應用表面電漿共振(SPR)開發生物感測器-定量偵測醣化血紅素方法的探討

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

應用高靈敏度表面電漿共振（SPR）開發生物感測器—定量

偵測醣化血紅素方法的探討

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC94-2320-B-039-011- 執行期間： 94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥大學醫事技術學系 計畫主持人： 施木青 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 95 年 10 月 14 日

摘要

糖化血色素(HbA1c)是監控糖尿病病人血糖控制的最佳指標,因為它在血中很穩 定,隨著紅血球的壽命運轉,而且可反應過去 2-3 個月的血糖平均值。目前已有高壓液 相層析法(HPLC)和免疫法用來測試血中 HbA1c 的量,但目前所需血量較多,且反應過 程繁複,若要使用於晶片檢測，尚有諸多困難。本研究利用 SPR 晶片技術結合硼酸與 糖化血色素鍵結的原理,設計本方法探討其臨床應用的可行性。 本研究經一年多的努力,得到下列 3 項結果: (1) 自組 DTBA-PBA 於金膜:可在金膜上建構出一相當均勻之硼酸分子之單分子層,做 為鍵結糖化血紅素之作用平台。 (2) SPR 儀器的解析度及靈敏度可偵測到 0.001 度的傾斜角度,即可偵測出 0.01ug 的糖 化血紅素。此結果顯示 SPR 的高靈敏度可降低 1/100 的血液樣本量。 (3) 鹽酸脫附效果 僅達白分之六十五，不利於晶片的循環利用。 本研究結果已呈現 DTBA-PBA 金膜在捕捉 HbA1c 分子時具有高度的特異性,SPR 量測時又具有很高的靈敏度,唯尚須克服的是金片的脫附與再利用。

Abstract

Glycohemoglobin(HbA1c)is a good indicator of glycemic control of Diabetes patients. It is very stable in blood and circulate with RBC. HbA1c can reflect the mean blood

glucose value of past 2-3 months. At present , HPLC and immunoassay methods are commonly used for the determination of HbA1c in blood.

However these two methods need large volume of blood sample and complicate reaction process. In this study we try to use SPR technique combining DTBA-PBA monolayer for the determination of HbA1c. Our study have gotten three results:

(1) Self-assembly DTBA-PBA gold membrane:We can constract a DTBA-PBA monolayer uniformly attatch to gold membrane,which can be used to catch HbA1c molecules. (2) The sensitivity of SPR instrument can reflect 0.001degree of。contact angle. It means

this method can defect as little as 0.01ug of HbA1c. We estimate the blood volume used for HbA1c determination can be reduced to 1/100.

(3) Only 65 % of binded HbA1c can be eluted after HCl treatment.

Our study revesled the specificity and high sensitivity of SPR method. The last problem we need to solve is the regeneration of the DTBA-PBA gold membrane.

研究計畫內容：

(一) 前言(Introduction)： 根據 92 年行政院衛生署統計[1]國人十大死因中以糖尿病的攀昇為所有的慢性病 中速率最快的（表一），其中糖尿病死亡人數增 1,195 人，較惡性腫瘤增加人數 859 人為多，顯示糖尿病影響國人健康日益嚴重；美國最近之研究報告[2]也指出 2002 年 美國每名糖尿病患者之平均醫療支出為 13,243 美元 ，遠超過非糖尿病患者之 2,560 美元，可見糖尿病對醫療資源之消耗性及衝擊力。 根據以往調查，台灣地區約有 4 % 的人口罹患糖尿病，因此推算目前全台應有 將近一百萬名糖尿病患；但是健保資料顯示，用藥患者約有七十餘萬人，所以扣除一 成左右病情輕微不需用藥者，大概還有兩、三成糖尿病人渾然不自知。這項偏高的比 例顯示國民預防保健仍有待大力加強。 糖尿病患的併發症主要可分為：(1)大血管(macrovascular)病變，例如：心臟血管 疾 病 ； (2) 小 血 管 (microvascular) 病 變 ， 包 括 視 網 膜 病 變 (retinopathy) 、 腎 臟 病 變 (nephropathy)；(3)神經病變(neuropathy)。隨著糖尿病患者人口的增加與罹病時間的延 長，糖尿病相關併發症的發生必然會持續成長，同時對於公共衛生與醫療的負擔亦會 日趨沉重。1993 年美國 DCCT 的研究報告良好的血糖控制可延緩疾病的進展[3]。不 過以目前我國糖尿病照護的情況來分析，在控制病人的血糖部份，仍有相當大的改善 空間[4]。但偵測血中葡萄糖只能反應抽血當時瞬間的血糖濃度，所以各國糖尿病學會 都建議利用檢測紅血球中醣化血紅素(A1C)所含比例作為病患近二~三個月內的平均 血糖控制情形，檢驗 A1C 的方法有離子交換層析法、親和性層析法和免疫分析法， 雖然不同測量方法解析度有別，但只要測量結果可與美國 DCCT 建立的 A1C 標準參 考值建立良好相關性，便可通過美國 NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program) 的驗證[5]。雖然離子交換層析法是目前美國 NGSP 的參考方法，臨床實驗 室已普遍使用，但還是有設備昂貴、試藥成本高、靈敏度不高和易受變異血紅素影響 [6-9]等缺點。因此提供一個快速、經濟準確又高靈敏度的方法，實為提高現行檢測醣 化血紅素(A1C)效率的重點。

