荔枝露疫菌粒線體核酸探針之選殖與分析

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(1)11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111. 植物保護學會會刊物:的 '"'-'108 ，. 1998. 蕩枝露疫菌粒線體核酸探針之遠處與分析. 陳隆鐘 1. 賴學珍1. 李崇正 l. 鍾依紋l. 葉瑩 2. 1.台中市. 國立中興大學植物病理學系. 2. 台北市. 行政院農業發展委員會植物保護科. 安寶負 3. 3. 台中縣霧峰鄉臺灣省農業試驗所. (接受日期:民國 86年 12 月 29 日). 摘要陳隆鐘、賴學珍、李崇正、鍾依紋、葉瑩、安寶貞酸探針之選殖與分析植保會刊物:. 1998. 剪枝露疫菌粒線體核. 95 - 108.. 利用三種內限制酵素 EcoRI 、 Hinc 11 及 (EcoR 1 + Sac 1) 剪切蕩枝露疫菌 PL024 菌株之粒線體核酸，將所得核酸片段與pUC 18載體黏合並進行選殖，結果選殖到4. 個選殖株 A2-3 、 HC3 、 HC9及ES6 '其插入片段大小各為 0.6 kb 、 0.4 kb 、 0.65 kb及. 0.6 kb' 分別製備為核酸探針。並以墨點潰染法與 25 株蕩枝露疫菌粒線體核酸進行雜合反應，均有雜合交互作用。另以 17株Phytophthora菌株及 Pythium splendens 的全量核酸與核酸探針A2-3 、 HC3 、 HC9 及 ES6進行雜合反應，結果HC3 、 HC9 、 ES6核酸探針與Pythium splendens皆無雜合交互作用; ES6核酸探針與 17株Phytophthora菌株沒有任何雜合交互作用， A2-3 核酸探針除Phytophthora cη'P tog ea 外都有雜合交互. 作用，顯示 ES6 核酸探針比 A2-3 、 HC3 及 HC9 核酸探針對蓊枝露疫菌較具有專一性。經墨點潰染測試， ES6核酸探針的靈敏度可測到 100 fg濃度的露疫菌粒線體核酸。. (關鍵詞:蕩枝露疫菌、粒線體核酸、核酸探針、墨點潰染法). 花、青果、根和葉片(1)。受害初期果實表面. 緒. E. 出現褐色不規則病斑，發病嚴重時，全果. 蕩枝露疫病 (downy blight) ，又名霜霉. 變黑，果肉腐爛流出黃褐色汁液並散發強. 病，是蕩枝果實上一種嚴重的病害。)。病原. 烈的酒味及酸味。引發蕩枝露疫病的病原. 菌主要危害近成熟的果實，有時亦可危害. 真菌為蓊枝露疫菌 (Peronophythora. litchii.

(2) 植物保護學會會刊第 40 卷第 2 期. 96. 1998. Chen ex Ko et al.) ，臺灣芳芳枝露疫菌首先由. 粒線體核酸的片段製成核酸探針區分. 陳其昌博士於 1934 年發現，此菌屬於卵菌. Pythium oligandrum及 P. sylvaticum(9) 。. 綱 (Oomycetes) ，露菌目 (Peronosporales) ,. 本研究目的在以露疫菌粒線體核酸為. 露疫菌科 (Peronophythoraceae) ，露疫菌屬. 材料進行 RFLPs 比較，並利用酵素切割片段. (Peronophythora). 進行選殖製備成核酸探針，以輔助鑑定本. (2 ， 8) 。. 露疫病菌需要靠風雨傳播，病原菌隨. 菌之用。另以 Phytophthora spp. 、 Pythium. 罹病果實掉落後，潛藏於土壤中，待翠年. spp. 之核酸與蕩枝露疫菌核酸探針經由點潰. 雨季，病原菌藉雨水飛潑至花穗及果實，. 測試 (dot-blot assay) 以篩選出專一性高的核. 成為初次感染源。露疫菌的發生與空氣中. 酸探針。. 的相對濕度有密切的關係，如 4'"'"'7 月間遇. 本研究擬測試核酸探針的靈敏度，供. 久雨不晴的梅雨季節，發病情形會較嚴. 露疫菌在快速檢疫偵測上應用，並於未來. 重，花穗及綠色幼果亦會受感染而脫落的。. 配合 in-situ PCR技術，輔助露疫菌田間生態. 就整棵樹而言，樹冠下部果實最早發病且. 調查，同時利用篩選出的核酸探針與其他. 情形嚴重。果實收穫後於肘藏運輸期亦會. 卵菌門 (Oomycota) 真菌進行同源性比較，. 受到露疫菌感染而導致整箱果實腐爛。. 進而探討其親緣與演化上的關係。. 蕩枝是本省重要亞熱帶經濟果樹，栽. 培面積為一萬兩千多公頃，年產量高達十. 材料與方法. 二萬公噸，政府於近年來更積極推廣蕩枝. 的外銷工作，因此產量需求及運輸保存等技術之問題為蕩枝栽培的重點。又因近年. 露疫茵茵株來源及保存. 來夏季多雨時期常造成露疫病的發生，由. 蕩枝露疫菌、疫病菌及腐霉茵茵株(表. 此看來露疫菌於田間生態的存活情形與為. 一及表二)除自行前往臺灣各地採集並分離. 防治露疫病所產生的抗藥性等問題為值得. 者外，尚有由中興大學植物病理學系曾德. 研究調查的方向。由於生物技術快速發. 賜教授、東吳大學微生物系汪碧涵博士提. 展，目前藉著基因的選殖技術進步，可自. 供。供試之露疫菌與疫病菌株主要利用 10. 病原菌之基因體中選殖出具有特異性之核. % V-8. 酸片段，且廣泛應用於探討真菌的遺傳特. 性，例如利用限制酵素切割片段多型性. slant , 10% V-8 juice agar , Campbell Company , USA) 培養於 26 C 定溫箱中。腐. (RFLPs) 比較菌株間的異同 (7，. 霉菌主要利用馬鈴薯胡蘿蔔斜面培養基. 11). ，或是以酵素. 切割所得核酸片段進行核酸探針的選殖，. 液瓊脂斜面培養基 (V-8. juice agar. 0. 再由選殖成功的核酸探針做為真菌之偵測. (PCA slant , potato-carrot agar , Sigma chemical company, USA) ，培養於 26 C 定溫. 及鑑定(1 2) 0 例如 Stammler等人由 Phytophthora. 箱中。上述三種供試菌株之長期保存方. fragaroiae va r. rubi 的粒線體核酸限制片. 法，是以佈滿菌絲之洋菜圓盤置於無菌水. 段，選殖得到一個 1.5kb 的核酸探針，配合. 中並放置 10-20 C 定溫箱中。. RFLPs 的方法，可區分 P. fragariae va r. fragariae 及 P. fragariae var. rubi(ll). 0. Kim 等. 人將 50株真病原性的Fusarium oxysporum f.. 0. 0. 露疫菌總量去氧核糖核酸及粒線體去氧核. 糖核酸之純化方法. sp. niveum 之粒線體核酸，進行 RFLPs 分. 露疫菌總量去氧核糖核酸及粒線體去. 析，並選殖 7 個探針與各菌株進行反應，可. 氧核糖核酸之抽出方法，係取由冷凍乾燥. 將菌株區分為六個RFLP群 (7). 0. Martin也會以.

