聲頻調變顯微鏡的發展

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(1)♁ 國立中山大學光電工程研究所碩士論文. 聲頻調變顯微鏡的發展 Development of Acoustic Modulation Microscopy. 研究生：王宗棋撰指導教授：高甫仁博士. 中華民國九十五年五月.

(2) 致謝不知不覺來到中山大學已經快兩年了，在這兩年內遇到很多事情得到很多寶貴的經驗，認識了很多朋友。這篇論文獻給我的爸媽及我的家人，感謝他們在這兩年無怨無悔的支持我、鼓勵我，讓我做我想要做的事情，也感謝我的指導教授高甫仁博士，感謝老師這兩年不厭其煩的討論與指導，同時也要感謝前一屆的學長們，俊豪、合哲、松梭、鵬翔及一鈞等人的照顧及教導，尤其是俊豪學長，在我的實驗上給我很大的建議及幫助，也感謝同學育麒、耀慶、天佑及文哥哥在我有疑問的時侯給我新的想法及思考，也感謝我的學弟們，佳謙、宏嘉、立偉、泰成、仁里及聖懿帶給我歡笑及娛樂。. 最後祝福大家永遠健康快樂王宗棋于 2006 年 5 月.

(3) 中文摘要在本實驗上，我們已經成功的發展架設聲頻調變顯微鏡，這一套實驗是以雷射共焦顯微鏡當作基礎，操作範圍從 Hz 到 kHz。利用結合差動共焦和鎖相迴路系統進而偵測亞微子振盪的產生。用本實驗架構，機械特性，如彈性、硬度，可以以二維的影像所產生。. 關鍵字：聲調變，壓電致動器，顯微鏡，鎖相偵測器. I.

(4) Abstract In this study, we have successfully developed an acoustic modulation microscopy that is based on a laser scanning confocal microscopy and operates in the range of a few tens of kilohertz. The induced submicron oscillation is detected through the combination of differential confocal microscopy and lock-in circuit. In this way, the mechanical properties, such as elasticity and stiffness, can be mapped in a two-dimensional way rapidly.. Keywords: Acoustic modulation, PZT, microscopy, lock-in detection. II.

(5) 目錄中文摘要. Ⅰ. 英文摘要. Ⅱ. 目錄. Ⅲ. 圖目錄. Ⅳ. 第一章實驗簡介. 1. 1.1 實驗背景. 1. 1.2 實驗動機. 1. 第二章實驗理論. 4. 2.1 頻域之相位調變. 4. 2.2 差動共焦顯微術. 7. 第三章實驗儀器與架設. 13. 3.1 實驗架設. 13. 3.2 實驗設備. 14. 3.2.1 壓電致動器. 14. 3.2.2 針孔. 20. 3.2.3 鎖相放大器. 21. 3.2.4 可變式電流掃描. 23. 3.2.5 調變顯微鏡. 24. 第四章實驗結果與討論. 26. 4.1 實驗結果. 26. 4.2 實驗討論. 42. 第五章實驗結論及未來展望. 44. 5.1 實驗結論. 44. 5.2 未來展望. 44. 附錄：光碟片不同電壓下強度與反應時間曲線. III. 46.

(6) 圖目錄第二章圖 2-1 頻域相位調變. 4. 圖 2-2 共焦顯微術的縱向反應曲線及線性區. 8. 圖 2-3 縱向反應曲線線性區訊號變化. 9. 第三章圖 3-1 實驗架構圖. 13. 圖 3-2 極化元素. 15. 圖 3-3 壓電效應. 16. 圖 3-4 壓電陶瓷變形效應. 17. 圖 3-5 壓電致動器構造運動方式. 18. 圖 3-6 積層型壓電致動器. 18. 圖 3-7 積層型壓電致動器之結構. 18. 圖 3-8 針孔與透鏡聚焦點共焦結合. 20. 圖 3-9 鎖相放大器函數方塊圖表. 21. 第四章圖 4-1 二種不同聚焦物鏡之訊號強度與位置的關係圖. 26. 圖 4-2 不同頻率下壓電致動器表面影像（CH1）. 28. 圖 4-3 不同頻率下壓電致動器表面影像（CH2）. 29. 圖 4-4 壓電致動器在不同頻率下的調變. 30. 圖 4-5 壓電致動器在不同頻率下的反應時間. 30. 圖 4-6 不同電壓下光碟片表面影像變化（CH1）. 32. 圖 4-7 不同電壓下光碟片表面影像變化（CH2）. 33. 圖 4-8 不同電壓下光碟片表面強度變化. 34. 圖 4-9 光碟片不同電壓下強度曲線變化. 35. IV.

(7) 圖 4-10 光碟片不同電壓下反應時間曲線變化. 35. 圖 4-11 校正片在顯微鏡下的影像. 37. 圖 4-12 鎖相放大器輸出之校正片 X，Y 影像. 37. 圖 4-13 校正片高度變化影像. 38. 圖 4-14 校正片橫軸 150 的高度變化值. 38. 圖 4-15 校正片橫軸 150 之 5 個位置高度變化圖. 39. 圖 4-16 鎖相放大器輸出之光碟片 X，Y 影像. 40. 圖 4-17 光碟片高度變化影像. 41. 圖 4-18 校正片橫軸 150 的高度變化值. 41. 圖 4-19 光碟片橫軸 350 之 5 個位置高度變化圖. 42. 第五章圖 5-1 新實驗架構圖. 45. V.

(8) 第一章實驗簡介 1.1 實驗背景在 1957 年，Marvin Minsky 創造了“共焦顯微術” 這個想法[1.1] 而且在 1961 年取得共焦顯微術研究的專利權[1.2]，當電腦及雷射的出現[1.3]，雷射掃描共焦顯微術（Laser scanning confocal microscopy LSCM）[1.4]變成一項非常有力的工具，甚至超越傳統的顯微術。共焦顯微術可以有效的消除在聚點點外的雜點而且取得較高的解析度，也可以以非侵入的方式來獲得生物細胞的三維（3D）的光學剖面圖。也可以消除時間對掃描影像的影嚮，從活的生物細胞樣本所得到具有超高空間解析度的三維光學影像開啟了在顯微技術上全新的視野。共焦顯微術現在被廣泛應用在生物學、生理學、病理診斷學和材料科學。在近代光子技術的發展上，共焦顯微術將會有很大的可能在更進一步的發展。. 1.2 實驗動機雷射掃描顯微術在各種研究上有重要的技術。基本的工作原理為將一個聚焦的雷射當做光源經由掃描機構，像是電流計鏡或是移動片台，在樣本上做點對點的方式掃描。樣本影像的對照可以來自於反射光、螢光、非線性倍頻光及光電流等…。然而一般顯微鏡的低畫面速率（～1 frame/second）可以提供力學性質的觀察。例如，反應時間、堅硬度等…，樣本無法直接呈現出來的結果。本實驗然證明我們所提出的另外一種可以實現的方法，藉著將調變技術、差動共焦顯微術[1.5]和鎖相電子儀器結合在掃描影像系統。特別的是，樣本的機槭反應將會被繪製成影像。調變技術和相位偵測有很廣泛的應用在電子方法及訊號處理裝置，鎖相偵測器就是一個眾. 1.

(9) 所皆知的例子。因此訊雜比將大大的提高而且可以從相位延遲與調變的相關性推斷出對比訊號的時間反應。很多的機槭特性也可以從時間反應的特徵所推斷出來。. 2.

