噬菌體呈現技術在生物檢體檢測之應用
楊文仁
國立高雄大學生物科技研究所摘要
噬菌體呈現技術可將目標蛋白或任意肽連接於絲狀噬菌體的外套蛋白 (coat protein) 上，使得外源蛋白質得以融合蛋白方式呈現於噬菌體表面。近幾年 來，使用噬菌體呈現系統配合篩選的技術，改變了我們傳統上研究分子間(特別 是蛋白質)相互作用之方法，生物分子間的交互作用正是檢體檢測的基礎，噬菌 體呈現技術在生物檢體檢測及其他生物科技領域的應用極具潛力。前言
自從 1985 年 George P. Smith 首先成功地將外源蛋白質表達於絲狀噬菌體外 套蛋白上以來，噬菌體呈現技術已有極為廣泛的應用。此技術最大的兩個優點為 (1)經由簡單的親和性篩選方法，可以從大量的呈現不同蛋白序列的噬菌體中選 取到專一性的配位體。(2)可自噬菌體基因組決定外插蛋白之 DNA 序列，並推導 出呈現在噬菌體表面之目標蛋白質的結構與功能資訊。基本上來說，任何有關分 子間的辨識，特別是蛋白分子間之作用，均可使用噬菌體呈現技術予以解決。噬 菌體呈現技術之應用範圍極廣，包括抗體工程、酵素設計、新藥開發、疫苗研發、 疾病診斷及檢測上之應用。本文將針對此技術之研發及其在生物檢體檢測方面之 應用情形加以介紹。一、 絲狀噬菌體
噬菌體為感染細菌的一類微生物，相當於感染動植物細胞的病毒一樣。噬 菌體的種類繁多，其中一類稱之為絲狀噬菌體(filamentous phage)，主要包括 fd、 f1 及 M13 噬菌體。絲狀噬菌體形狀呈細絲狀，直徑約 6.5 nm，長約 900 nm，具 單股環狀 DNA genome。在 M13 噬菌體長約 6.4 kb 的基因組序列中，包含 10 種 與複製、型態、外套形成有關的蛋白質(表一)。此噬菌體只感染帶有 F- episome 的細菌，如圖一所示，絲狀噬菌體藉著其外套蛋白 gp3 (基因 3 的產物)吸附於細 菌纖毛(pilus)的尖端，來啟動其感染週期，將其單股 DNA(ssDNA)經由纖毛導入 細菌細胞中。噬菌體以此正股 ssDNA 為模板，合成負股 DNA，而成為具有複製 能力的雙股 DNA(replication form，RF DNA)。RF DNA 是噬菌體合成 mRNA、 DNA 複製及 progeny ssDNA 之模板。Progeny ssDNA 為噬菌體之 genome，不在 細胞內組合成噬菌體，而是在突破細菌細胞膜時，取得黏附於其上的幾種噬菌體外套蛋白，包括數千個形成陣列排列的 gp8 蛋白分子及其他四種次要外套蛋白 (minor coat proteins)，包括 5 個位於噬菌體尾端的 gp3 蛋白分子，而產生新的噬 菌體。絲狀噬菌體自細胞釋出時，並不將細菌細胞破壞分解，因此這類噬菌體稱 之為溫和型(temperate)噬菌體。當細菌複製時，會製造形成噬菌體顆粒所需的所 有蛋白質。細菌的每一代可產生 100 ~ 300 個噬菌體。 表一 M13 噬菌體的各個組成蛋白之胺基酸數目、分子量及功能 蛋白質 胺基酸數目 分子量(kd) 功能 I 348 39.5 assembly II 410 46.1 DNA replication
III 406 42.5 minor coat protein
IV 405 43.5 assembly
V 87 9.7 binding ssDNA
VI 112 12.3 minor coat protein
VII 33 3.6 minor coat protein
VIII 50 5.2 major coat protein
IX 32 3.7 minor coat protein
噬菌體的 gp8 蛋白是主要的外套蛋白，在噬菌體表面約有 2700 個 gp8 蛋白 分子，每一個 gp8 蛋白由 50 個胺基酸組成，其 C 端的鹼性區域連接到噬菌體的 DNA，中間疏水性區域為 gp8 次單位間交互作用所需，N 端的酸性區域則朝外。 噬菌體與細菌吸附之一端由次要外套蛋白 gp3 及 gp6 組成，另一端則由 gp7 及 gp9 蛋白組成，每一蛋白約有 3~5 個分子。gp3 蛋白之分子量為 43 kDa，以類似 火柴棒的形狀存在，其 N 端含有 18 個胺基酸的引導序列(leader sequence)。就其 功能而言，可分成三個區域(domains)：N 端區域包括負責辨認 F 纖毛及穿透作用 (penetration)，C 端區域位在噬菌體外鞘(envelope)內，與型態形成(morphogenesis) 及膜的鑲嵌(anchorage)有關。這些區域之間以富含 glycine 的胺基酸片段相連接， gp3 吸附蛋白與噬菌體之感染能力息息相關。