本研究著重在利用表面電漿共振(surface plasmon resonance; SPR)特性來檢測醣化 血紅素，表面電漿共振檢測法具有無需標定、高靈敏性、可定量、高選擇性(針對受 體的不同而有不同選擇性)及即時量測等重要特性。目前 SPR 技術已被應用於生物晶 片上，偵測大分子抗原和抗體的交互作用，因此利用 SPR 技術來增加檢測醣化血紅 素的準確性，減少測定上的誤差，進而提供檢測醣化血紅素創新、簡易及靈敏的選擇， 是本研究計畫之方向。

表一. 十大死因死亡人數年增率比較表 死 因 別 所有死因 惡 性腫瘤 腦血管疾病 _心臟疾病 糖尿 病 事故傷害 慢性肝病及 _肝硬化 肺炎 群及腎變性病 腎炎、腎徵候 自 殺 高血壓性疾病 人 數 2942 859 395 344 1195 -298 390 569 138 142 -103 年增 率％ 2.32 2.50 3.29 3.01 13.55 -3.51 8.13 12.56 3.31 4.65 -5.29 九 十 二 年 死 亡 數 較上 年 增減 貢獻 率％ 2.32 0.68 0.31 0.27 0.94 -0.23 0.31 0.45 0.11 0.11 -0.08 註：貢獻率=（92 年較 91 年死因別死亡增加數÷91 年死亡總人數）* 100%；故各死因 貢獻率相加之總和等於 92 年所有死因年增率。 (二) 研究方法： 偵測醣化血紅素對於糖尿病患者而言可以提供一長時間的血糖變化平均值[6]，醣 化血紅素是由於紅血球形成時血中葡萄糖和紅血素中的纈胺酸(Val)的胺基(NH2)發生 鍵結並重排後變成一個不可逆反應（圖一） [10]，餐後的血糖值升高並不會導致紅 血球中醣化血紅素的增加。此外紅血球的生命週期約為 120 天，因此醣化血紅素對於 糖尿病患者來說，代表著病患在近二~三個月左右的血糖變化情形，對於診斷及追蹤 糖尿病病患病情，是一相當重要的依據。 圖一、醣化血紅素的形成機制 因此利用硼酸捕捉有 Glucose-cis diol 功能基的部分，就可區分成糖化、非糖化 兩部分[9,10]。並測定醣化血紅素的量。其研究過程如下：

合成 DTBA-PBA：

利用 EDC 活化 4,4－Dithiodibutyric acid ，進而和苯硼酸胺分子進行生肽鍵結， 鍵結形成後將形成不溶於水的沉澱物 DTBA-PBA，離心收集烘乾即得粗產物，再利用 甲醇及水做再結晶，純化 DTBA-PBA。 自組裝 DTBA-PBA 於金膜： 將金基材利用(30% H2O2:concentrated H2SO4 1:3)清洗，利用Milli-Q水洗淨，利用 氮氣吹乾，合成好之DTBA-PBA 配置成 1mM 溶液(THF：methanol 9:1)，將鍍金的 玻璃基材放置在DTBA-PBA溶液中，Overnight，再利用甲醇及氮氣將其洗淨吹乾即 可。透過Contact angle、ATR-FTIR表面元素官能基的觀察、SEM 元素分析(EDS)、ESCA 表面元素分析及SPR定量偵測醣化血紅素的準確性的探討。 Au THF:Methol = 9:1 血液標準品檢測： 來源：NGSP(PRIMUS)相對糖化程度為 5.9%及 20.3%，實驗組: 相對糖化程度為 4.9%~5.7%及 9.4%~10.6%(中國醫藥大學)，先利用 UV 偵檢器在 405nm 建立總蛋白 濃度(total protein ; ug/ml ) ， 藉以調整至各分析樣品中其 total protein 的量相等，取 20ul 進行 SPR 分析，沖提液 (carry buffer)為 50M 的 PBS，pH=9，脫附液(wash buffer) 為 1M HCL。