(3) 茄枝露疫菌粒線體核酸探針之選殖與分析. 機 (Labconco LYPH-LOCK R, Kansas , USA). 97. 乾燥後的菌絲研磨成菌絲粉末，取 Ig 的菌. phenol/ chloroforml isoamyl alcohol (25:24: 1) 輕緩搖動均勻混合，以4 C ' 10000 g離心 30. 絲粉末加入的 ml 萃取緩衝液 (extraction. 分鐘;再加入等體積 chloroform/ isoamyl. 0. buffer: 100 mM Tris-HCl , pH 8.0 , 50 mM. alcohol (24: 1 (v/v)) 於 10000 g離心 30分鐘;. EDTA , 100 mM NaCl, 10 mM 2-mercaptoethnol , 1 % (w/v) SDS) ，放置於 65 C 水浴，處理 10-20 分鐘。此混合液加入 7.5 ml 5 M 的醋. 將離心後所得之上清液加入 0.7 倍的異丙醇. 0. 酸餌 (potassium acetate) 置於冰上 20 分鐘. (isopropanol) 與 0.1 倍體積 3M 之醋酸紳 0. (potassium acetate) 置於 _20 C 中 1 小時，再 0. 於 4 C '以 10000 g 離心 30 分鐘，經離心後. 後，在 4 C 下，以 10000 g 離心 30 分鐘. 所得之沉澱物即為全量去氧核糖核酸，將. (Sigma , 2K15 , USA) ，取上澄液，加入0.7 倍. 此總量核酸溶解於 TE 緩衝液中保存於 _20 C. 體積之異丙醇 (isopropanol) 及 2.5 ml 10 M. 冷凍櫃中。由上述方法純化所得之總量核. 之醋酸餃 (ammonium acetate )並置於室溫下. 酸，利用 CsC l/ bisbenzimide (20μg/ ml ,. 0. 0. 1 小時;再將此溶液以4 C. ' 10000 g離心 30. 0. Sigma, MO , USA) 超高速離心法，置於超高. 分鐘，倒出上清液同時加入 TE 緩衝液. 速離心機 (Hitachi 85-72; Rotor , RPS 50-2 ,. (50mM Tris-HCl , 10 mM EDTA , pH 8.0) r容. Takeda Katsuta , Japan) 中，在 20 C 下，以. 解沉澱物，隨後加入與溶液等體積的. 45000 g 離心 24 小時。離心後隨即抽出粒線. 0. 表一、第枝露疫菌菌株來源. Table 1. Sources and isolates of Peronophythora litchii tested in this study Isolates PLOOl PL002 PL003 PL004 PL005 PL007 PL009 PLOI0 PLOll PL012 PL013 PL014 PL016 PL017 PL018 PL019 PL020 PL021 PL022 PL023 PL024 PL025 PL026 PL027. Location 南投草屯 (Tsaotun ， Nantow) 台中太平 (Taiping ， Taichung) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow). 嘉義民雄 (Minhsiu嗯， Chiayi) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 台中太平 (Taiping ， Taichung) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 嘉義民雄 (Minhsiu月， Chiayi) 南投草屯 (Tsaotun ， N antow) 南投雙冬 (Shuangtung ， Nantow) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 南投草屯 (Tsaotun ， N antow) 台中太平 (T也ping， Taichúng) 南投中興新村 (Chunghsin Village , Nantow) 嘉義民雄 (Minhsiung， Chiayi) 嘉義竹崎 (Chuchi ， Chiayi) 南投草屯 (Tsaωotωun 札 1， Nant 肋 tωow 叫) 南投草屯 (TsaωotωUI 肌 I 嘉義民雄 (Minhs 昀si山 un 江時 m l喀 g ， Chiayi).