(10) References [1.1] C. J. R. Sheppard et al, “Confocal laser scanning microscopy” Springer (1997). [1.2] M. Minsky, U. S. Patent No.3, 013, 467, Dec. 19 (1961). [1.3] H. Mocker et al. “Mode competition and self-locking effects in a Q-switched ruby laser” Appl. Phys. Lett. 7, 270 (1965). [1.4] T. H. Maiman, Nature 187, 493 (1960). [1.5]李超煌, “差動共焦顯微術及其應用” 國立台灣大學電機工程學研究所博士論文, 民國 86 年.. 3.

(11) 第二章實驗理論 2.1 頻域之相位調變. 圖 2-1 頻域相位調變. 在各種測量反應時間 (τ ) 的方法裡面，我們最常使用的方法之一就是相位調變（Phase-modulation）[2.1]。反應時間 (τ ) 可以藉由相位平移（phase shift）(θ ) 和調變係數（modulation factor）(R ) 來推論計算出來。在這之前是由 Gaviola 在 1926 年開創的[2.2]，相位調變在化學、物理及生物化學上的應用有著相當可靠的處理能力[2.3-8]。數學模型由以下來推導：訊號產生器（Function generator） (S d ) 產生一個以正弦波型式為主的驅動訊號（Driving signal） [2.9]。 S d (t ) = a sin wt + b. (2.1). a 為驅動訊號的振幅。 a / b = RS 為訊號的調變，因為訊號強迫在相同的. 頻率上做出響應，所以在驅動訊號跟反應訊號（response signal）之間有相位平移跟調變的不同，因此反應訊號對於驅動訊號有時間相關性上的延遲，故應訊號 (S r ) 可以被表示為 4.

(12) S r (t ) = A sin( wt − θ ) + B. (2.2). 由上式可看出反應訊號是在相同的頻率下，但是不同的相位平移 (θ ) 和不同的振幅 ( A)，所以可以藉由反應時間 (τ )、相位平移 (θ ) 及調變 (R ) 做出樣本的相關性。假設樣本振幅的變化就像是單一指數衰減 I (t ) = I 0 exp(− t ). τ. (2.3). τ 表示樣本的反應時間。對於單一指數衰減而言，時間相依強度可以. 被描述成下面的微分程式 dI (t ) 1 = − I (t ) + S d (t ) τ dt. (2.4). 將(2.2)式代入到(2.4)式，可以得到 ωB cos(ωt − θ ) = −. 1. τ. [A sin (ωt − θ ) + B] + a sin ωt + b. (2.5). 這個方程式必須在每一次都有根據。 a 、 b 、 A 、 B 及反應時間 τ 之間的關係，我們可以藉著擴展正弦方程式及餘弦方程方來得到，根據常數項相等、正弦項及餘弦項，可以得到 ⎛1⎞ b − ⎜ ⎟B = 0 ⎝τ ⎠ ⎛1⎞ ω cosθ − ⎜ ⎟ sin θ = 0 ⎝τ ⎠ a ⎛1⎞ ω sin θ + ⎜ ⎟ cosθ = A ⎝τ ⎠. (2.6) (2.7) (2.8). 從(2.7)式子，可以得到一個很熟悉的關係式 sin θ = tan θ = ωτ cosθ. 5. (2.9).

(13) 將(2.7)式及(2.8)式平方，之後在將兩式相加，我們可以得到 2. ⎛1⎞ ⎛ a ⎞ ω +⎜ ⎟ =⎜ ⎟ ⎝τ ⎠ ⎝ A ⎠. 2. 2. (2.10). 又根據(2.6)式，知道 B = bτ ，可以得到 R=. (A B ) = (1 + ω τ ) (a b ) 2. 1 2 − 2. (2.11). 這就是反應時間跟調變係數的一般關係式。我們也可以選擇使用捲積（Convolution）積分來推導。利用(2.1) 式跟脈衝反應方程式(2.3)式做捲積，可以得到時間相依強度 I (t ) ∞. I (t ) = ∫ S d (t ′) I (t − t ′)dt ′. (2.12). 0. 將(2.1)及(2.3)式代入方程式 ∞. I (t ) = I 0 ∫ exp(− t ′ )[b + a cos(ωt − ωt ′)]dt ′ 0. τ. (2.13). 根據下面的式子，可以使得積分式容易去計算 cos( x − y ) = cos x cos y + sin x sin y ∞. ∫ exp(− kx )sin mxdx = k. 2. 0. ∞. ∫ exp(− kx )cos mxdx = k 0. 得到 6. 2. (2.14). m + m2. (2.15). a + m2. (2.16).

(14) ∫ exp(− t ′τ )cos ω (t − t ′)dt ′. ∞. 0. =. ⎛ cos ωt ωt sin ωt ⎜ + 2 2 ⎜ 2 2 1+ ω τ ⎝ 1+ ω τ 1 + ω 2τ 2. τ. τ. =. 1 + ω 2τ 2. cos(ωt − θ ). ⎞ ⎟ ⎟ ⎠. (2.17) (2.18). 根據最後一式(2.18)，得到所使用的式子. (. cosθ = 1 + ω 2τ 2 tan θ =. ). −1. 2. sin θ cosθ. (2.19) (2.20). 可以得到時間相依強度為 ⎡ ⎤ a I (t ) = I 0τ ⎢b + cos(ωt − θ )⎥ 1 + ω 2τ 2 ⎣ ⎦. (2.21). 由這一項式子，可以表示訊號的調變是藉著與驅動訊號有相關的係數. (1 + ω τ ) 2. 2 −1 / 2. 。. 2.2 差動共焦顯微術一般而言，無論是用共焦顯微術的極大值來偵測物體表面高度，或者是利用鎖相干涉共焦顯微術，大都是採用閉迴路（Close-loop）的系統架構，在偵測時要固定某個參數，以橫向掃描物體的表面高度造成此參數的變化，此變化作為閉迴路的誤差訊號，以閉迴路對誤差訊號的回授補償當作量測的數據。這種量測的方法可以獲得很高的縱向解析率，但是閉迴路需要一定的反應時間，反而對測量速度造成限制。而且不只是共焦顯微術及鎖相干涉共焦顯微術有這類的問題，其它如掃描穿隧電子顯微術（Scanning tunneling microscopy, STM） 7.

(15) [2.10]、原子力顯微術（Atomic force microscopy, AFM）[2.11]與近場掃描光學顯微術（Near-field scanning optical microscopy, NSOM）[2.12] 等，同樣都是閉迴路系統，所以對測量及顯像的速度都會造成限制。為了達到快速測量及顯像的目的，除了更進步的電子技術及快速精密位移儀器來提高閉迴路的反應速度之外，只有採用開迴路（Open-loop）的偵測方法。但是要開迴路的偵測系統達到毫微米的解析度，卻有兩項困難需求：（1）在開迴路的操作下，系統對高度的反應必須極為敏感。簡而言之，系統要能直接、正確放大物體微小高度變化所造成的訊號差，而不像閉迴路系統，需要依靠回授訊號來換算高度變化。（2）系統必須提供足夠的動態範圍（Dynamic range）。由於在開迴路的偵測系統中並沒有鎖定物體高度的機制，如果沒有足夠的動態範圍，對表面高度變化量過大的樣本就無法提供正確的測量結果。因為這兩個主要的條件不容易同時達成，造成開迴路的毫微米解析度量測技術比較少見。差動共焦顯微術（Differential confocal microscopy）[2.13]，正是同時具有高解析度及大動態範圍的開迴路掃描顯微技術。這技術本身是利用共焦顯微術縱向反應曲線的線性區，來同時達成我們所需要的要求，如圖 2-2 所標示。. 圖 2-2 共焦顯微術的縱向反應曲線及線性區[2.14]. 8.