二、 噬菌體呈現技術的發展
Smith 首先證明可將外源基因接合至外套蛋白 gp3 及 gp8 基因之 N 端，而不 影響其感染力。他將二種不同酵素基因接合至 gp3 的基因，並呈現在噬菌體表 面，而此重組噬菌體可與此二種酵素之抗體產生交互作用(Smith., 1985)。基於此 實驗，其它實驗室發展出呈現各種長短不同的噬菌體呈現肽庫，並成功地運用 到抗原決定位圖譜分析(epitope mapping)及蛋白質配位體(ligand)的確認。在 1990 年，英國 Medical Research Council (MRC)的 McCafferty 等人，首先 應用噬菌體呈現技術，將 anti-lysozyme antibody D1.3 的抗體變異區(VH/VL)基
因，以 flexible linker (Gly4-Ser)3之基因連接至 phage vector (fd CAT1)中，以單鏈
變異區片段(single chain Fv, scFv)的方式呈現於噬菌體上，模擬抗體之結構與功 能，而取得了噬菌體呈現的抗體，稱為噬菌體抗體 (phage antibody)，並以 Western 分析加以證實(McCafferty et al., 1990)。在 1991 年，Clackson 等人進而以半抗原 (hapten) 2-phenyloxazol-5-one (phOx)免疫小鼠，以 RT-PCR 選殖出小鼠的抗體基 因，並將此基因利用噬菌體呈現技術表達於 fd 噬菌體的外套蛋白，構築成第一 個噬菌體呈現抗體庫(Clackson et al., 1991)。直到如今，英國的 MRC 在 phage display 技術仍居於領先地位，並且還提供 phage-displayed antibody library 供學術 界做研究。
噬菌體呈現技術也被用在非絲狀噬菌體例如(Dunn., 1995)、T4 (Jiang et al.,
1997)等噬菌體上。相對於絲狀噬菌體，呈現外源肽或蛋白質於表面似乎更
引人注意。因為噬菌體是在 E. coli 的 cytosol 內進行組裝，將 E. coli 裂解(lysis) 而釋出新的噬菌體。因此，呈現在其表面之蛋白質，不需運送到胞膜附近，進行
折疊與組裝。目前，主要呈現外源蛋白於的尾部蛋白 gpV 及頭部蛋白 gpD 上。
雖然噬菌體呈現系統具有上述優點，但是到目前為止，以系統呈現外源蛋白之 例子仍相當有限。
三、 噬菌體呈現系統的型式
噬菌體呈現技術主要使用二種不同的載體系統。一種是噬菌體系統，標的 蛋白的基因序列被選殖到 gp3 或 gp8 基因的引導序列與編碼區域(coding region) 之間。因此只有 gp3 或 gp8 融合蛋白被呈現，稱為 3 型或 8 型(圖二)；另一系統 是噬質體(phagemid)系統，此載體只含 gp3 或 gp8 基因、細菌及噬菌體的複製起 始點。因此，若要產生新的噬菌體，尚需要靠輔助噬菌體(helper phage)提供組成 完整噬菌體所需之蛋白質才能達成。因為輔助噬菌體提供野生型的 gp3 及 gp8， 因此，野生型及融合蛋白混合呈現在噬菌體表面(圖二)，稱為 3+3 型或 8+8 型。 噬質體系統不但可提昇噬菌體的感染力及製造效率，在呈現較長序列時，主要以 單價(monovalent)的形式呈現，有利於高親和性配位體的篩選。當以噬菌體系統 取代上述噬質體系統時，野生型及融合基因同時存在噬菌體基因組中，呈現出來 的重組噬菌體稱為 33 型或 88 型(圖二)。8+8 或 88 型系統可以負載約 50 kDa 的 融合蛋白，而 8 型系統只能攜帶 5 ~ 6 個胺基酸(Smith and Petrenko, 1997)。呈現在噬菌體表面之外源肽可分為 constraint 及 unconstraint 兩種。 constraint 的形式是在外源肽兩端分別接上一個 cysteine，而形成雙硫鍵結，使 得外源肽以立體構形呈現，但可彎曲性(flexibility)較 unconstraint 差。因為外源 肽以立體構形呈現，所以從 constraint 肽庫篩選出來之 clones 較 unconstraint 者具有較高的親和力。目前噬菌體呈現的外源肽長度可達 38 個胺基酸。然而， 由 6 個逢機的胺基酸序列可產生 6.4 × 107不同的序列變異度；而 12 個逢機的胺 基酸序列可產生 4 × 1015不同的序列變異度。目前，噬菌體呈現肽庫的大小僅 能達到約為 108 ~109不同的變異度之 clones。因此，大於 7 個胺基酸序列所形成 的噬菌體呈現肽庫，暫時無法涵蓋所有的可能序列。