(4) 植物保護學會會刊第 40 卷第 2 期. 98. 1998. 表二、測試核酸探針專一性的Phytophthora 菌株及 Pythium菌株來源. T'able 2. Location and isolates of Phytophthora and Pythium tested in this study Host. Isolates. Phytophthora parasitica Phytophthora parasitica Phytophthora parasitica Phytophthora par，α siticα Phytophthora parasitica Phytophthora parasitica Phytophthora palmiνora Phytophthora palmivora Phytophthora capsici Phytophthora capsici Phytophthora cηptogea Phytophthora cηptogea Phytophthora citrophthora Phytophthora citricola Phytophthora drechsleri Phytophthora melonies (P. drechsleri) Phytophthora colocasiae Pythium splendens Pythium aphanidermatum Pythium coloratum Pythium deliense Pythium mamillatum Pythium paroecandrum Pythium torulosum Pythium ultimum var. ultimum Pythium dissotocum Pythium catinulatum Pythium splendens Pythium spinosum Pythium periilum Pythium myriotylum group F group G Pythium irregulare. PPCa7-2 A2 PPCa4-5-1 Al PPAnl-l A2 PPCyl-l A2 PPCy5 A2 PPTl-4 A2 PPaCa3-1 A2 PPaCa4-1 Al PCa12 Al PCaBb7-2 Al PCrC4 Al PCrG2-2 Al PCA4-2 Al PCtW3 H PDCl-3 Al PD Al PCO A2. Dianthus caryphyllus L. (康乃馨) Dianthus caryphyllus (康乃馨) Anthurium sp. (火鶴花) Cymbidium Sineusis Willd. (四季蘭) 。mbidium Sineωis Willd. (觀音素心蘭) Nicotiana tabacina L. (煙草) Cattleya spp. (嘉德利蘭) Cattleya spp. (嘉德利蘭) Capsicum annunm L. (辣椒) Gypsophila paniculata L. (滿天星) Dianthus ca ηphyllus L. (康乃馨) Gerbera jamesonii H. (非洲|菊) Anthurium sp. (火鶴花) Syzygium samarangese Lamk (蓮霧) M aranta arundinacea L. (竹芋) Cucumis sativus L. (胡瓜) Colocasiaformosana Hayata (芋) Anthurium sp. (火鶴花). USA Taichung USA USA USA USA USA USA USA USA Taichung Tainan. Brassica. Taichung Taichung. Hibiscus. Taichung. Brassica. Taichung. Scallion.

(5) 蓊枝露疫菌粒線體核酸探針之選殖與分析. 99. 體核酸之亮帶，並以等體積之水飽和異丙. 的。C 熱處理 3 分鐘，最後以 7;J<浴處理 5 分. 醇 (dH 2 0-saturated isopropanol) 反覆抽取去. 鐘，放入 1 mlLB 液體培養基，於 37 C 培養 1. 除bisbenzimide '再將水層取出加入 1110體. 小時;隨後於4 C '以4000 g離心5 分鐘，收. 積之 NaOAc (pH5.2) 及 2 倍體積之無水酒. 集菌液，去除約 1 ml 的上層培養液，再將其. 精，於 _80 C 靜置 2 小時後，以 10000g 離心. 懸浮，並以塗佈平板法將其塗抹於含有 50. 0. 15 分鐘，離心所得之沉澱物為粒線體核酸，以 70% 酒精沖洗沉澱物，待真空乾燥. 後保存於 _20 C 中。 0. 粒線體核酸限制酵素切割片段之圖譜分析. 取0.5μg 的粒線體核酸置於總體積為 10. EcoR. 0. μg/ml. ampicillin (Sigma chemical CO. ,Sf. Louis, MI, USA) 的 LB 固態培養基上。此時培養基中含有 80μg/ml 新鮮 X-gal 及 20 mM IPTG (Gold Biotechnology Inc. , USA) ，便於進行藍/白色菌落的篩選。若為白色的菌落則可能是含有選殖片段的轉形株. 1'. (transformants) ，仍需進行質體抽取、限制. 1 、 BglII 、 Bst XI 、 Cla 1 、 EcoR 1 、. 酵素剪切及電泳分析以確認其為選殖成功. μl 的緩衝溶液中，以 16種限制酵素Apa. BamH. 0. V 、 Hinc 11 、 Hind 111 、 Kpn 1 、 Nci. 1、. Not 1 、 Pst XI 、 Pvu 11 、 Sac 1 及 Sca 1. (Promega Inc. , USA) 進行剪切，於剪切處理後以1. 5% 洋菜凝膠、 1X TAE緩衝液進行. 者。而藍色的菌落則表示不含有選殖片段. 者。核酸探針之製備. 電泳分析。電泳分析使用的分子量標記為. 取含有插入 DNA 片段的重組質體 DNA. Lambda DN A/ Hind 111 digested marker (New England Biolabs Inc. , MA , USA) DNA片段. 大約 1μg ，稀釋至終體積為 34μl 。將其置. 於沸水中煮 5 分鐘，使 DNA 雙股變單股. 大小的估計主要依據其在電泳時相對於分. 後，迅速移置於冰上，約 5 分鐘後取出，並. 子量標記的移動距離進行估計。. 短暫的離心以集中混合液，依次序加入下. 0. 列各溶液: 10μ1. 粒線體核酸片段選殖. 5X labeling mix. (含有. 述:取 3μg 的粒線體核酸以限制酵素 EcoR. random biotinylated octamers) , 5μ1 dNTP mix (含有 dNTPs 及 bio-dUTP) 及 1μ1 DNA polymerase-Klenow fragment '於 37 C 處理 1 小時。加入5μl 的 0.2M EDTA ' pH 8.0以終. +. Sac 1) 等組合進行剪. 止反應，並加入5μ1的 4 M LiCl 及 150μl 的. 切;經剪切後的粒線體核酸以 1% 的洋菜凝. 100% 酒精置於 _70 C 冷凍櫃中，至少 30 分鐘. 膠進行電泳分析，由電泳之結果分析將所. 將核酸探針沉澱下來。以 10000 rpm離心 10. 要的 DNA 片段及載體 DNA 使用相同的限制. 分鐘，將離心下來的沉澱物，以 70% 的冰. 酵素處理，並利用 GENECLEAN 11 kit (BIO. 酒精洗去多餘的鹽類，乾燥後溶於 20μl 的. 101 Inc. , USA) 回收洋菜凝膠中的 DNA 片段。將回收之片段加入 T 4 DN A ligase. TE緩衝液溶液中置於 _20 C 保存備用。. 以 pUC18 質體作為選殖 (cloning) 過程的載體( vector) 。核酸片段選殖過程為下. I 、 Hinc 11 、 (EcoR 1. (Stratagene™, USA) 以進行選殖片段與載體 DNA 的黏接，置於 16 C ' 16 小時後得到重 0. 0. 0. 0. 南方氏轉潰法. 洋菜凝膠電泳分析後，將膠體置於 0.2. 組核酸 (recombinant DNA) 。將重組核酸加. N HCl 漂洗 5 分鐘，進行去暸口令作用. 入200 ml的Escherichia coli DH5α 勝任細胞. (depurine) 。隨後將洋菜膠片置於變性溶液. 懸浮液中，在冰浴中處理 30 分鐘後，再以. (denature solution: 0.5 M NaOH; 1.5 M NaCl ,.