(三) 結果與討論：

本研究有關於合成硼酸分子方面，經由合成後的 DTBA-PBA 混合 KBr 壓片透過 FTIR 及 ATR-FTIR 對官能基的觀察，可知位於 1662 及 1691cm-1(C=O,Amide)的波長 及 1431cm-1（C-N,Amide），顯示合成的兩化合物已經以生肽鍵鍵結。圖二中亦可看 出化合物粉末官能基特徵峰及金膜改質後 , 再經由表面改質後的金膜表面官能基特 徵峰的比較圖 , 皆與合成後之硼酸分子相同 , 此一結果可以說明改質後的金膜上有 一層自我組裝之硼酸分子層. 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 (C-N) 1431 (C=O) 1663 (CH₂) 2922 Abs Wavenumber ( cm-1 ) 圖二、金膜改值後表面官能基特徵峰及粉末 FTIR 比較圖 接觸角量測 透過接觸角的量測得知(表一)，發現裸金時接觸角為 84.50± 1.97o ，改質之後表 面官能基露出 –COOH 其接觸角轉為親水而下降成 50.8 ± 2.16o_{，當官能基轉成PBA} 分子時，因PBA分子具有一環烷基較 –COOH 基來的疏水，因此接觸角轉為疏水而 上升成 63.3 ± 1.03o SEM 元素分析(EDS) 透過 SEM 的表面元素分析得知圖三，改值過後的金基材表面之 DTBA-PBA 分佈 的相當均勻。

ESCA 表面元素分析 透過 ESCA 的表面元素分析得知，改值過後的金基材表面之各元素所佔百分比 如表二，其中金元素及硼元素之相對比例更高達 40.7%。這顯示改質後的硼酸分子以 自組裝的方式緊密的排列成一單分子層。從這些結果我們可以說在晶片製作及改質方 面，已經可以達到最佳化程序，並且可以建構出一相當均勻之硼酸分子單分子層。 表一、表面不同官能基所得之接觸角角度

圖三、SEM EDS Mapping 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 C o u n ts / s

Binding Energy (eV) SURVEY Au 5p3 Au 4f7 Au 4f N 1s B 1s C 1s S 2p3 O 1s

12.85

Au

16.36

O

6.39

S

53.73

C

5.23

B

5.43

N

At. %

Element

表二、ESCA 的表面元素分析

SPR 定量偵測醣化血紅素 靈敏度的表現(圖四) 因為 SPR 儀器只能偵測到糖化血紅素 , 非糖化的部份並不能測到 , 因此換算成 一次注入分析的 total 糖化蛋白質的濃度來當靈敏度 ,因為斜率為 1.4038 ( 度/ ug ) 儀器的解析度理論可達 0.001 度 , 理論上只要注入溶液中具有 0.01 ug 的糖化蛋白質 即可使角度改變 0.0014 度。

y = 1.4038x + 0.0028

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0

0.01

0.02

0.03

0.04

HbA1c(ug)

angl

e

sh

if

t

圖四、糖化血紅素分析量與共振角偏一輛之關係 準確率的探討

SPR method v.s. Affinity HPLC method

SPR method ：針對糖化血紅素部份來做偵測，並不能偵測出非糖化血紅素部分，所 需樣品原始濃度(0.01 ug/ml)。 HPLC affinity method：可針對糖化及非糖化血紅素偵測，但所需樣品原始濃度 (1mg/ml)。 兩者比較方法：因為提供之樣品數可以利用 UV 來檢測其原始總蛋白質，因此可以理 論計算出真正注入的糖化血紅素的量，因此可以利用注入糖化部份的血紅素量來作溝 通的橋樑，可以從圖五中看出當注入分析樣品的糖化血紅素量超過 1ug ( 就是 total protein 為 1.05mg/ ml 取 20ul 來分析 ) 時，是適用 Affinity HPLC 的分析方式，但 當注入分析樣品的糖化血紅素量小於 0.03ug ( 就是 total protein 為 10.6ug/ml 取 20ul 來分析 )，是適用 SPR method 來分析。SPR method 可將偵測極限提升 100 倍。再者 對於線性迴歸分析來說，SPR 方法所能解釋之檢測量更準確於 Affinity HPLC 方法 (SPR 方法 R 值高達 0.95 ， P <0.0001；Affinity HPLC 方法 R 值達 0.89 ， P <0.0001 )。因此就兩方法之比較 SPR 較適合用來檢測低濃度的糖化血紅素，這意味著

