Perspectives, 112 , pp. 1058-1062 , July 2004.
6. Gunter Oberdorster, “Effects and fate of inhaled ultrafine particles” ,
Nanotechnology and the Environment session, 225th ACS National Meeting, 22, pp. 23-27, March 2003.
7. Chein H. and Chen D. , “Nanoparticles: Health Risk and Control Technology”, International Symposium on “Nanoparticles: Technology and Sustainable Development ” , a Special Symposium of the International Aerosol Conference, 2002.
8. Kim, C.S. and Jaques, P.A., “Respiratory dose of inhaled ultrafine particles in healthy adults”, Phil. Trans. Royal. Soc. London A., 358 , pp. 2693-2705, 2000.
50
9. Ajay Kumar Gupta, Catherine Berry, Mona Gupta, and Adam Curtis, “Receptor-Mediated Targeting of Magnetic Nanoparticles Using Insulin as a Surface Ligand to Prevent Endocytosis” , NANOBIOSCIENCE, 2, pp. 255-261, DECEMBER 2003.
10. Anke Di, Deborah J. Nelson, Vytautas Bindokas, Mary E. Brown, Frances Libunao, and H. Clive Palfrey﹐“Dynamin Regulates Focal Exocytosis in Phagocytosing Macrophages” , Molecular Biology of the Cell , 14, pp. 2016-2028, May 2003.
11. Edward H. Walker, Michael E. Pacold, Olga Perisic,Len Stephens, Philip T. Hawkins, Matthias P. Wymann, and Roger L. Williams﹐“Structural determinants of phosphoinositide 3-kinase inhibition by wortmannin, LY294002, quercetin, myricetin, and staurosporine ” , Molecular Cell, 6 , pp. 909-919, October 2000.