(6) 植物保護學會會刊第 40 卷第 2 期. 100. 1998. pH 7.5) 中漂洗 30 分鐘，使 DNA 由雙股變. phosphatase (以 blocking solution稀釋至終濃. 成單股。用去離子水漂洗膠體兩次再將洋. 度為 0.5μg/ml' 並且每平方公分的薄膜使. 菜凝膠置於中和溶液. (neutralization. 用 0.05 ml) 搖晃反應 5 分鐘。再將此溶液倒. solution: 1 M Tris , 1. 5 M NaCl , pH 7.5 )中漂. 出，以 wash solution II (l OmM Tris-HCl ,. 漂洗兩. 洗 30 分鐘，以中和其鹼性。隨後剪下一塊. 10mM NaCl, 1mM MgC1 2, pH 9.5). 與洋菜凝膠大小相當的 Immobilon-S. 次，每次 5 分鐘。漂洗完後將其倒出，迅速. membrane '並將其以 2 倍的 SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate) 緩衝液潤 j盔，使用 MilliBloe M - VP vaccum transfer system (Millipore Americar Bionetics Inc. , USA) 進. 加入 lX Lumigen-PPD. (每平方公分使用. 0.025 ml) 於雜合反應袋中，溫和的搖動約 5 分鐘，使其反應。打開雜合反應袋，將其內的溶液盡可能的倒出，並將袋子均勻壓. 行轉潰。使用 20倍 SSC緩衝液為轉潰溶液，. 平後封起來， J;)X-ray 底片 (Amersham ，. 將 DNA 轉潰到上述薄膜上，置於乾淨的. Hyperfilm™-MP, USA) 進行壓片，大約 1 小. 0. Whatman ™ 3MM paper上，以 80 C 烘箱真空烘乾 30 分鐘。完全乾燥後，置於 UV. Stratalinker 1000 (Stratagen eTM, USA) 內進行. 時後可獲得最適當的訊號強度。. 墨點潰染試驗法(. dot-blot assay ). 聯結 (crosslink) ，使 DNA 固定於濾膜上。加. 取核酸樣本各 1μg ，加上 300μl 變性. 入 30 ml 的前雜合溶液 (prehybridization. 溶液 (denature buffer: O.4 N NaOH , 10 mM. solution: 6X SSC , 5X Denhartes reagent , 0.5% SDS , 200μ1 denatured salmon sperm. EDTA, pH 8.0) 於 90 C 的水浴煮 10分鐘，再. DNA) 於“。C 進行前雜合 1 小時，然後將已. 96 孔墨點抽吸轉潰器 MilliBlot™. 標幟好之核酸探針，用沸水煮 5 分鐘使其變. (Millipore Americar Bionetics Inc. , USA) 使. 性;再冰浴 5 分鐘維持其單股形態。之後加. 吸附於硝化纖維膜，並以紫外光照射固定. V. 置於冰上 5 分鐘。將處理過後的核酸樣本以. Systems. 入前雜合反應溶液中，以相同條件下進行. DNA 於濾膜上，再以核酸探針進行雜合反. 核酸雜合 6-8 小時。其後將薄膜取出以 2X. 應。再藉由上述之偵測反應觀察雜合反應. SSC ' 0.1% SDS 溶液於室溫下漂洗5 分鐘，並重複一次。再以 0.1X SSC ' 0.1% SDS 溶. 訊號強弱及產生與否。. 0. 液於 68 C 下漂洗兩次，每次 15 分鐘。然後. 結果. 將其置於男一個核酸雜合反應袋中，以便. 進行偵測反應。將 blocking solution (5%. SDS; Phosphate buffer, pH 7.2) 加入此雜合. 粒線體核酸限制酵素剪切片段多型性分析. 反應袋中，大約每平方公分的薄膜使用 0.1. 以 25 株芳芳枝露疫菌菌株(表一)的粒線. ml 的溶液，在室溫下溫和的搖動約 5 分鐘，. 體核酸經EcoR 1 內限制酵素剪切後，將各菌. 將其倒出後再加入 streptavidin (以 blocking. 株粒線體核酸剪切成 5-6 條片段。分子量分. solution稀釋至終濃度為 1μg/ml '大約每平. 別為 0.6 至 14 Kb 之間(圖一)。另外，再取. 方公分的薄膜，使用 0.05 ml) ，在室溫下溫. PL024 菌株的粒線體核酸分別使用限制酵. 和的搖動，約 5 分鐘使其反應，隨後倒出此. 素: Apa 1 、 BamH 1 、 Bgl II 、 Bst XI 、 Cla. 溶液，加入 wash solution 1. I 、 EcoR 1 、 EcoR V 、 Hinc II 、 Hind III 、. (即 blocking. solution 稀釋 10倍，每平方公分的薄膜使用. Kpn. 0.1 ml 的溶液)漂洗兩次，每次 5 分鐘。之. 及 Sca 1 進行剪切酵素處理，以 0.7% 的洋. 後，倒去此溶液，加入 biotinylated alkaline. 1 、 Nci 1 、 NotI 、 Pst XI 、 Pvu II 、 Sac. 1.