四、 噬菌體呈現肽庫
(peptide library)及抗體庫
(antibody library)的建構
以建構外源肽庫呈現於 M13 外套蛋白 pIII 之 N 端為例，隨機的外源肽 的表達是藉由將 degenerated oligonucleotides 接合到 pIII 的基因中。如圖三所示， 主要包括下列步驟：(1) degenerated oligonucleotides 的合成及酵素切割；(2) M13 載體 DNA 之製備及酵素切割；(3)將酵素切割過之 degenerated oligonucleotides 與 M13 載體 DNA 接合；(4)將接合質體以電穿孔法轉殖入 E. coli 中；(5)複製並 回收純化所得之肽庫。噬菌體呈現抗體庫的形式主要有呈現抗體之 scFv 及 Fab 片段兩種。以建構 呈現在 pIII 蛋白之 scFv 抗體庫為例(圖四)，首先從 B 細胞中製備抗體重鏈及輕 鏈變異區基因的 mRNA，進行反轉錄作用，合成單股 cDNA，以 PCR 將其基因 放大，再以 DNA 接合片段(linker)將重鏈及輕鏈變異區基因組合成 scFv 片段。利 用限制酵素切割後，接合到噬質體上。將此重組之噬質體轉殖到 E. coli 中，培 養帶有噬質體之細菌，並以輔助噬菌體(例如 KO7)感染，來量產呈現 scFv 抗體 片段之重組噬菌體，進而建構成噬菌體抗體庫(Azzazy and Highsmith, 2002)。噬 菌體呈現抗體庫比起以融合瘤技術生產單株抗體具有下列優點：(1)省去大量的 細胞培養；(2)減少或免除動物的免疫注射；(3)無需進行費時又費力的大量細胞 篩選步驟；(4)更適用於不具免疫性的抗原或毒性抗原；(5)具有穩定的遺傳特性， 可彌補融合瘤遺傳特性不穩定的缺點。
五、 篩選策略
噬菌體呈現庫中存在大量不同序列之特定配位體，可以藉由親和性作用篩選 出來。其過程宛如從金砂礦中淘金一般，而將此篩選過程(圖五)稱為生物掏洗 (biopanning)。 圖五 Biopanning，利用噬菌體呈現庫與餌之親和力篩選實驗過程 (取材自 Clontech 公司)。 由於 gp3 分子較少，用 gp3 融合呈現系統可以篩選出與目標物較具親合力 (affinity)片段；相對的，gp8 分子較多，因此適用篩選具結合力(avidity)片段。任 何可以區分接合與非接合噬菌體的方法，均可做為篩選的方法。用於噬菌體呈現抗體庫的篩選策略包括：將抗原固定在固體支撐物、管柱或 BIAcore sensor chips 上；使用生物素(biotin)標定的抗原；在細胞上或活體動物直接做篩選；利用 FACS (fluorescence activated cell sorting)進行 subtractive 篩選；在組織切片上或在蛋白 質轉印過的硝化纖維紙上進行篩選；利用 biotin tyramine 做為拓荒者分子 (pathfinder molecule) 來 標 定 抗 原 或 以 選 擇 性 感 染 噬 菌 體 (selectively infective phage, SIP)進行篩選(Hoogenboom et al., 1998)。
六、 在生物檢體檢測之應用