(16) 在 1982 年，D. K. Hamilton 與 T. Wilson 發表以共焦顯微術來呈現物體表面高度的三度空間掃描技術[2.15]，利用共焦顯微術縱向反應曲線的極大值來定位物體表面高度。簡而言之，因為縱向反應曲線的極大值在空間中所對應的高度正是聚焦物鏡的焦平面，所以只要在掃描物體表面的同時，保持表面與聚焦物鏡鏡頭之間的距離與物鏡的工作距離相等，在掃描的時侯記錄物體或物鏡移動的高度，就可以得知表面三度空間的高度變化。由縱向反應曲線可以得知，在縱向反應曲線極大值的附近，曲線的斜率都接近零，也就是說訊號大小的變化對物體表面高度不敏感，因此限制了縱向解析度。換句話說，如果將樣本表面移開物鏡的焦平面，利用縱向反應曲線斜率最大的線性區來偵測訊號的變化，由圖 2-3 可以看出，樣本微小的高度差異就能夠導致訊號產生很大的變化，因此縱向解析度能夠大幅的提高，達到毫微米的精準度，而在線性區進行偵測，動態範圍幾乎能夠包涵由 sinc2( u / 2 )函僂的極大值到第一零點的距離，亦即由 u = 0 到 u = 2π 。. 圖 2-3 縱向反應曲線線性區訊號變化. 共焦反應曲線的線性區對高度變化很敏感的性質，類似電路學中「差動放大器」的槪念，當輸入訊號的直流成分為零時，差動放大器. 9.

(17) 工作在線性區。在線性區中，輸入－輸出轉換曲線有很大的斜率，因此輸入微小的訊號就會被差動放大器有效率的放大。共焦顯微術利用縱向反應曲線線性區放大物體表面微小高度差的槪念，和差動放大器利用輸入－輸出轉換曲線放大微小電訊號的原理十分相同，所以此技術被叫做「差動共焦顯微術」。因為差動共焦顯微術在開迴路操作下具有很高的縱向解析度與大的動態範圍，在即時顯像的毫微米顯微技術上有很大的潛力。再加上差動共焦顯微術的非接觸性、非侵入性的特點，非常適合用來觀察液體或生物胞表面微小的動態行為。由於差動共焦顯微術不依賴光的干涉來達成高解析度，因此在訊號光源與激發光源完全不同調性的情形下，差動共焦顯微術的高縱向解析度與大動態範圍仍然存在，使得差動共焦顯微術可以配合螢光顯微術，選擇性地的探測生物細胞中特定物質的縱向運動等……，這是 STM 或 AFM 等非光學顯微技術無法達成的。. 10.

(18) Reference [2.1] Joseph R. Lakowicz, “Principles of fluorescence spectroscopy 2nd edition” KA/PP (1999). [2.2] Z. Gaviola, Z. Phys. 42, 833 (1926), [2.3] Gratton E., “The measurement and analysis of heterogeneous emissions by multifrequency phase and modulation fluorometry” , Appl. Spectrosc. Rev. 20(1) 55 (1984). [2.4] Gratton E., “Multifrequency phase and modulation fluorometry” , Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 13, 105 (1984). [2.5] Bright F. V. et al., “Advances in multifrequency phase and modulation fluorescence analysis” , Anal. Chem. 21, 389 (1990). [2.6] Lakowicz J. R., “Frequency-domain fluorometry for resolution of time-dependent fluorescence emission” , Spectrosc. 1, 28 (1985). [2.7] Rabinovich et al., “A compact, LED-based phase fluorimeter -detection system for chemical and biosensor arrays” , Proc, SPIE3258, 2 (1998). [2.8] Hui-Hui Zeng et al., “Real-time determination of picomolar free Cu(II) in seawater using a fluorescence-based fiber optical biosensor” , Anal. Chem. 75, 6807 (2003). [2.9] Lakowicz J. R. et al., “Frequency-domain fluorescence spectroscopy” , Plenum Press, New York (1991). [2.10] J. A. Golovchenko, “The tunneling microscope: a new look at the atomic world” , Science 232, 48 (1994). [2.11] G. Binnig, C. F. Quate, and Ch. Gerber, “Atomic force microscope” , Phys. Rev. Lett. 12, 930 (1986). [2.12] E. Betzig and J. K. Trautman, “Near-field optics: microscopy, spectroscopy, and surface modification beyond the diffraction. 11.

(19) limit”, Science 257, 189 (1992). [2.13] 李超煌, “差動共焦顯微術及其應用” 國立台灣大學電機工程學研究所博士論文, 民國 86 年. [2.14] Chau-Hwang Lee, Jyhpyng Wang and Chin-Lin Guo, “Nanometer imaging by differential confocal microscopy and its applications in biology” , Opt. Lett. 23 (1998). [2.15] D. K. Hamilton and T. Wilson. “Three-dimensional surface measurement using the confocal scanning microscope” , Appl. Phys. B 27, 211 (1982).. 12.

(20) 第三章實驗儀器與架設 3.1 實驗架設. 圖 3-1 實驗架構圖. 本實驗系統架構圖如圖 3-1，由上圖實驗架構圖可得知，從氦氖雷射（cw He-Ne laser, Coherent Inc. 543.3nm, 2mW）發射出綠光雷射光束，經由反射鏡（mirror, BD.1, Newport, Inc.）反射進入分光鏡（Beam splitter BS.1 50/50 Newport, Inc.），被分光鏡所反射的雷射光不是我們所需要的雷射光，為了不讓多餘的雷射光影嚮本實驗系統，因此將多餘的雷射光阻擋起來，相對的，穿透分光鏡的綠光雷射進入雷射掃描系統（Laser scan unit, FV300, Olympus, Inc.）由電流反射鏡（Galvano mirror）做二維 x-y 軸的掃描，最後在經由物鏡（Objcetive lens, 40X 0.95NA, Olympus, Inc.）聚焦在樣本面上，樣本放置在壓電致動器上面，由壓電致動器當作振盪來源，振盪樣本，壓電致動器的振盪是由鎖相放大器（Lock-in amplifier SR830, SRS, Inc.）提供頻率及電壓給. 13.

(21) 電壓放大器（High voltage amplifier, 3211, NEW FOCUS, Inc.）輸出驅動電壓來驅動，在這同時，鎖相放大器提供給電壓放大器的頻率也做為鎖相放大器本身內部的參考頻率，除此之外，還有一部訊號產生器提供訊號頻率當作可變式電流反射鏡掃描的外部觸發掃描頻率訊號。聚焦在樣本表面的雷射光，因為壓電致動器的振盪而調變雷射光形成反射調變訊號，反射的調變訊號由原來的路徑回去，經過分光鏡後再一次被另外一個物鏡（16X 0.25NA, NEW FOCUS, Inc.）聚焦在針孔（Pinhole, diameter 15um, Edmund Optics, Inc.）上，而通過針孔的反射訊號再由光偵測器（Photo detector, UV-100, UDT, Inc.）所偵測接收，由光偵測器所接收到的訊號直接輸入到鎖相放大器，而鎖相放大器經由輸入訊號與給電壓放大器的頻率即可測量出相位差異，最後使用軟體為 FV300（External vision 4.1），此套軟體用來控制雷射掃描裝置儀器同時也將鎖相放大器輸出的訊號建立成影像，最後本實驗所有儀器設備建立在室溫下光學桌上。. 3.2 實驗設備氦氖雷射（543.5nm, 2mW）為本實驗所使用的光源，氦氖雷射本身提供高空間同調性（Spatial coherence）、高亮度、單色及平行光。以下還有很多重要的實驗設備，如壓電致動器、針孔、鎖相放大器及可變式電流鏡掃描系統。. 3.2.1 壓電致動器本實驗所採用的振盪來源為壓電致動器，壓電致動器本身為 PZT 所組成的，1954 年 Jaffe 等人發現鋯鈦酸鉛（Lead Zirconate Titanate, PZT）固溶（solid-solution）材料，因其本身具有非常優越的壓電特性，因此 PZT 即被廣泛地應用在感測器（sensors）、致動器（actuators）及電壓產生器（voltage generators）等各種壓電裝置上，1955 年此種. 14.