(7) 血 I~J有他的 f~f:;!恆的附j~1tL~三還 Wilfi! 分1fT. rtwl 立進行 fE : 社分 lI r H TiIl ~/ 11. . PL02 -1. f"旬開! 賞問哇. C/II 1 、 ! c(lR 1 、 [( oR V 、 HÍlIt'. 1I 、 1/ III<J 1I 1 、 NC/. 1 、圳( ' 1 )ι，~.( (( I I缸，|i|lRFAf 的 ~H lJJLJ.f~ dj I II十仁 Ui. -|silRIAO牙切 II ~) 粒 H~ 11'!'I恢們 ﹒ 1') ;.(, :t:_ '短時 j住 Uí 山水~)' tlr. 101. 自行 f~ ì~ill' ~/lflj' [l .• .. t札 1 : 粒線體報酸限制酵素剪切片段還殖. “. 月'1. P L02 -t I'fi 1'1'叮 f " f~' 1叫做們付圳以. fjt 1;-1'l芷 i r 1,1, IT U i!~ j:-t l ('♀ Jt f~z (i ~J ). 'J\ PL02 -l l'ij n~ 抑制憫怯何在川眼前11M 半:. o f{ I 、 'ú“ 1 / !(υ RI 、 J-/ /l ll' II 吋 UJ1是， 1111 WJ(], !j; 1 Kbfl') 校門哇 n 伐， 'J'lpuc 1x,hx11fB,', 合{是 ﹒可艸 1I 作 fll (1 ra n 、 fOr l11 allOn) 主人 ι:.('o fl 0 11 5 1 "1 叫:11 1 . I也 11] '\ -g.<J 1 . IPTG Ji_. B~/. alllrl (， l lI ln ~ 1l I: ，?~)itl r 帥扭 ﹒ 挑1f，{ 1 I 已 I'li. 後 ﹒ jI j !JiJ. .t ON A r. d I inu II1 'jfJ UJ (J'.) t~~!\位 í} J~. n.. 11 I /:.( υRI. 、 ι/(/ 1 、 f('()RI 、 I_('(I R V 、. Hmc 11 、 11;I/(J "1 、 ÑCI 1 、 5的 1 I Eco f{ I. t-{. 1.在 ﹒. ).5哇 !:j tyffJfR 入 t!L線相怯懦 J.，' E'l(I~)J宜. .IJ; Ii{( '~ J.t ~ M!.E巧成的. S( 1I 1 叫 υ)(i ‘ IT 1) ~J-d ， ;~ ~ 叫jtmtmt fT. 怕你 o. 汁(I;U"~~\-37 Kh ~11I 1 ()~ ~ I ‘(jJt仁?"醉索. t~;以小 lil;}~ I~/i叮J.-' 1JI Il f~ ! ~ '{1 伊 ON \ ‘ 純|按. 0. 1J l.}J 泊的做們在 nnH 、松 0.5 Kh . ll1E,l. ?在詠膠片 I，~i rl. 11l H 分(- !丘，、. 自| Fiε.. :l jl] n r-A~ í)IJ l:JJ 俺看. Hf lll. ﹒ JI):n 泣如'i. !lli fi~'的水分析、 Ii;J， lt 'k'~ J t.. 竹 r- fft 外 ﹒ .\It Wf i墊啪忱的捕入 Jt 段以. .以此先乎?. 、 25 H.JÍ'ál'~ tf:ÎlrÎP' It r' f.'~'n叫主Aií~l~! [:(.oR l ~lU;II~ r，r的 UJ 估計心，γ }frjfll. 1. Elet' lrophom: 、l' palatlull. ()f. ! cυl是 l -ul)!1'、II'U Il1 l f) N A、。 I. 2 'i. I 、01<111':、 I rom I勻，仰(f{)llh\'lh(l( “. !t lc 1111.. M Markcr:.\ DN \ I/lII d 111 lhgc、I I'U Th l' j'o l‘lIl' 叭恥: Lall l' 1. PU1(] 1. 1 ,ln t: 2 PU102. lanc "' PI .()()l . 1 an l' ~. Pl O(l-t: L lIl e 'i‘ PLOOS . L 扎I1l' 6 PU)O(l: Lan l' 7. Pl 007' La l1l' H PUI()l). L. lne 9 , PUIIO: Lan l' 10. PL( I Il . LJ I1I' 11 . PU112 ; Lan l' I~. PLO I3. L Il ll IJ. PLI) I~: I..lne 14. PLO 16. L.ln l' 15. PLO 17: 1 an l' 16. PLO 1R. LJnl; 17. PUI' 9; Lan l' 1 鼠 . 1' 1 .υ~(): L.anc 11.). PL021. l .ane 2(). Pl022. Lane 21. PL023: La l1 c ~2. PL02-l : Lanc 23. PL02 'i . I .an l' 2..L PL02h. Lanc 25. PL .()27. ,.

(8) 他拘 j" 摳，只會會 r~1. 11l:!. m 4的:& m 2 IPI. 1'1<111. M 1 23456789. 國I - 、路位 IflPLO:!4r俐在校做何做賠付 f [， il限制JM~~前 UJit: 之 nI:i，k 分昕|晶I. n. Fig 2. Elcllrophofl.! lI c 'i cparatinn 01 陀、tnclion cn/} I1lC、 01芒c、ICU mtDNA、 from p ('ronop!" (110m l /l cl l/ i. M Marl、cr: À DN t\ uigc、 leù v.ilh Hlllu 111 : L. unc 1 wllh B~I 11 uig‘!~lco: Lanc 2' wllh 0" 1 ulg\.!、I\.!O .. Lan\.! J : "、 Ith Ec υR 1 dlgc、 leù ‘ Lanc 4- : 吼叫 h [:，(υR V dr皂c\lcd. Lanc 5: wi th Hillc 11. ùlgl!、lCÙ .. Lanc 6 . \\ Il h HIIIC 111 olgcstco. Lanc 7. 叭， Ih \n 1 o'gc、tcd. Lunc 8 、、 IIh Sac' 1. oigc、 ICo :. Lanc 9' \\ IIh Sm 1 ulge~lcd. 衣 -、 m;疫 l宙 PL024 的林拉總體惋惜1l1~:hl凶手持的lJJnn~ .K皮. Tahle 3.. Rc叫nClI on Iragmc nL "'"C、(， n "110 PUO/lOpl1\ (11O rll l"cllII. Em/yme Bg/ lI/ Fragmcnl EcoR 1 13 .1 69 9.568 2 3 4.397 4 1907 5 2987 0.599 6 7 8 9 10 11 11 IJ 14 TOlal 34.82. Cla I 9.997 8.329 5.0.t 6 4 145 3.019 2430 1334. ha、c. HIIIC 111 HIIIÙ 111 11848 6.557 4- 88 .Uól 2 結38. 2659 () 767. 。.962. 11 512. “ 1..t 9. l7結4. l219 2.376 2072. pa,r\) of mlDNA 01 a. 1S olatc. PL02 4- 0 1'. EcoR 1. EcoR V. NCll. 1.3.4 11 1 J.()2 1 6.979 279 1 0.604. 12 法 11. 13.849 8..l8 ..t ó 165 4. 111 2.51J 0.619. Sac 1/ EcoR 1 aó32 7200 5.987 4622 2.746 1099 0 .767 0 .564. 34.81. 3325. ~5.65. 36.62. 於 316. ..t.5 11 3 .829 1.947 1.831. 16 法4 1.斗法 1. Sac 1 11.275 6.960 490。. 4 .361 2.974 2 .455 0.985. 1 243 1 168 0909 () 757. 35 .24. J 191. 月“ .37. 33.91.