生物檢體之檢測常需藉助一些生物標記(biomarker)才能更準確專一地偵測 到待測標的，以下舉例說明如何應用噬菌體呈現技術於尋找可能的致病因子、疾 病標記及改進疾病檢測之方法。 1. 經由 epitope 之研究找尋疾病之致病因子 多發性硬化症(multiple sclerosis, MS)病人的腦脊髓液中已知含有高濃度的 oligoclonal antibodies，但其與疾病之關係尚未清楚。Cortese 等人利用噬菌體呈 現肽庫與 MS 病人們的腦脊髓液進行 biopanning，發現有一個共同的 motif KPPNP，進一步分析許多 neurotropic 病毒的蛋白質序列發現，在 HSV-1 的表面 醣蛋白 gB 上有此 epitope 存在，而且此 gB 蛋白能與 MS 病人的抗體發生反應， 進而推測 HSV-1 可能是引發 MS 病人腦脊髓液中 oligoclonal antibodies 的之因子 (Cortese et al., 2001)。 2. 疾病生物標記之研究 由於缺乏疾病專一性的生物標記，使得某些疾病的檢測並不容易。例如各種 癌症的生物標記，更是科學家們極力研究的對象。Somers 等人利用結腸直腸癌 (colorectal cancer)細胞株 HT-29 的 cDNA 建構噬菌體呈現肽庫與許多抗血清反 應，快速地找出 19 個 clones，經測試發現值得作為結腸直腸癌的抗原標記，具 有開發成為診斷試劑、疫苗或偵測探針的潛力(Somers et al., 2002)。 3. 使用 epitopes 或 mimotopes 改進疾病之檢測 利用篩選與疾病相關之特定噬菌體呈現肽來改進疾病之檢測，Folgori 等 人提出了三步驟篩選策略：(1)先以一個與疾病具有專一性結合的血清對噬菌體 呈現肽庫進行親和性篩選；(2)以其他病人血清對步驟(1)所得之肽做進一步 篩選；(3)將步驟(2)所得之肽與正常人的血清做篩選(Folgori et al., 1998)。經由 上述策略，Minenkova 等人已經得到一些與 C 型肝炎病毒具有專一性之肽序 列，並用於血清中 HCV 抗體之檢驗(Minenkova et al., 2001)。Kouzmitcheva 等人 則利用許多萊姆病(Lyme disease)病人之血清對 12 個噬菌體呈現肽庫進行親和 性篩選，確定了 17 個肽能與至少三個病患血清反應，而不會與正常血清作用， 確立其在檢驗方面的應用價值(Kouzmitcheva et al., 2001)。結語
由於可以直接從噬菌體的基因序列，推導出其所呈現的肽；容易將篩選所 得的噬菌體予以增殖放大；可藉由 in vitro 或 in vivo 的篩選方式得到感興趣的 肽或蛋白質，使得此技術在生物科技的應用非常廣泛。在抗體工程方面，噬菌體 呈現抗體庫也為單株抗體帶來了衝擊性的影響；在酵素設計方面，許多功能尚未 明瞭的蛋白質，或是難以確定活性位置的酵素，都能夠利用噬菌體呈現肽的特 性，克服其困難。藉由更精確明瞭蛋白質間的交互作用，來提昇已知酵素的活性 或做為研究酵素的作用機制。在醫藥應用方面，以篩選所得的肽可做為 lead compounds，可進一步加速藥物開發的過程；從噬菌體呈現肽/抗體庫篩選所得 肽/抗體，可替代某些昂貴或不易取得之抗原/抗體分子，做為醫學診斷、檢驗、 治療及疫苗研發之用。現在已經進入了蛋白體研究的世代，利用噬菌體呈現抗體 庫在蛋白質晶片的應用上將具有極大的潛力(Stich et al., 2003)。可以預期的，噬 菌體呈現技術在生物科技各領域的應用將越來越廣泛。參考文獻
Azzazy, H.M.E. and Highsmith, W.E. Jr. 2002. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clin. Biochem. 35:425-445.
Clackson, T., Hoogenboom, H.R., Griffiths, A.D. and Winter, G. 1991. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 352:624-628.
Cortese, I., Capone, S., Luchetti, S., Cortese, R. and Nicosia, A. 2001. Cross-reactive phage-displayed mimotopes lead to the discovery of mimicry between HSV-1 and a brain-specific protein. J. Neuroimmunol. 113:119-128.