(22) 高壓電應變常數的壓電陶瓷-鋯鈦酸鉛（PZT）更被 NSB 發展製造出來，此後 PZT 幾乎成了壓電致動器的主要材料，P（Plumbum）代表鉛，Z（Zirconate）代表鈷，T（Titante）代表鈦等材料為壓電材料（Piezoelectric Material）的一種，壓電材料具有機械能、電能及熱能交換性質的材料，當我們對壓電材料施加應力（Stress）或應變力（Strain）或溫度改變時，其內部會產生極化現象（Polarization），壓電及焦電效應為電氣系與力學系及熱能系的相互作用，屬於異種現象間的線性結合作用，本實驗著重壓電效應，壓電效應為電氣系與力學系的結合作用，材料因壓力而發生分極的效果稱為正壓電效應，相反的，因為電場而發生應變者稱之為逆電壓效應。壓電致動器之組成為壓電材料所構成之壓電元素，其在一般狀態下，壓電元素之極性拼序混亂不齊，當集合眾多壓電元素於一起，如圖 3-2 所示，而且外加電性時，由於壓電特性會造成壓電元件之外型產生形變，而壓電元件之工作原理，也就利用此一特點，輸入變化之電壓波，可使得陶瓷元件形成微小之變形。. 圖 3-2 極化元素[3.1]. 壓電材料有以下的特性，壓電效應（Piezoelectric Effect）、焦電效應（Pyroelectric Effect）、介電效應（Dielectric Effect）及光電效應（Optic-Electric Effect），而本實驗著重在壓電效應上，故只針對壓電 15.

(23) 效應的特性加以說明：壓電效應（Piezoelectric Effect）通常利用壓電材料的機械能與電能轉換的裝置或元件時，需要利用壓電效應，所謂的壓電效應，包含壓電材料受力後會輸出電流或電壓的正壓電效應（機械能→電能），以及當壓電材料被施予電流或電壓，會產生變形或伸縮的逆壓電效應（電能→機械能），如圖 3-3 所示，利用正壓電效應可製成感測器，利用逆壓電效應可製成致動器，分別說明如下：（l）正壓電效應（Direct Piezoelectricity）：壓電效應為當某結晶承受壓力或張力時，如果產生變形，則晶體內部則發生電荷中心的相對移動，而致介質發生極化，亦因而導致結晶表面出現極性相反的束縛電荷，亦即當應力或應變作用而使物體產生電荷或電壓的輸出，而當應力或應變方向相反時,電荷或電壓的極性隨之逆轉，且電荷密度與外力成正比，此現象稱為正壓電效應。（2）逆壓電效應（Inverse Piezoelectricity）：即當以電場輸入物體使之產生機械能或應變的輸出，物體的形變隨著電場的大小來改變，而當此一電場的作用方向改變時，物體的形變方向也會隨之改變，且當輸入電場為交流電時，物體的形變方向會隨著電場的正負半週期做收縮及膨脹的交互變換，而當交流電場的頻率等於材料本身的自然共振頻率時，其形變的幅度達到最大，此現象即稱為逆壓電效應。. 圖 3-3 壓電效應[3.2]. 16.

(24) 壓電致動器的原理與結構由壓電晶體產生的壓電特性中，應力及應變屬於機械量，電場強度，電位移（Electric Displacement）或極化屬於電氣量，在此種現象中，機械量與電氣量是相關連的，此稱為機電耦合，壓電效應具有各種現象，其中以縱效應（Longidutal Effect）及橫效應（Transevrse Effect）最為重要，發生在與電氣軸平行方向的變形稱為縱效應，而發生在與電氣軸垂直方向的變形稱為橫效應，如圖 3-4 所示，當外加電壓在一個已極化過的壓電陶瓷上，使得在極化方向伸長，在此同時也將在垂直極化方向產生收縮現象，而極化方向之變形大約是垂直極化方向之變形量的二倍，此為壓電陶瓷之工作原理。. 圖 3-4 壓電陶瓷變形效應[3.1]. 壓電致動器的結構有許多種形式，如圖 3-5 所示，以一般的分類來說，可分為利用壓電元件面之內位移的線性位移型，與利用外位移的彎曲位移型等二種：線性位移型. 彎曲位移型. 單板型（Single-Layer）積層型（Multi-Layer）單體電晶片（Monomorph）單壓電晶片（Unimorph）雙壓電晶片（Bimorph）多壓電晶片（Mltimorph） 17.

(25) 圖 3-5 壓電致動器構造運動方式[3.1]. 由於組合或堆疊之方式不同，其應用也有所差異，故設計者可依其結構及動作需求選擇適合形式的壓電致動器，本實驗所採用的為積層型的壓電致動器（AE0203D04, Thorlabs, Inc.），如圖 3-6 所示. 圖 3-6 積層型壓電致動器[3.3]. 圖 3-7 積層型壓電致動器之結構[3.1]. 圖 3-7 為積層型壓電致動器之標準結構，這也就是壓電致動器的基本構造，若將數十層壓電薄板平行相疊加，並間隔以電極，使每個壓電層的極化方向均與相鄰的兩個壓電薄層極化方向相反，以此結構所組成的壓電材料，即為積層式壓電材料。以一般的機械加工方法所得到的壓電板厚度有一定的限制，近年來製造技術高度發展，應用厚膜技術，很容易就可得到極薄的壓電陶瓷，圖 3.7 表示市面出售的積層式壓電陶瓷致動器之構造，由均勻層、不均勻、保護層構成，均勻層主要為伸縮部分，為厚度 10um 的壓 18.

(26) 電陶瓷與銀鈀合金（paradium）內部電極層交互積層，不均勻層位於均勻層和保護層之間，是為了緩和產生剪斷應力的部分，由厚度 220um 的壓電陶瓷與內部電極形成，保護層不含內部電極，與伸縮無關，各內部電極的連接如圖 3.7 所示，以玻璃絕緣體隔絕不須連通的電極，需連通的電極部分，則由金屬膜外部電極來相互並聯。壓電致動器之優點如下： l、高位移解析度：壓電致動器最小位移量可到達次奈米（Sub-nanometer）的解析度，微小的電壓量就可以使致動器產生極小位移。 2、產生力量大：積層式壓電致動器一根可產生的最大出力可高達數噸重，位移量可在 100um 以上。 3、響應時間快：壓電致動器響應非常的快，頻寬通常可高達數 kHz。 4、不受磁場影響：壓電致動器是受電場的影響，本身不會產生磁場，本身亦不受磁場影響，所以可以適用於磁場干擾大的地方。 5、消耗能量低：壓電致動器能量的消耗在承受外力或位移量的改變時，不會因為其他因素增加能量的消耗，故能量的消耗低。 6、沒有機械損耗：壓電致動器本身沒有齒輪或軸承這些配件,位移是藉由本身固體狀態之動態產生的，所以沒有磨耗的情形。 7、清潔無污染：PZT 壓電致動器不需要潤滑，所以可使用於真空或無塵室……等高環境要求之工作場合。. 壓電致動器之缺點如下： l、位移量小：壓電致動器位移量約為本身壓電材料長度的千分. 19.