(9) 蓊枝露疫菌粒線體核酸探針之選殖與分析. GENECLEAN II Kit進行回收，製備成核酸探針，另外將露疫菌粒線體核酸，用同樣. 限制酵素剪切後，進行南方潰染分析，以確定其為粒線體核酸上的選殖片段(圖. 103. 雜合訊息出現(表四)。核酸探針晶質評估. 取PL024菌株之粒線體核酸 1μg ，做一. 三)。結果選殖至IJA2-3 、 ES6 、 HC3 、 HC9 四. 系列的 10倍稀釋(核酸濃度 1μg. 個選殖株。 A2-3 、 ES6 、 HC3 、 HC9 選殖株. 點潰分析與 ES6核酸探針進行雜合反應，結. 的插入片段 (insert fragment) 大小分別為 0.6. 果核酸探針能偵測到 100 fg濃度的露疫菌粒. Kb 、 0.6 Kb 、 0 .4 Kb 及 0.65 Kb 。經標幟過. 線體核酸反應。. -1 fg). ，經. 的核酸探針與 25 株露疫菌粒線體核酸以點. 潰分析方法進行雜合，結果與每株菌株都有反應。選殖株的插入片段經回收後，以 BglII 、 Cla 1 、 EcoR 1 、 EcoR V 、 Hinc II 、. Hind III 、 Nci 1 、 Sαc 1 及 Sca 1 限制酵素剪. 討論. 由露疫菌 PL024 菌絲粒線體核酸經. EcoR 1 、 (EcoR 1. +. Sac 1) 及Hinc II 所選殖. 切，以1. 4% 洋菜凝膠進行電泳分析。由限. 到的 A2-3 、 ES6 、 HC3 及 HC9 選殖核酸片. 制酵素剪切的片段估算大小後，可得其相. 段，皆與露疫病菌具有雜合反應。由這些. 關的限制酵素切位，進而得到限制酵素的. 片段製成的核酸探針與 17 株 Phytophthora 及. 圓譜 (restriction mapping)( 圓四)。. Pythium splendens 進行核酸探針專一↑生測試，結果 ES6 與各菌株沒有明顯的雜合反. 篩選專一性核酸探針. 應; A2-3 核酸探針除了 Pcrc 及 Pcr菌株外都. 本研究利用四組選殖露疫菌核酸片段. 有雜合反應、 HC3 、 Hω核酸探針與 Phy，的'J)hthora. 與 Phytophthora spp. 總量核酸進行南方氏轉. spp. 及 Pythium splendens 有不同程度之雜合. 潰雜合反應，以分析其是否對露疫病菌具. 反應。另外將A2-3 、 HC3 、 HC9 及 ES6核酸. 有高專一性。結果 HC3 核酸探針只與 Pal. 探針與 16株 Pythium spp. (表二) ，進行墨點. A2 ( Phytophthora palmiνora) 有雜合反應; A2-3 核酸探針除了 Pcrc 、 Pcr ( Phytophthora. Pythium spp. 多少都有雜合交互作用，四個. cryptogea) 菌種外，都有雜合反應; HC9 核. 核酸探針對的及 P23 都沒有雜合交互作用。. 酸探針與 Par 1 (P. parasitica) 、 Pal. A2-3 、 HC3 、 HC9 核酸探針與 16 株 Pythium. palmivora) 、 Pcr. (P. cryptogea) 、 citrophthora) 及 Pd (P. drecheleri) 菌有雜合反. spp.( 表二)有不同程度的雜合訊號。在四個. 應;而 ES6 核酸探針則與這 18 株測試菌株. splendens 之全量核酸的南方雜合反應中，. A2 (P. Pcitro (P.. 都無雜合反應(圖五)。. 分析方法，結果 A2-3 、 HC3 與 HC9 這 16 株. 探針與 17 株 Phytophthora spp. 及 Pythium 發現ES6與各菌株間沒有明顯的雜合訊息。. 另外分別將此四個核酸探針與 16 株. 總括上述三種雜合反應結果， ES6核酸片段. Pythium spp.( 表三)的總量核酸進行點潰雜. 為目前較符合本研究要求之核酸探針。另. 合作用。結果 A2-3 與 P8 、 PIO 、 P16 、 P22 、. 本研究未來應以收集更多露疫菌及. P鈞、 p鈞、 P90 及 P263 有雜合反應。 HC9 與. Phytophthora 、 Pythium 菌株，以進行南方. P8 、 PI0 、 P16 、 P18 、 P22 、 P25 、 P30 、. 墨點潰染法偵測分析，以確立核酸探針的. P90 、 P211 、 P263 及 P118 皆有雜合反應。. 專一性。目前在核酸探針品質評估方面，. HC3 核酸探針除了 P2 、 P8 、 P43 、 P118 以外. 經點潰試驗發現， ES6核酸探針的靈敏度可. 都有雜合反應，而 ES6與各菌株沒有明顯的. 測到 100 fg 濃度的露疫菌粒線體核酸之存.