Dunn, I. S. 1995. Assembly of functional bacteriophage lambda virions incorporating COOH-terminal peptide or protein fusions with the major tail protein. J. Mol. Biol. 248:497-506.
Folgori, A., Luzzago, A., Monaci, P., Nicosia, A., Cortese, R. and Felici, F. 1998. Identification of disease-specific epitopes. Methods Mol Biol. 87:195-208.
Hoogenboom, H.R., de Bruïne, A.P., Hufton, S.E., Hoet, R.M., Arends, J-W. and Roovers, R.C. 1998. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology 4:1-20.
Jiang, J., Abu-Shilbayeh, L. and Rao, V.B. 1997. Display of a PorA peptide from
Neisseria meningitidis on the bacteriophage T4 capsid surface. Infect. Immun. 65:
4770-4777.
Kouzmitcheva, G.A., Petrenko, V.A. and Smith, G.P. 2001. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8:150-160.
McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. and Chiswell, D.J. 1990. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348:552-554. Minenkova, O., Gargano, N., De Tomassi, A., Bellintani, F., Pucci, A., Fortugno, P.,
Fuscaldi, E., Pessi, A., Rapicetta, M., Miceli, M., Iudicone, P., Cortese, R., Felici, F. and Monaci, P. 2001. ADAM-HCV, a new-concept diagnostic assay for antibodies to hepatitis C virus in serum. Eur. J Biochem. 268:4758-4768.
Smith, G..P. 1985. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315-1317.
Smith, G..P. and Petrenko, V.A. 1997. Phage Display. Chem. Rev. 97:391-410.
Somers, V.A., Brandwijk, R.J., Joosten, B., Moerkerk, P.T., Arends, J.W., Menheere, P., Pieterse, W.O., Claessen, A., Scheper, R.J., Hoogenboom, H.R. and Hufton, S.E. 2002. A panel of candidate tumor antigens in colorectal cancer revealed by the serological selection of a phage displayed cDNA expression library. J. Immunol. 169:2772-2780.
Stich, N., van Steen, G. and Schalkhammer, T. 2003. Design and peptide-based validation of phage display antibodies for proteomic biochips. Comb. Chem. High Throughput Screen. 6:67-78.