(27) 之一，一般如 100mm 位移量約為 100um。 2、有磁滯及潛變現象：其磁滯所造成的誤差使其運動路徑為非線性。 3、只能承受推力：本身是陶瓷脆性材料，積層間以膠黏結合，不能夠承受大的拉力或扭力。. 3.2.2 針孔在傳統的顯微鏡裡面，一般都是藉由燈光照射在樣本上，而在同時樣本反射光源回來，如果要有高強度就必須在透鏡的聚焦點的位置，不過非聚焦點的其它地方一樣也會被光源照到，導致最後的影像結果背景模糊，為了解決這個問題，就必需增加一塊針孔。雷射掃描共焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscopy LSCM）在 80 年代中期是一項重要科技發展[3.4]，相對於傳統的光學顯微鏡，電射掃描共焦顯微鏡因為點照明及偵測類別，使得電射掃描共焦顯微具鏡有高度的空間解析，藉著將針孔放置在光偵測器的前面，讓點偵測能夠成功實現，而且為了讓點照明能夠正確的實現，也藉著使用雷射當作顯微鏡的光源，光源透過顯微鏡物鏡在樣本上的聚焦點的同時經過樣本反射，也會透過另外一個物鏡在針孔的位置上形成另一個聚焦點，這兩點聚焦點就是我們所熟知的“共軛點（Conjugate point）” 圖 3-8 所示，因為針孔的位置與透鏡的聚焦點成共軛，所以也稱為“共焦針孔（Confocal pinhole）” 。. 圖 3-8 針孔與透鏡聚焦點共焦結合[3.5] 20.

(28) 因為共焦針孔的關係，顯微鏡可以非常有效率的去除非聚焦點的光源如圖 3-8 所示，只有在共焦平面上的光源才能正確地成像通過針孔，而非平焦平面上的光源則不能正確地成像通過針孔，因而不會被光偵測器所偵測到。. 3.2.3 鎖相放大器. 圖 3-9 鎖相放大器函數方塊圖表. 鎖相放大器如圖 3-9 所示，為所熟知的相敏感偵測器（Phase sensitive detection, PSD）的一種，用來在特殊的參考頻率及相位下可以單一輸出訊號的組成[3.6]，對於輸入訊號而言，不同於參考頻率的雜訊頻率會被鎖相放大器濾掉。鎖相放大器需要一個參考頻率，而使用的參考頻率最高可以到 102 kHz，外部參考頻率由訊號產生器產生並且連接到鎖相放大器上，當類比正弦波訊號及 TTL 數位訊號觸發輸入鍳頻器時，鎖相迴路（Phase-locked-loop, PLL）將內部的參考振盪器與外部的參考頻率做同步，因此參考正弦波的頻率為 ω r ，修正的相位延遲為 θ ref ，導致 21.

(29) 鎖相放大器的參考訊號為 Vr sin(ω r t + θ ref ) 。另一方面，樣本被一個固定的頻率所驅動，而且鎖相放大器在參考頻率下偵測從樣本產生的反應。在鎖相放大器內待測的訊號為了防止本身的雜訊會先經過兩個陷波濾波器（Notch filter），這兩個陷波濾波器預先調頻到線性頻率（50 or 60 Hz）和兩倍的線性頻率（100 or 200 Hz），待測的訊號變為 Vsig sin(ω d t + θ sig ) 。鎖相放大器接著放大訊號並且使用相敏感偵測器與鎖相參考訊號相乘，PSD 的輸出可以簡單的由兩個正弦波乘積來表示。 VPSD1 = VsigVr sin(ω d + θ sig ) sin(ω r t + θ ref ). (3.1). 1 1 = VsigVr cos([ω d − ω r ]t + θ sig − θ ref ) − VsigVr cos([ω d + ω r ]t + θ sig + θ ref ) 2 2. 由 3.1 式可以看出，PSD 的輸出包含很多訊號，大部份的 PSD 輸出訊號的頻率是由訊號的頻率跟參考訊號的頻率相加或相減，只有在輸入訊號的頻率跟參考頻率完全相同才會在直流輸出產生結果，在 PSD 輸出的低通濾波器用來去掉所有不必要的交流訊號以及所有訊號和參考訊號的雜訊總和，假如 ω d 等於 ω r ，訊號將會是直流訊號，過濾後的 PSD 訊號輸出將會是 1 VPSD1 = VsigVr cos(θ sig − θ ref ) 2 VPSD1 ≒ Vsig cosθ. (3.2) (3.3). θ = (θ sig − θ ref )， θ 表示被測訊號跟鎖相參考振動器之間的相位的不同，. 假如另外一個 PSD 將訊號及位移 90 o 的鎖相參考訊號相乘， i.e.. (. ). Vr sin ω r t + θ + θ ref + 90 o ，低通濾波器的輸出將會是. 1 VPSD1 = VsigVr sin(θ sig − θ ref ) 2. (3.4). VPSD1 ≒ Vsig sin θ. (3.5). 考慮 eqs. (3.3)和(3.4)，第一個輸出稱為 X、第二個輸出稱為 Y 22.

(30) X = Vsig cosθ. (3.6). Y = Vsig sin θ. (3.7). 藉著使用電腦計算訊號的調變（R）和移除相位部份 R = (X 2 +Y 2). 1. 2. = Vsig. (3.8). R 代表訊號的振幅和訊號跟鎖相參考訊號之間相位的獨立，除此之外，在訊號跟鎖相參考訊號之間的相位延遲（ θ ），根據下面的式子可以計算出來 θ = tan −1 (Y / X ). (3.9). 經由鎖相放大器所做出來的實驗數據將會在後面呈現出來，因為從光偵測器所接受到的訊號非常微小，故選擇電流模式並且輸入阻抗為 100kΩ，時間常數（Time constant）和敏感度（Sensitivity）隨著樣本的不同而改變，濾波器選著在 24db。. 3.2.4 可變式電流掃描在 LSCM 裡面的掃描系統負責移動聚焦的雷射光點做行和列的影像掃描[3.7]，兩個電流計鏡通常先移動雷射光點掃描 Y 軸第一行 X 軸的部份，等到第一行 X 軸部份結束之後，再移動到 Y 軸第二行繼續掃描 X 軸的部份，這樣一直下去，只到你要求掃描的範圍結束。共焦顯微鏡通常應用在生物細胞的研究[3.8]，生物細胞的反應都是非常快，像螢光壽命（Fluorescence lifetime）[3.9]和 FRET[3.10]，一般的掃描速度大約是每一點 6.87 ×10 −6 sec，但是考慮到樣本的反應時間和鎖相放大器，一般內建的標準掃描速度太快以致於不能獲得良好的影像，於是使用訊號產生器當作外部觸發，提供軟體一個連續的方波，方波的周期大約是每一點 3.33 × 10 −3 sec ，比內建標準的掃描速度還. 23.

(31) 要慢，但是可以提供較好的解析度。. 3.2.5 調變顯微鏡雷射光經由物鏡聚焦在由電壓放大器所驅動的壓電致動器的中心表面，壓電致動器提供本實驗一個振盪機制或是一個振盪平面，壓電致動器所調變的反射光具有與電壓放大器相同的頻率，調變的反射光經由原來的光路路徑被另外一個聚焦物鏡再一次聚焦在針孔上，壓電致動器的表面與針孔形成共焦現象，最後透過針孔的發散光源由光偵測所偵測，當壓電致動器的表面因為振盪而離開共焦平面，反射回去的大部份光源將會被針孔所阻擋，被光偵測器所偵測的訊號因為被壓電致動器所調變就像連續的閃光，經由鎖相放大器可測量出光偵測器所偵測的訊號與參考訊號兩者之間的相位差異，最後可由相位變換計算出壓電致動的反應時間。. 24.