(10) hfll月 l'j:j\喔，戶合會刊哨 . 10 缸. 1(1.1. ..、. a. 3. _. 74121叫. III(IX. ,.., 173-:'>6. 'r，='τ區三:. A. 8. 祖. 23. 9 自. • 。. 121. ( Iì. M. 1. a. :3 '". M. ,•. 3. _ B. 弋司』. 23. ,I(Î. 23 I. e. '. 9 6. 38. 2. •. •. 。. (31. ....-. 冒，. (4). !自! 三、絨服 ;lilm~ 桌前l;J)之路控I'N f，'í 線帕格惜與惋惜 n~Hn )HM í'l~ r7 Jt t! r (1) 坪 i[(oR If鈺 11 11 的 W 自 'H ‘J叫 a 1 (Lun附 lC泊創) J處$挂垃J1M 的 J 6 村古持#線泉制 1悄支偕瞪制H怯 4偕J 作許衍釗" E f 臼 S 白之 i巾 ~i 行 fI 雅可引j川<./.1皓懲 ;川n叫I t'机村;1 川， h川 "川 l刊j雌$拉且1用 1咀E 盯叫{自" 叩叭 )川i.\‘J7 t線品棉{性在鬥偕費幼則11恢友R 骰費f 抖作句棋Ti扑1 刊 1 I叭 C 1 之 l兩#何i1力i$ 對雜{任u 什 îJk 叉 1咯悠 :川(~) h' H im. 1I 1~主J1I! (J')r 份研惋惜何將們 n: 釗 II C9 之!何 f) f'lL 'î/ {ØJ!. A: 也休外衍|品I ; 13 : rl f J tf! r Î 反捨: ~l : 咒1 ar"cr : 1l1llllJ 111 刊îJ lJ)之 l DN \ I1l tDNA rl" tncluln Ira g.IllCnh h~ bnJllcd 10 [)~A pro h!:... (1) L co RI A2 J plllOl. (2) /: (υ R JI \w I (Lunc 1-5 ). Lw R I (Lanc 61 Jigc、1、 h}lmJl leù 10 [ S6 probc: (, 1 1i'lI c 11 Ll lgc、1、 h~onù i /cù 10 IIC3 pronc. (~) Hìllc 11 ùlgc、1、 hyhmllleù 10 II C tJ rrobc. Elcctrophonc ana l ) 、c\ rattern: B' Soulhcm bull h) bnùllu lI on M' Mar"cr. l DNA/ ù 111 tll忠心、ted . ( 1) Lane 1: PL024. Lanc 2 PLOO ,. Lanc 3' P l.()()工L.am: 4: PL003. (2) Lanl' 1. PL005. Lanc 2 PLO()6. Llnc ,: PL007 1 .IIl C 4: Pl02~. L lIl c .5 PLOOtJ. Lune 6: PL()2~ : (3) Lanc 1 PL02.t, Lanc 2: PLO I2. L lIl e 1 PU)1 3. Lanc 4 ' PLOI4' 141 Lunc 1: PLO16. Lanc 2: PLO 17. Lanc 1: PL024. Lanc 4 PU) 18. Fiε. ~.. P('/'(J/ /(}pll\ 111ρ/'(/ lilcIIii. dlgc、1、 h)bnÙl /cJ to. ^. /I",. ,.

(11) Irt;Hß1世 mm-~ Rn惋惜f.1j 1 之還有tIOO 份材. lI/IIc lI. () S5 Kh. 105. 0. 10 Kb. 11(''1. 、" I l'UJR I. ....(1( I. 0.30 Kb. 0.10 Kb. fI川ι 11. E有b. 、"， 1. OA- Kb. 11111.; 11. 11 ,,,,.: 11. 11ι 可. o (i Kh. f n/R I. I_("(J R 1 A:! 1. [fll 川、快肉EfZI 12. 卜的白、 IIC 1 、 Jl C9 之曰~;Iill醉 .f: r.11~~~. Fig 4. R~、lri~linn 1ll,IP'. III. rrohc、 A2-3. E$() IIC' .111<.1 Jl C9.. A. B. .. ". l的11 L 、攸階t~~í I勻的! 1 7 朴、 Ph\ loph\ 11/(/1 “、pp}之 P\lhl/llll \1'11.'川lt'll \ 之食品，核惜的對U~Jil!吧。. I'li f南婦 1此， fi 勻 l，lA.. A : "江水 rl lr1 t"'I: B : IYJ l ， tfU'ì J>(lf~ Fig. S. Plrr/oplnllw/'o 、 pp . anù Py 1l11 1l111 \/I!ellcl('II ,\ llllJI DNA... h) 1可 nÙ l/ cù to probe ES6 , 代 : Elcltrnphor~tic anal) u patlcrn. ß Slluthel n hlot h) hnùi at lO n Lane 1: Par 1. Lanc :2 Pm 4. 、、 L .tn l l' PPCJ 4-"- 1. L 1I1c 4: Pur 72. Lanc S Par l) 171. Lanc (l Par 90174. Lane 7 PaJ 1\1. Lane X Pal 代 2. Lanc 9 Pc r. Lanc 1(): Pcrl. l ...t ne 11. P<.:a. Lane 12 Pco l. Lanc 13 1次: “ ri . Lane 1-1 ' PCllro. Lmc 15 Plap. Lane 16 Pù. Lam: 1"" PIllI' . l an~ IH P、 p .. ,.

