PPP2R1B基因在人類子宮頸癌之突變分析; Mutation Analysis of the PPP2R1B Gene in Cervical Cancer

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(1)壹、前言一、研究動機根據衛生署的統計資料，在台灣子宮頸癌的發生率一直居高不下，子宮頸癌對台灣婦女的威脅一直揮之不去[1]。有關子宮頸癌的成因，危險因子相當多，在 1980 年中期以後，人類乳突狀病毒(human papillomavirus; HPV)，尤其是高危險群的 HPV16 型及 18 型與子宮頸癌的關聯性，逐漸為世人所了解[2-4]。HPV 之產物 E6 蛋白質可與蛋白質 p53 結合，破壞其對細胞週期(cell cycle)之抑制作用[3]。而 E7 蛋白質可與 pRb 結合，釋出活化的 E2F，促使細胞進入細胞週期，因而與誘發子宮頸癌的形成有密切的關係[4]。然而，並非所有的 HPV 感染最後都會形成子宮頸癌。研究發現， HPV 感染的病案經追蹤九年之後，僅有 15%到 16%演變為中、重度之子宮頸上皮內腫瘤，絕大多數的感染都自然痊癒[5,6]。由此可見子宮頸癌的發生，HPV 感染只是眾多因素之一。臨床上許多疾病的發生與基因之間的關係，一直是科學研究的重點。由於分子生物技術之發展，扭轉了傳統對於臨床疾病的研究方向 [7-11]。由於，在某些特定的腫瘤，常可發現其染色體存在固定相同之異常變化，目前有一些疾病的成因，已逐漸釐清其與基因突變之間的關係。關於腫瘤的形成，人們已逐漸明暸那是一種多重步驟的過. 1.

(2) 程，當基因的損傷累積到某一的程度，其表型(phenotype)之腫瘤即因而發生。研究顯示，參與癌症的形成有兩組基因--致癌基因(oncogene) 及 (tumor suppressor gene)。癌症的發生，多數是由於基因的變化逐步累積所致。這些基因的變化，包括原始致癌基因(proto-oncogen)的活化與抑癌基因的不活化。有部分的研究指出，人類腫瘤抑制基因喪失功能，導致惡性腫瘤的形成，是兩個對偶基因同時喪失功能，這點與致癌基因的作用機轉是不一樣的[12,13]。不同於一般正常的體細胞，腫瘤細胞喪失一個對偶基因--異配子喪失現象，即(loss of heterozygosity; LOH)[14-16]。剩下的一個對偶基因，通常是因為突變而不同。異配子喪失現象常被引用為腫瘤抑制基因之標記。在肺癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸部癌及卵巢癌的組織中，於染色體 11q22-24 常可發現有異配子喪失現象[17]。實驗發現，把肺癌、乳癌或子宮頸癌細胞接種至裸鼠的同時，若一併注入一條正常的染色體 11，或一段帶有 11pter q23 之 t(X；11) 片段染色體，則可扭轉癌細胞接種後致癌的機會[17-21]。 Negrini 等人在 1992 發現，將一段正常之人類體染色體 11 注入到乳癌細胞株 MCF-7，可以抑制其細胞之生長[18]。在 1994 年，他們更進一步利用微細胞媒介染色體轉移法，將染色體 11 轉移入乳癌細胞株，在接種至雌性裸鼠皮下，證實染色體 11 之介入，可以抑制. 2.