(32) References [3.1] 曾俊耀,“壓電驅動精微定位機構設計＂國立台灣大學機械所碩士論文, 民國 90 年. [3.2] http://resources.emb.gov.hk [3.3] http://www.thorlabs.com/index.cfm [3.4] C. J. R. Sheppard et al, “Confocal laser scanning microscopy” Springer (1997). [3.5] 周俊豪,“調變顯微鏡的應用-黏滯係數量測” 國立中山大學物理研究所碩士論文, 民國 94 年. [3.6] Reamwood Avenue et al,“Model SR830 DSP lock-in amplifier” SRS, inc. California (1993). [3.7] “User’s manual—Fluoview FV300”Olympus, inc. [3.8] Ping-chin Cheng et al, “Multi-photon fluorescence microscopy—the response of plant cells to high intensity illumination”,Micron 32, 661 (2001). [3.9] Kenneth P. Ghiggino et al. “Fluorescence lifetime measurement using a novel fiber-optic laser scanning microscope” , Rev. Scl. Inst., 63, 5, 2999 (1992). [3.10] Rajesh Babu Sekar et al. “FRET microscopy imaging of live cell protein localizations” , J. Cell Bio., 160, 5, 629 (2003).. 25.

(33) 第四章實驗結果與討論 4.1 實驗結果系統架設完成後，要了解系統的縱向解析度為動態範圍。為了測量縱向解析度，我們利用一塊全反射鏡當作樣本，先將樣本放置在訊號最大值處，也就是物鏡的焦點，再以電腦控制平台 z 軸上下移動反射鏡樣本，因為在高倍率物鏡下，樣本與物鏡鏡頭非常靠近，為了不影響到樣本的完整性及破壞物鏡鏡頭，選擇將平台 z 軸向下移動。最後利用 z 軸的高度變化與光偵測器訊號變化來找出線性區以及動態範圍[4.1-5]，如圖 4-1 1 0.9. 20X NA=0.7 40X NA=0.95 Fitting curve. normalized intensity. 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -13. -12. -11. -10. -9. -8. -7. -6. -5. -4. -3. -2. -1. 0. displacement (um). 圖 4-1 二種不同聚焦物鏡之訊號強度與位置的關係圖. 先以 20X , NA 0.7 來看，因為實驗誤差的影響，實驗曲線變化很大，所以在 20X 的實驗曲線套上一個套適曲線以方便看出線性區域及動態範圍。在套適曲線上，可以明顯的看到線性區大約在–4.5～–8.5 斜率大約為 0.133 (1 / μm ) 。動態範圍為線性區 z 軸長度，代表上下移動的最大範圍，所以 20X, NA 0.7 的動態範圍為 4 μm ，系統平均雜訊 ΔEn 約 2%，縱向解析度約為 0.2um 。 26.

(34) 40X, NA 0.95，很明顯的看到線性區在–1～–3.5，斜率為 0.268 (1 / μm )。40X, NA 0.95 的動態範圍為 2.5 μm，系統平均雜訊 ΔEn 約為 0.9%，縱向解析度為 34nm 。大倍率的物鏡收光度比小倍率的收光度要小，所以在光偵測器所接受的光訊號值，大倍率物鏡的光訊號值小於小倍率的光訊號，所以才會將訊號做歸一化，才能真正的了解兩個斜率的大小差異。. 實驗結構在前面第三章已經介紹過了，首先我們觀察壓電致動器在各個不同頻率下的表面影像，如圖 4-2、圖 4-3。圖 4-2 與圖 4-3 為同一個壓電致動器的表面影像。不同的是，這兩份圖是鎖相放大器將光偵測器所偵測到的訊號加以分析，分成 X、Y 訊號，X 訊號由 CH1 所輸出，代表著 Vsig cos θ ，Y 訊號由 CH2 所輸出，代表著 Vsig sin θ ，使用矩陣影像處理軟體（MathWorks-Matlab）做處理，可以由 3,8 式得到壓電致動器在各個頻率上的強度變化，如圖 4-4。利用頻率、強度跟，經由 2.11 式，可以得到壓電致動器在不同頻率下的反應時間，如圖 4-5。. 27.

(35) 1k Hz. 2k Hz. 3k Hz. 5k Hz. 6k Hz. 7k Hz. 8k Hz. 9k Hz. 10k Hz. 11k Hz. 12k Hz. 13k Hz. 14k Hz. 15k Hz. 16k Hz. 圖 4-2 不同頻率下壓電致動器表面影像（CH1）. 28. 4k Hz.

(36) 1k Hz. 2k Hz. 3k Hz. 4k Hz. 5k Hz. 6k Hz. 7k Hz. 8k Hz. 9k Hz. 10k Hz. 11k Hz. 12k Hz. 13k Hz. 14k Hz. 15k Hz. 16k Hz. 圖 4-3 不同頻率下壓電致動器表面影像（CH2）. 29.

(37) 100 Sample data Fitting curve. 90 80. Modulation (%). 70 60 50 40 30 20 10 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Frequency (kHz). 圖 4-4 壓電致動器在不同頻率下的調變。（藍色為量測值、紅色為量測值的套適曲線）. -3. x 10 1.8. Sample data Fitting curve. 1.6. Response time (s). 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Frequency (kHz). 圖 4-5 壓電致動器在不同頻率下的反應時間。（藍色為量測值，紅色為量測值的套適曲線）. 30. 16. 17.

(38) 接下來，實驗要觀察壓電致動器表面隨著輸入驅動電壓變化的情形，一般來說，當電壓為零的時侯，壓電致動器本身不會有任何的振盪，也就是說，光偵測器所接收的光訊號，經過鎖相放大器之後，不會在電腦上產生任何的圖。又壓電致動器的表面非常不均勻，沒有規則性可以言，無法讓別人信服實驗所獲得的影像是正確的，所以此次實驗在壓電致動器表面加上一塊光碟片，藉由觀察光碟片內部刻痕的變化來當做壓電致動器的表面變化。圖 4-6 與圖 4-7 為鎖相放大器 CH1 及 CH2 的輸出，經由計算之後，得到強度的變化，圖 4-8 為 0V、 1V、2V、3V、4V 及 5V 電壓下的強度圖形，電壓值是直接採用鎖相放大器的輸出電壓值來做代表，可以看出來，電壓為零的時侯，光碟片的表面影像較無任何的強度變化，而電壓愈高，光碟片表面的強度變化愈明顯，光碟片的刻痕也就愈明顯，而在圖中也可以看到強度並非均勻，這樣的差異可能是來自光碟片本身並非平面，造成部份的區域反射回來的訊號比較明顯。圖 4-9 將不同電壓的強度做成曲線來表示，可以發現到，在零伏特的位置歸一強度並非為零，可能有兩個原因：（1）鎖相放大器所提供的最低驅動電壓並非為零，而是 0.004 伏特，造成在掃描的時侯也有稍微的影像產生，（2）光偵測器在接收樣本的反射光訊號的時侯，同時也接收到外部少許的光雜訊造成在最低電壓也有強度的產生。這張圖同時也證明了壓電致動器受到磁滯現象的影響導致壓電致動器的位移路徑非線性，因而使得強度曲線也並非線性。圖 4-10 為壓電致動器在不同電壓下的反應時間。. 31.

(39) 0V. 0.1V. 0.2V. 0.3V. 0.4V. 0.5V. 0.6V. 0.7V. 0.8V. 0.9V. 1V. 1.1V. 1.2V. 1.3V. 1.4V. 1.8V. 1.9V. 1.5V. 1.6V. 2V. 3.5V. 1.7V. 2.2V. 2.5V. 3V. 4V. 4.5V. 5V. 圖 4-6 不同電壓下光碟片表面影像變化（CH1）. 32.