(12) 植物保護學會會刊第 40 卷第 2 期. 106. 1998. 表四、核酸探針ES6 、 A2-3 、 HC3 、 HC9與 16株腐霉菌種 (Pythium spp.) 及 1 株疫病菌種. (Phytophythora palmiνora) 的全量核酸進行點潰雜合測試之結果. Table 4. Results of dot blotting of total DNAs from 16 isolates of Pythium species and Phytophythora palmivora probed with DNA probes ES6 , A2-3 , HC3 and HC9 DNA Probes Isolates l ) A2-3 ES6 HC3 HC9 -2) Phytophythora palmivora +/+/+/Pythium splendens +/+/+/. Pythium aphanidermatum +/+/+/. Pythium coloratum +/Pythium deliense + + Pythium mamillatum + + + Pythium paroecandrum +/+ + Pythium torulosum + Pythium ultimum var. ultimum +/+ + Pythium dissotocum +/+ + Pythium catinulatum + + + Pythium spinosum +/+ + Pythium periilum +/+/. Pythium myriotylum + + .+/group F +/group G +/+ + Pythium irregulαre +/+/1) The isolates were listed in Table 2. 2) +: postitive signals; -: no signals; +/.: the very weak hybridization signals. 在，利用 ES6核酸探針直接偵測植株本身是. number) 之 HC9 DNA 片段。或可利用這些. 否感病，此靈敏度最少可偵測多少數量病. 核酸探針在 RFLP 分析與南方墨點法之差異. 原菌存在，目前正由後續實驗進行中。本. 程度比較露疫菌菌株間或與卵菌間的歧異. 研究或可將現在製備完成的核酸探針，藉. 度與親緣關係，與現今卵菌分類法相互比. 由核酸序列解讀及引子 (primer) 設計，再輔. 較，為菌株分類與鑑定提供一新的依據。. 以生物技術，諸如 in situ PCR 與單元抗體. (monoclonal antibody) 之應用，發展出更快速，更靈敏的偵測方法，以達本研究專一. 謝辭. 性核酸探針偵測的最終目的。. 本研究承蒙中興大學植病系曾主任德. ES6核酸探針與 A2-3 核酸探針其分子量大小相近，經由限制酵素圓譜分析，兩者. 賜教授及周俊吉先生多所協助，在此誌. 差異頗大。且由南方雜合反應結果知道，. 謝。本研究承行政院農委會計劃 86 科技-. 其兩者並無同源性。而 HC9 核酸探針與露. 1.1. 疫菌做南方雜合反應，結果除了本來的雜合帶之外，另有其他雜合帶，推測此菌株. 之粒線體核酸可能有多於一個複本 (copy. 引用文獻.

(13) 蓊枝露疫菌粒線體核酸探針之選殖與分析. 1.. 107. Ann , P. J. , and Ko , W. H. 1980. Oospore germination of Peronophythora litchii.. of mitochondrial DNA from Fusarium oxysporum sp. niveum. Phytopathology. Mycologia 72: 611-614.. 82: 346-353.. 2. Chen , C. C. 196 1. A species of Peronophythora gen. Nov. parasitic on litchi fruit in Taiwan. Special Pub l. Col l. Agric. , Natl. Taiwan Univ. 10: 1 刁 7. 3. Garber , R. C. , and Yoder , O. C. 1983. Isolation of DNA from filamentous fungi and separation into nuclear, rnitochondrial , ribosomal and plasmid components. Anal. Biochem. 135: 416-422. 4. Goodwin , P. H. , Kirkpatrick , B. C. , and Duriway, J. M. 1989. Cloned DNA probe for identification of Phytophthora parasitica. Phytopathology 79: 716-72 1.. 5. Ho , H. H. , Jiayun , L. , and Longyin , G. 1984. Observation on asexual reproduction by Peronophythora litchii. Mycologia 76: 745-747. 6. Kao , C. W. , and Leu , L. S. 1980. Sporangium germination of Peronophythora litchii , the causal organism of litchi downy bligh t. Mycologia 72: 737748. 7. Kim , D. 旺， Martyn , R. D. , and Mafill , C. W. 1992. Restriction fragment length polymorphism groups and physical map. 8. Ko ,. W. 旺， Chang ， H. 丘，. Su , H. J. , Chen , c. c., and Leu, L. S. 1978. Peronophythoraceae, a new farnily of Peronosporales. Mycologia 70: 380-384. 9. Martin , F. N. 199 1. Selection of DNA probes useful for isolate identification two Pythium spp. Phytopathology 81: 742746. 10. Martin , F. N. , and Kistler, H. C. 1990. Species-specific banding pattern of restriction endonuclease-digested mitochondeial DNA from the genus Pythium. Exp. Mycol. 14: 32-46.. 11. Stammler, G. , Seemuller, E. , and Duncan , J. M. 1993. Analysis of RFLPs in nuclear and mitochondrial DNA and taxonomy of Phytophthora fragariae. Myco l. Res. 97: 150-156. 12. Whisson , S. C. , Macelean , D , J. , Manners , J. M. , and lrwin , J. A. G. 1992. Genetic. relationships among Australian and North American isolates of Phytophthora megαspermαf.. sp. glycinea assessed by. multicopy DNA probes. Phytopathology. 82: 863-868..

(14) 108. 植物保護學會會刊第 40 卷第 2 期. 1998. ABSTRACT Chen, L. C.l , Lai, S. C.l , Lee, C. C.l , Chung, Y. ，耽心 Yeh， Y.2, and Ann , P. J.3 1998. Cloning and analysis of mtDNA probes of Peronophythora litchii. Plant Pro t. Bul J. 40: 95-108. (l Department of Plant Pathology, National Chung Hsing University, Taichung , Taiwan , R.O.C.; 2Council of Agriculture , Executive Yuan , Taip缸， Taiwan , R.O.C.; 3Taiwan Agricultural Research Institute , Wufer嗯， Taichung , Taiwan , R.O.C.) The mtDNA of Peronophythora litchii PL024 was digested with EcoR 1, Hinc II and EcoR 1 / Sac 1, and the DNA fragments were ligated with vector pUCI8. And then the. recombinated plasmids were transformated into E. coli DH5α. There were four recombinat clones , designed as A2-3 , HC3 , HC9 and ES6 respectively. Their sizes are 0.6 , 0 .4, 0.65 and 0.6 kb. Probes A2-3 , HC3 , HC9 and ES6 showed s甘ong signals in dot blot hybridization with 25 P. litchii isolates. Four probes hybridized with 17 Phytophthor，α isolates and Pythium splendens , and none of any hybridization signals were detected except probe A2-3. None of any hybridization signals was detected as ES6 probe hybridized with 17 Phytophthora isolates. Probe A2-3 hybridized with 17 Phytophthora isolates except Phytophthora cηptogea. Specificity of probe ES6 to P. litchii was higher than A2-3 , HC3 , HC9. In dot blotting analysis , a weak hybridization signals were shown when these four probes hybridized with 16 Pythium isolates , and ES6 probe was sensitive to mtDNA of Peronophythora litchii in concentration of 100 fg. (Key words: Peronophythora litchii , mtDNA , DNA probes , dot blot hybridization).

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