(3) 腫瘤之形成(tumor genesity)[21]。這些實驗的結果顯示，在染色體 t(X;11)之斷裂點 11q23 往中央節 (centromere)的方向，必定存在有一個或更多的抑癌基因。很多種癌症細胞的染色體 11q23 的區域，常有 LOH 的現象。Evan 等人比對 28 組肺癌細胞株及正常組織細胞後，71%的肺癌細胞株有 LOH 現象 [22]。經 Wang 等人進一步利用 expressed sequence tag (EST) markers，對染色容易發生 LOH 的 11q23 區域進行分析，他們篩選出一段可能是抑癌基因的片段基因，而其對應的是絲胺酸-色胺酸磷酸■ (serine-threonine phosphatase)的蛋白去磷酸■PP2A 亞型(附錄一) [23]。細胞的生長、分裂，一般由細胞表面所接收的訊息控制，這些訊息經由一連串的連鎖反應，導入細胞核內，引起基因的表達。這些訊息的傳導有增強反應的正向途徑，也有負向抑制細胞分裂的反向作用途徑。當基因突變累積至某種程度，即可能活化增強反應的途徑，或使抑制作用的途徑不活化，如此將引起細胞之生長脫離正軌，而至癌化。在這些訊息傳遞(signal transduction)的途徑裡，有很多的蛋白質參與作用，而這些蛋白質的磷酸化(phosphorylation)和去磷酸化 (dephosphorylation)，正是決定其調控作用之主角。而磷酸化絲胺酸色胺酸的去磷酸化依賴的就是蛋白去磷酸■。. 3.

(4) PP2A 是一種調控細胞分裂相當重要的■，它可向下調控有絲分裂因子(mitogen-activated protein kinase:MAPK)的連鎖反應，傳達細胞增值的訊息[24]。PP2A 藉由與 protein kinase 相拮抗，或可抑制一些 oncoprotein 之作用，也與抑制腫瘤的發生有關係[25]。 Suganuma 等人在 1988 年發現 Okadaic acid(C44H66O13)與 Protein phosphatase 2A 結合後，會抑制其去磷酸化作用，相對使細胞內蛋白之磷酸化增加，進而有促進腫瘤細胞生長的能力，因而推斷絲胺酸色胺酸磷酸■正常的功能應為細胞生長的抑制者[26]。當 PP2A 和 polyomavirus T antigen 及病毒 SV-40 之 small T antigen 結合時，失去作用而致細胞增生或惡性轉化[27,28]。由於諸多的證據顯示，PP2A 受抑制時會刺激細胞生長，因此其正常之功能應為細胞生長之抑制者 [25]。 Ingebristen 等人依結構及功能之差異，將絲胺酸-色胺酸磷酸■劃分為四類：Type1 蛋白質磷酸■(PP1)，Type 2A(PP2A)，Type 2B(PP2B) 及 Type2C (PP2C) [29]。 PP2A 由三個次單元合組成：一、36kDa 大小之催化單元 Catalytic subunit(PP2A-C)；二、一個共同的 65kDa 的結構之調節副單元 Accessory subunit (PP2A-A)；三、數個不同大小 (54-74 kDa)的 regulatory B subunits 中的一個，共同形成一個 ABC 三聚體(trimer)[30,31]。由於與 AC 核心結合的 B 次單元種類很多，且存. 4.

(5) 在有多種不同的同種異構物(isoform)，所以 PP2A 磷酸■的 ABC 三聚體具有相當的異質性，而有個別相異的結構及專一性。 PP2A 的次單元 A 是一個桿狀結構，由十五個不同的蛋白質重複序列所形成 [31,32]。它可與 PP2A-C 次單元結合，也可和小的 DNA 腫瘤病毒(tumor virus)所產生的抗原蛋白質結合。PP2A 次單元乃是形成整個完全■的主架構，它會結合 PP2A-C 及 PP2A-B 產生作用。它有α及β兩種異構物，兩者的胺基酸有 86%的一致性，α-isoform 有 509 個胺基酸，β-isoform 則有 602 個胺基酸。這些 PP2A 的不同次元單位結構，其形成分別來自不同的基因密碼。在染色體 11q23 處發現的基因 PPP2R1B 即為合成 PP2A-A β isoform 的基因密碼[30-31]。人類 PPP2R1B 基因共有 15 個 exon，總長度約有 27 kb。Bora 等人在染色體 11 處已詳細釐清其位置及 DNA 序列[33]。Wang 等人並將此基因定序後的結果公布在 GenBank( accession number AF087438) [附錄二]。PPP2R1B 基因在染色體 11q23-24 的位置如下[23]。. 5.