(40) 0V. 0.1V. 0.2V. 0.3V. 0.4V. 0.5V. 0.6V. 0.7V. 0.8V. 0.9V. 1V. 1.1V. 1.2V. 1.3V. 1.4V. 1.5V. 1.6V. 1.7V. 1.8V. 1.9V. 2V. 2.2V. 2.5V. 3V. 3.5V. 4V. 4.5V. 5V. 圖 4-7 不同電壓下光碟片表面影像變化（CH2）. 33.

(41) 50. 50. 100. 100. 150. 150. 200. 200. 250. 250. 300. 300. 350. 350. 400. 400. 450. 450. 500. 500 -100. 0. 100. 200. 300. 400. 500. 600. -100. 0. 100. 200. 0V. 300. 400. 500. 600. 1V. 50. 50. 100. 100. 150. 150. 200. 200. 250. 250. 300. 300. 350. 350. 400. 400. 450. 450. 500. 500 -100. 0. 100. 200. 300. 400. 500. 600. -100. 0. 100. 200. 2V. 300. 400. 500. 600. 3V. 50. 50. 100. 100. 150. 150. 200. 200. 250. 250. 300. 300. 350. 350. 400. 400. 450. 450. 500. 500 -100. 0. 100. 200. 300. 400. 500. 600. -100. 0. 100. 4V. 200. 300. 5V 圖 4-8 不同電壓下光碟片表面強度變化. 34. 400. 500. 600.

(42) Sample data Fittting curve. Normalized intensity. 1. 0.8. 0.6. 0.4. 0.2. 0 -0.5. 0. 0.5. 1. 1.5. 2. 2.5. 3. 3.5. 4. 4.5. 5. 5.5. Voltage (V). 圖 4-9 光碟片不同電壓下強度曲線變化（藍色為量測值、紅色為量測值的套適曲線）. -4. x 10 6. Sample data Fittting curve. Response time (s). 5. 4. 3. 2. 1. 0 -0.5. 0. 0.5. 1. 1.5. 2. 2.5. 3. 3.5. 4. 4.5. 5. Voltage (V). 圖 4-10 光碟片不同電壓下反應時間曲線變化（藍色為量測值、紅色為量測值的套適曲線）. 35. 5.5.

(43) 接下來我們嘗試使用雷射顯微鏡專用校正片來觀看影像，圖 4-11 為顯微鏡底下所觀察到的影像，我們所使用的鏡頭為 20 倍物鏡，NA 值為 0.7。圖 4-12 為鎖相放大器所輸出的 X、Y 影像，我們利用 X、 Y 影像來做處理，得到校正片的強度變化影像，由於本實驗所接收的訊號大小除以斜率 r 就是高度值，因此我們先將我們所取得的強度變化影像先做歸一化，使強度最大為 1，最小為 0，然後在除以 20 倍物鏡，NA 值為 0.7 的斜率 0.133 (1 / μm ) ，得到實際的高度變化影像，如圖 4-13，單位為 μm ，由圖 4-13 可以很明顯的看到，影像高度並非均勻，可以返回推論，在強度變化也並非均勻，由此可知，（1）樣本並非水平狀態，雖然一開始有利用水平儀調整水平，但是在微觀下，樣本還是稍微傾斜，造成校正片的反射訊號並非均勻，有強有弱。（2）校正片本身的反射率就並不相同，造成所接收的反射訊號並不一樣。接下來，我們取下高度變化影像的橫軸 150 所有的高度值，如圖 4-14，可以看出高低分佈，但是訊號分佈差距很大，無法很明顯的看出強度最強的高度跟強度最弱的高度相差多少，所以我們從橫軸 150 的高度表取出 5 個位置坐標範圍，利用 Matlab 及 Origin，我們可以對這 5 個位置做計算，得到圖 4-15，紅色曲線為套適曲線，我們將各個位置的量測值去做套適，可以得到各個位置的平均高度值，最後將五個位置的高度差在一起比較，看到最高點跟最低點相差大約有 0.3 μm ，了解到樣本反射訊號強度大小也會影嚮到計算後的樣本高度差，最後我們將五個位置的高度做平均，得到校正片的高度差大約是 0.886 μm ，886 nm 。. 36.

(44) 圖 4-11 校正片在顯微鏡下的影像. 圖 4-12 鎖相放大器輸出之校正片 X，Y 影像. 37.

(45) 7 50. 100. 6. 150 5 200 4. 250. 300. 3. 350 2 400. 1. 450. 500 0. 50. 100. 150. 200. 250. 300. 350. 400. 450. 圖 4-13 校正片高度變化影像. 圖 4-14 校正片橫軸 150 的高度變化值. 38. 500. 0.

(46) (1). (2). (3). 0.78. 0.8722. um. 0.7472. 0.0168 0. 10. 20. 30. 40. 0.0129 0. 10. (4). 20. 30. 40. 0.0333 0. 10. 20. 30. 40. 30. 1 2 3 4 5 40. (5) 1.0535 0.8866. 1.0924 um 0.0389 0. 0.7342. 1.0515. 10. 20. 30. 40. 0.0086 0. 10. 20. 30. 40. 0. 10. 圖 4-15 校正片橫軸 150 之 5 個位置高度變化圖. 39. 20.

(47) 最後我們所觀看的光碟片的刻痕，利用之前所做的電壓變化影像，我們選擇電壓值最高的影像來做計算，同樣的，我們所做的方式跟校正片的方式一樣，不過我們所使用的物鏡為 40X，NA 值為 0.95，斜率為 0.268 (1 / μm ) 。可以看到在圖 4-18，可以看出有高低的變化，但是無法明確的知道高度差為多少，所以我們一樣使用 Matlab 及 Origin 來做計算，在圖 4-19，我們看出所取出的 5 個位置個別的高度差，經過比較，大部份的高度差差不多在 0.38 μm，強度較高的部份，高度差為 0.51 μm ，取平均值，得到我們所量測的光碟片刻痕大約是 0.433 μm ，433 nm 。. 圖 4-16 鎖相放大器輸出之光碟片 X，Y 影像. 40.

(48) 3.5 50. 100. 3. 150 2.5 200 2. 250. 300. 1.5. 350 1 400. 0.5. 450. 500 0. 100. 200. 300. 400. 圖 4-17 光碟片高度變化影像. 圖 4-18 校正片橫軸 150 的高度變化值. 41. 500. 600. 0.

(49) (2). (1). (3). 0.4979 0.5293 um. 0.42. 0.1352 0. 10. 20. 30. 40. 0.0214 0. 10. (4). 20. 30. 40. 0.0375 0. 10. 20. 30. 40. (5) 0.5152. 0.5319. 0.4333 0.3825. um. 0.5702. 1 2 3 4 5. 0.1335 0.0551 0. 10. 20. 30. 40. 0. 10. 20. 30. 40. 0. 10. 20. 30. 40. 圖 4-19 光碟片橫軸 350 之 5 個位置高度變化圖. 4.2 實驗討論由實驗結果圖形我們了解到，在觀看實驗樣本大範圍影像的圖形非常清楚，可以了解到樣本表面的結構，可是在取小部份區域的訊號，訊號並非很平滑，光偵測器所接收到不只只有樣本反射訊號也有外部的雜訊訊號加入，因為本實驗架構原始的反射樣本訊號光路要走一段距離的路徑，造成在當中反射訊號的輕微變化，另一方面樣本的反射率的不同也是原因之一，如何確定樣本的水平位置也是另一項重要的部份，所以在細微調整部份上還要在多多加以努力才行。. 42.