採血量應可低至現行檢測系統的 1/100，亦可檢測出糖化血紅素的量，來作為是否罹 患糖尿病的參考依據。 0.00 0.01 0.02 0.03 1 2 3 4 5 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 4 6 8 10 12 14 16 18 20 % ang le s h if t HbA1c(ug) SPR HPLC 圖五、SPR 檢量線 v.s. Affinity HPLC 再利用 Langmuir 等溫吸附模式來描述固液兩相間溶質吸附之溶質平衡分佈數學 關係式：其有三點假設:（1）吸附劑表面每一位置可吸附一分子，即單層吸附。（2） 所有吸附位置對被吸附分子具相當之親和力，即吸附能量為常數。（3）被吸附物與吸 附物質間沒有交互作用。由 Langmuir equation 可得知在一定溫度下溶質在溶液中之濃 度及溶質之吸附量。典型 Langmuir 等溫吸附模式如圖六 公式推導： k1 A + B

⇔

AB k2

兩相達到平衡時，及吸附速率等於脫附速率

k

2

q=k

1

(q

m

-q)C

C k k C q q m + = 1 2 m m C q k k q q 1 ] [ 1 1 2 1 + = max max 1 ] [ 1 1 q C Ka q q = +

q：吸附劑表面之吸附量(angle shift)

qm：吸附劑表面之飽和吸附量(angle shift)

C：平衡濃度[M]

Ka：吸附常數[M

-1

]

圖六、Langmuir Isotherm特性曲線

0 0.02 0.04 0.06

0 2E-08 4E-08 6E-08 8E-08

M angl e shi ft 圖七、實驗的平衡吸附曲線 再比較實驗的平衡吸附曲線圖七，發現其吸附曲線相似，再利用Langmuir plot 來看其 吸附倒數對濃度倒數作圖，發現其揉合曲線為一直線圖八，這表示此實驗條件下(1) 其吸附機制較相似表面每一位置可吸附一分子，即單層吸附，(2)所有吸附位置對被吸 附分子具相當之親和力，即吸附能量為常數。（3）被吸附物與吸附物質間較無交互作 用，且親和常數(Ka)高達 5.03 × 107M-1，亦顯示其晶片具有一定的特異性，可供辨識 溶液中糖化血紅素。

y = 3E-07x + 15.093

0

50

100

150

0.00E+00

1.00E+08

2.00E+08

3.00E+08

1/M

1/

angl

e

sh

if

t

圖八、Langmuir plot 晶片的再生性的探討 一個優良的生物晶片都除了具有專一性外，最好能具有可重複使用的優點，而 本研究亦對相關特性作深入的探討，我們可以從圖九中看出相同的實驗下(注入分析 的樣品中含有 0.05ug 的糖化血紅素)，同一片晶片的脫附率從 89%降到 50%最後脫 附率則只剩下 35%，因此對於一個可重複檢測晶片的設計，本研究研發之晶片在未 來能是具有相當發展之潛力的，就現階段而言，本研究所研發之晶片則是一個準確 率相當高的拋棄式生物感測晶片。

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050 0.055 20 40 60 80 100 120

Surface Plasmon Resonance Angle Shift

A ngl e S h if t( D eg) Time(min) 圖九、晶片的再生性

四、結論

1、晶片製作及改質方面，已經可以達到最佳化程序，並且可以建構出一相當均勻之 硼酸分子單分子層。 2、儀器的解析度及靈敏度可達 0.001 度及注入分析樣品總糖化血紅蛋白達 0.01ug 即 可分析。 3、SPR 方法所能解釋之檢測量更準確於 HPLC 方法(SPR 方法 R 值高達 0.95 ， P <0.0001；HPLC 方法 R 值達 0.89 ， P <0.0001 )。因此就兩方法之比較 SPR 較 適合用來檢測低濃度的糖化血紅素，這意味著採血量應可低至現行檢測系統的 1/100，亦可檢測出糖化血紅素的量。 4、其吸附機制較相似表面每一位置可吸附一分子，即單層吸附，(2)所有吸附位置 對被吸附分子具相當之親和力，即吸附能量為常數。（3）被吸附物與吸附物質間 較無交互作用，且親和常數(Ka)高達 5.03 × 107 M-1，亦顯示其晶片具有一定的特 異性。 5、本研究所研發之晶片則是一個準確率相當高的拋棄式生物感測晶片。

五、參考文獻：

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