(6) 1 magaselgtg pgaaggdgdd slypiavlid elrnedvqlr lnsikklsti alalgvertr. 61 sellpfltdt iydedevlla laeqlgnftg lvggpdfahc llpplenlat veetvvrdka 121 veslrqisqe htpvaleayf vplvkrlasg dwftsrtsac glfsvcypra snavkaeirq 181 qfrslcsddt pmvrraaask lgefakvlel dsvkseivpl ftslasdeqd svrllaveac 241 vsiaqllsqd dletlvmptl rqaaedkswr vrymvadrfs elqkamgpki tlndlipafq 301 nllkdceaev raaaahkvke lgenlpiedr etiimnqilp yikelvsdtn qhvksalasv 361 imglstilgk entiehllpl flaqlkdecp dvrlniisnl dcvnevigir qlsqsllpai 421 velaedakwr vrlaiieymp llagqlgvef fdeklnslcm awlvdhvyai reaatnnlmk 481 lvqkfgtewa qntivpkvlv mandpnylhr mttlfcinal seacgqeitt kqmlpivlkm 541 agdqvanvrf nvakslqkig pildtnalqg evkpvlqklg qdedmdvkyf aqeaisvlal 601 a. 附錄一、人類蛋白去磷酸■2A 亞型之胺基酸序列. 6.

(7) 1 gggtgaccag cagcaggagg agaaagaaca tggcgggcgc atcagagctc gggaccggcc 61 caggagcagc gggtggagat ggagatgatt cgctataccc gatcgcggtt ttaatcgacg 121 agctccgcaa tgaagacgtg cagctccgac tcaacagtat taagaagtta tcaacaattg 181 ccctagcact tggagtagaa aggacccgaa gtgaattgtt gccatttctt acagatacaa 241 tttatgatga agatgaggta ctattagctc ttgctgagca gctgggaaat ttcactggcc 301 tagtgggagg tcctgacttt gcccactgtc tgctgcctcc tttggaaaat ctggcaactg 361 tggaagagac tgttgttcgt gacaaggctg tggagtccct gagacagatc tcccaggagc 421 atactcctgt tgctctggaa gcttattttg tacctctggt gaaacgctta gcaagtgggg 481 attggttcac ctctcgcaca tctgcatgtg gtttgttcag cgtttgctat cccagggcat 541 caaatgctgt taaagcagaa atcagacagc aattccgttc cttgtgctca gatgacacac 601 caatggtacg acgtgctgct gcttccaaat tgggtgaatt tgcaaaagtt ttggaattag 661 acagtgtgaa aagtgaaatt gttccactgt tcactagtct agcttcagat gaacaggatt 721 cagtgcgcct ccttgctgtg gaagcttgtg tcagtattgc ccagttattg tctcaggatg 781 accttgagac tttggtgatg cctacacttc gacaagcagc agaagataaa tcttggcgcg 841 ttcgctatat ggtggctgac agattttcag agctccagaa agccatgggt cctaaaatca 901 ccctaaatga cctcatcccc gcctttcaga acctacttaa agactgtgaa gctgaagtcc 961 gggcagctgc tgcccacaaa gtaaaagaac ttggtgagaa cttgcccatt gaagatagag 1021 agaccataat tatgaatcaa attctgcctt atataaagga attagtatcc gataccaatc 1081 aacatgtcaa atcggctcta gcttctgtaa ttatgggatt gtctactatt ttgggcaaag 1141 aaaataccat tgaacatctt ctacctcttt tcttagctca gttaaaggat gagtgtcctg 1201 acgttcgttt gaatatcatc tccaatttgg attgtgtaaa tgaagtgatt ggaatccgtc 1261 agctctctca gtctctcctt cctgccatag tggagctggc agaagatgcc aaatggaggg 1321 tccgcctggc catcattgag tatatgccgc tgctggcagg ccagctgggt gtggaattct 1381 ttgatgaaaa gctgaattct ttatgtatgg cttggctcgt ggaccatgta tacgccatcc 1441 gagaagctgc caccaacaac ctcatgaaac tagttcagaa gtttggtaca gagtgggccc 1501 aaaatactat tgttcccaaa gtgttagtaa tggcaaatga tcctaattac ttgcatagaa 1561 tgaccacttt attctgcatt aatgcactgt ctgaggcctg tggtcaggaa ataactacta 1621 agcaaatgct gcccatcgta ttaaaaatgg caggagacca agtagcaaat gttcgcttca 1681 atgtggccaa atctctacaa aagattggac caattctaga taccaatgct ttacagggag 1741 aagtgaagcc agtactacag aagttaggtc aagatgaaga catggatgtc aaatactttg 1801 cacaggaagc tataagtgtt cttgcattgg cataatgagg agcaggaggg aaaaggcctt 1861 tactagattc ttgtcacaaa tttctagtca atgtgttctt aactgggtgg agaaagaatg 1921 ga. 附錄二、人類蛋白去磷酸■2A 亞型基因(PPP2R1B) 之完整 DNA 序列. 7.