(50) References [4.1] 李超煌, “差動共焦顯微術及其應用” 國立台灣大學電機工程學研究所博士論文, 民國 86 年. [4.2] C. H. Lee, J. Wang et al, “Noninterferometric differential confocal microscopy with 2-nm depth resolution” Opt. Commun., 1997. [4.3] C. H. Lee, H. Y. Mong, W. C. Lin, et al, “Noninterferometric wide-field optical profilometry with nanometer depth resolution” , Opt. Lett. 27 (2002). [4.4] C. H. Lee, H. Y. Chiang, H. Y. Mong, et al, “Sub-diffraction-limit inaging based on the topographic contrast of differential confocal microscopy” Opt. lett. 28 (2003) [4.5] A. Bearden, M. P. O’Neill, L. C. Osborne, T. L. Wong, et al, “Imaging and vibrational analysis with laser-feedback interferometry” , Opt. Lett. 18 (1993).. 43.

(51) 第五章實驗結論及未來展望 5.1 實驗結論我們的實驗架構具有以下的優點： z 相位敏感檢測器—鎖相放大器的使用可以準確的測量調變訊號而且有很高的訊雜比，相較於偵測樣本的相位角度，我們更不需去偵測樣本的位移情形。 z 廣泛的偵測範圍—驅動頻率可以到達鎖相放大器限制的頻率（102 kHz）。 z 掃描的能力—因為共焦架構的原因，不用去破壞到樣本的結構性也不需要去對樣本添加任何物質，就可以擁有掃描樣本影像的能力。. 我們已經完成一個新的實驗架構在測量樣本特性上。本實驗架構結合了雷射共焦顯微鏡、鎖相放大器及電流式掃描，可以在生物和醫學上提供精確、及時和高空間時間解析的影像能力。. 5.2 未來展望在未來展望裡，我們將實驗架構及光路簡單化，不在需要將光路繞一大圈，減少外部對訊號的干擾，如圖 5-1。改變光偵測器的規格，現在是用 Photodiode，無法對螢光顯微鏡做影像處理，我們將嘗試改變使用光電倍增管，讓本實驗架構有更多方向去延伸。. 44.

(52) 圖 5-1 新實驗架構圖. 45.

(53) 附錄：光碟片在不同電壓下的強度及反應時間程式主程式： clear all m1=zeros(1,28); m2=zeros(1,28); th=[0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2 2.2 2.5 3 3.5 4 4.5 5];. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0000V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0001V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,1)=m1(1,1)+g1; m2(1,1)=m2(1,1)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0010V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0011V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 46.

(54) g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,2)=m1(1,2)+g1; m2(1,2)=m2(1,2)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0020V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0021V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,3)=m1(1,3)+g1; m2(1,3)=m2(1,3)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0030V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0031V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,4)=m1(1,4)+g1; m2(1,4)=m2(1,4)+g2;. 47.

(55) end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0040V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0041V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,5)=m1(1,5)+g1; m2(1,5)=m2(1,5)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0050V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0051V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,6)=m1(1,6)+g1; m2(1,6)=m2(1,6)+g2; end end. g1=0;. 48.

(56) g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0060V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0061V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,7)=m1(1,7)+g1; m2(1,7)=m2(1,7)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0070V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0071V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,8)=m1(1,8)+g1; m2(1,8)=m2(1,8)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0080V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0081V.bmp'); c=rgb2gray(a);. 49.

(57) d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,9)=m1(1,9)+g1; m2(1,9)=m2(1,9)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0090V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0091V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,10)=m1(1,10)+g1; m2(1,10)=m2(1,10)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0100V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0101V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512. 50.

(58) for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,11)=m1(1,11)+g1; m2(1,11)=m2(1,11)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0110V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0111V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,12)=m1(1,12)+g1; m2(1,12)=m2(1,12)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0120V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0121V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,13)=m1(1,13)+g1;. 51.

(59) m2(1,13)=m2(1,13)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0130V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0131V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,14)=m1(1,14)+g1; m2(1,14)=m2(1,14)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0140V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0141V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,15)=m1(1,15)+g1; m2(1,15)=m2(1,15)+g2; end end. 52.

(60) g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0150V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0151V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,16)=m1(1,16)+g1; m2(1,16)=m2(1,16)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0160V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0161V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,17)=m1(1,17)+g1; m2(1,17)=m2(1,17)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0170V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0171V.bmp');. 53.

(61) c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,18)=m1(1,18)+g1; m2(1,18)=m2(1,18)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0180V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0181V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,19)=m1(1,19)+g1; m2(1,19)=m2(1,19)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0190V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0191V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d);. 54.

(62) for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,20)=m1(1,20)+g1; m2(1,20)=m2(1,20)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0200V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0201V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,21)=m1(1,21)+g1; m2(1,21)=m2(1,21)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0220V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0221V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j);. 55.

(63) m1(1,22)=m1(1,22)+g1; m2(1,22)=m2(1,22)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0250V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0251V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,23)=m1(1,23)+g1; m2(1,23)=m2(1,23)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0300V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0301V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,24)=m1(1,24)+g1; m2(1,24)=m2(1,24)+g2; end end. 56.

(64) g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0350V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0351V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,25)=m1(1,25)+g1; m2(1,25)=m2(1,25)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0400V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0401V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,26)=m1(1,26)+g1; m2(1,26)=m2(1,26)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0450V.bmp');. 57.

(65) b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0451V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,27)=m1(1,27)+g1; m2(1,27)=m2(1,27)+g2; end end. g1=0; g2=0; a=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0500V.bmp'); b=imread('D:\My Work\Image\20060419\Ampliter\0501V.bmp'); c=rgb2gray(a); d=rgb2gray(b); e=double(c); f=double(d); for i=1:512 for j=1:512 g1=e(i,j); g2=f(i,j); m1(1,28)=m1(1,28)+g1; m2(1,28)=m2(1,28)+g2; end end. M1=m1/(512*512); M2=m2/(512*512);. r=sqrt(M1.^2+M2.^2);. h=max(r);. 58.

(66) R=(r/h);. at=M1./M2;. an=atan(at);. An=(an/pi)*180;. rs=at./10000;. %---------------------------------- fitting curve --------------------------f=[0.09207 0.09289 0.09833 0.11252 0.13801 0.17595 0.22635 0.28817 0.35961 0.43824 0.52121 0.60546 0.68788 0.76554 0.83584 0.89675 0.94695 0.98609 1.01492 1.03549]; fx=[-0.5 -0.18421 0.13158 0.44737 0.76316 1.07895 1.39474 1.71053 2.02632 2.34211 2.65789 2.97368 3.28947 3.60526 3.92105 4.23684 4.55263 4.86842 5.18421 5.5];. rs1=[4.49891E-5 5.13832E-5 7.51963E-5 1.1241E-4 1.59362E-4 2.12744E-4 2.69606E-4 3.27351E-4 3.83741E-4 4.3689E-4 4.8527E-4 5.27708E-4 5.63387E-4 5.91846E-4 6.12977E-4 6.27032E-4 6.34616E-4 6.36691E-4 6.34572E-4]; rsx=[-0.18421 0.13158 0.44737 0.76316 1.07895 1.39474 1.71053 2.02632 2.34211 2.65789 2.97368 3.28947 3.60526 3.92105 4.23684 4.55263 4.86842 5.18421 5.5]; figure(1); plot(th,R,'b',fx,f,'r:'); set(gca,'xtick',[-0.5:0.5:5.5]); axis([-0.5,5.5,0,1.1]); xlabel('Voltage (V)'); ylabel('Normalized intensity'); legend('Sample data','Fittting curve'); grid on. figure(2); plot(th,rs,'b',rsx,rs1,'r:'); set(gca,'xtick',[-0.5:0.5:5.5]);. 59.

(67) axis([-0.5,5.5,0,inf]); xlabel('Voltage (V)'); ylabel('Response time (s)'); legend('Sample data','Fittting curve'); grid on. figure(3); plot(th,An); set(gca,'xtick',[0:0.2:5]); axis([0,5,0,90]); grid on. 60.

(68)