(8) 二、研究目的許多致癌基因的產物為蛋白激■(protein kinase)，而其訊息的傳遞機轉主要憑藉的是蛋白質的磷酸化。相對的，蛋白質去磷酸化作用對細胞的惡性轉化，也應有其關鍵性之作用。研究發現 PP2A 蛋白質與 MAPK/ERKs[32]，c-raf，ret II 及 Ki-ras 致癌基因的活化有關係[34]。這些資料顯示，PP2A 在癌症的形成過程扮演一定程度的角色。最近， Wang 等人在人類多種腫瘤的細胞株及癌症組織中，發現 PP2R1B 基因的改變[23]，其中 55%的腫瘤有全部或部分的基因缺損。這些基因對應許多同種異構體的 PP2A-B 次單元，至少已有五種以上的異構體被確認定位出來，而且位於人類癌細胞基因組常發生 LOH 之區域 [35]。因此在不同的癌細胞染色體中去找尋不同異構物的基因突變，對探討 PP2A 與腫瘤發生過程的角色，有相當重要的意義。本研究的目的在探討 PPP2R1B 基因在台灣婦女子宮頸癌的變化。我們利用反轉錄-聚合■鏈反應來篩檢此基因的變化，再用直接序列來分析不同的突變形式及數目的特徵。希望能逐步分析確認 PPP2R1B 與子宮頸癌形成的關係，以期對子宮頸癌的成因有更深的了解，提供我們治療與預防的方針。. 8.

(9) 貳、材料一、樣本之準備我們總共收集 24 對子宮頸癌組織及其旁邊的正常子宮頸組織。這些組織來自 24 例子宮頸鱗狀上皮癌之病人，其臨床分期為 stage Ib 或 II a。病人在中國醫藥學院附設醫院接受子宮頸癌根治手術，手術標本取下之後，立刻切取樣本組織，切割成花生米大小，分置於離心管中，保存於液態氮冰凍以備實驗。. 二、試劑與儀器 RNAzol TMB (Biotecy Labortories Inc. , Huston TX, USA) Rnase free Dnase I (GenHunter, Brookline MA, USA) RT-PCR kit (Stratagene,La Jolla CA,USA) 1X first-strand buffer Tris-HCL (pH: 8.3) Oligo-dT primer DNTP Primer(如表一) Ampli Taq DNA polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Foster CA) 1.5 % agarose gel Perkin-Elmer Cetus DNA thermal cycler(Foster City, CA ). 9.

(10) Qiaex II gel extraction kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) Dye Terminator Cycle Sequencing Core KIT BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, Inc., San Jose, CA) DNA automatic sequencer (Applied Biosystems Inc., model 310, San Jose, CA). 10.

(11) Primers. Sequences. cDNA. Annealing. Position. Temperature. 54℃. 1st RT-PCR 5’-1. 5’- GGTGACCAGCAGCAGGAG-3’. nt –29 to –10. 3’N-1. 5’-ACCCAGTTAAGAACACATTG-3’. nt 10879-10860. Nested RT-PCR 5’-2. 5’-GCGCATCAGAGCTCGGGACCG-3’. 3’N-2. 5’-CTAGAAATTTGTGACAAGAATCTAG-3’ nt 10858-10834. 58℃. nt 8 to 18. Nested RT-PCR 5’-3. 5’-TACTATTAGCTCTTGCTGAGC-3’. 3’N-2. 5’-CTAGAAATTTGTGACAAGAATCTAG-3’ nt 10858-10834. 56℃. nt 230 to 250. Nested RT-PCR 5’-4. 5’-CCTCTGGTGAAACGCTTAGC-3’. nt 424 to 443. 3’N-2. 5’-CTAGAAATTTGTGACAAGAATCTAG-3’ nt 10858-10834. 56℃. Nested RT-PCR 5’-5. 5’-CTTCCAAATTGGGTGAATTTGC-3’. 3’N-2. 5’-CTAGAAATTTGTGACAAGAATCTAG-3’ nt 10858-10834. 表一、. PPP2R1B 反轉錄-聚合■鏈應條件. 11. 反. 應. 使. nt 593 to 614. 用. 之. 低. 54℃. 聚.

(12) 參、方法一. 萃取 RNA 整個萃取過程及其後的 RT-PCR 過程都保持無 RNase 的狀況，以求取實驗的正確性。萃取 total RNA 的方法，乃根據 Hsu 及 Chang 等人的方法[36]，利用市購的 RNAzol TMB(Biotecy labortories Inc. Huston TX, USA)加入磨碎的組織內(每 50-100 毫克的組織加入 1 毫升的 RNAzol)。於室溫下加氯仿(Chloroform)，充分混合後，於 4℃下以高速離心機，12000g 之速度離心 15 分鐘。取上清液(含 RNA)，再加入 0.5 毫升之 isopropyl alcohol，充分混合後，室溫下靜置 10 分鐘再離心(12000g，10 分鐘，4℃下)，除去上清液，留下沉澱物，再重複以酒精洗滌沉澱一次。將沉澱之 RNA 用 DEPC-treated water 溶解後保存於-70℃。萃取的 RNA 利用分光光度計 A260 測量其濃度。. 二. 反轉錄 RT(reverse transcription) 我們使用 500 ng oligo-(dT) 12-18 來將 mRNA 反轉錄成第一股 cDNA。反應所需試劑混合比例如下：500. M dNTP 混合物、加入. 200 units of SuperScriptII 之 Tris-HCL (pH8.3) 50 mM、KCl 75mM、 MgCl 2 3mM、以及 10 mM 之 DTT。試劑總量為 20. l。首先將 RNA. 及引子置於 70℃十分鐘，然後放至冰水冷卻，再加入所需試劑進行一個週期的反轉錄程序。 12.

(13) 試劑與樣本先置於 42℃反應 50 分鐘，再加熱至 70℃作用 15 分鐘以使酵素去活化。然後加入三單位的 RNase H 在 37℃作用 30 分鐘。之後保存於-20℃準備進行 PCR 分析。. 三. PCR 和 Nested RT-PCR 分析 PPP2R1B 基因之 Nested RT-PCR 所使用之引子(primer)如表一所示。第一輪的 PCR 反應過程及條件如下：取 1 ìl 的 cDNA 加入 100 ng 之各種引子(100. l)，dNTP(50 M)，PCR buffer，及 Taq. polymerase(2.5 units)充分混合，置於 Perkin-Elmer Cetus PCR Thermocycler 進行 35 週期的聚合■鏈鎖反應。反應步驟包括 94℃ 加熱 1.5 分鐘使雙股分開；再降溫 1.5 分鐘，使引子融合(溫度如表一所列)；72℃ 2.5 分鐘延伸新股長度。最後在 72℃ 5 分鐘進行最終延伸。第二輪 PCR 取 1 l 之第一輪 PCR 產物，利用 nested primers 以和第一輪相同的條件，進行 35 週期的 PCR。最終的 PCR 產物經洋菜膠電泳，跑膠後對異常條紋(band)進行序列分析。. 四. DNA 定序分析( DNA sequencing) 跑電泳後將洋菜膠上之 PCR 片段切下，以 Qiaex II gel extraction kit(Qiagen Inc., Chatswworth, CA, USA)純化。再利用 BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(Applied Biosystems, Inc. San Jose, CA, USA)廠商所提供之方法 di-deoxy chain termination 13.

(14) method 進行直接序列。然後 DNA 序列所得之樣本再以 Applied Biosystems 310 DNA automatic sequencer (Applied Biosystems, Inc., San Jose, CA ,USA)分析。. 14.

(15) 肆、結果為了了解 PPP2R1B 在台灣婦女子宮頸癌的基因變化，及探討其基因之變化與形成子宮頸癌之關聯性，我們反轉錄其 mRNA，並利用 nested-PCR 放大複製 cDNA 來篩檢此基因的變化，再用直接定序分析不同的突變形式及數目的特徵。我們分析 24 例子頸癌病人之腫瘤組織及其周邊之正常子宮頸組織。實驗結果發現，在子宮頸癌的腫瘤組織和正常的子宮頸組織，經 RT-PCR 放大複製後之 cDNA，都可發現有一段相當顯著大小為 1907 bp 之 DNA 片段。該片段之 DNA 即包含了 PPP2R1B 基因(圖一至圖三)。在 24 件腫瘤組織樣本中，我們發現其中 5 件有 aberrant transcripts；而在鄰近腫瘤之正常子宮頸組織，24 件檢體中則有 8 件檢出 aberrant transcripts。所以我們認為，這些 PPP2R1B 基因的 aberrant transcripts 與子宮頸癌的形成沒有關聯(圖一至圖三)。將這些 RT-PCR 產物之 aberrant transcripts 拿來定序分析之後，發現可分為十一種不同形式的變異(表二)。列. 的. 缺. 失. ，. 另. 外. 三. 種. 其則. 中遺. 八失. 種了. 可能發生之缺失如表二所列。這些 cDNA 短少的核. 是兩酸. 有段. 序列. 來自替代性剪接(alternative splicing)的結果，與腫瘤之形成，應無直. 15. 核.

(16) 接之關係。至於在正常組織及腫瘤組織都存在之 1907 bp 大小的 DNA 片段，經定序分析之後，顯示其為正常 PPP2R1B 基因的 cDNA。同時我們也發現其密碼子 66 之. 酸 CTA66àCTG 之多形性變化. 核. (polymorphism)現象(圖四，表三)。. 16.

(17) M. C N C N C N C N C N C N C N C N 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8. 1907bp 1Kb 500bp 100bp. 圖一、第一號至第八號病人 PPP2R1B 反轉錄-聚合■鏈反應分析洋菜膠電泳圖。1907-bp 片段為 PPP2R1B 基因的正常產物，較短的片段為 aberrant transcripts 。C:子宮頸癌組織 N:鄰近之正常組織 M: marker, Arrow:1Kb。. 17.

(18) M. C N C N C N C N C N 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14. C N C N 15 15 16 16. C N. 1907bp. 1Kb 500bp 100bp. 圖二、第九號至第十六號病人 PPP2R1B 反轉錄-聚合■鏈反應分析洋菜膠電泳圖。. 18.

(19) C N C N C N C N C N C N C N M 17 17 18 18 19 19 20 20 21 21 22 22 23 23 24 24. C N. 1907bp. 1Kb 500bp 100bp. 圖三、第十七號至第二十四號病人 PPP2R1B 反轉錄-聚合■鏈反應分析洋菜膠電泳圖。. 19.

(20) 圖四、 PPP2R1B 多形性變化區域之基因序列箭頭所指位置為 CTA66 → CTG。(A) 兩條對偶基因都是 CTG， (B)異配子狀況 heterozygous 之基因序列 (CTG/CTA)，(C) 原生種 wild type 之序列(CTA/CTA)。. 20.

(21) Case # 1N 2C 5C 6C 9C 10C 11N 12N 20N 22N 23N. cDNA alteration △ △ △ △ △ △ △ △ △ △ △. Predicted effect. nts 307-539, △ nts 689-1556 nts 190-1584 nts 190-1584 nts 170-1483 nts 140-1715 nts 165-1822 nts 56-983 nts 328-1323 nts 163-1381, △ nts 132-910 nts 236-1057 nts 56-1293. △ △ △ △ △ △ △ △ △ △ △. aa 103-180, △ aa 230-51 aa 64-528 aa 126-478, △ aa 74-479 aa 57-495 aa 46-572 aa 55-608 aa 18-328 aa 109-441 aa 54-461, △ aa 44-304 aa 78-353 aa 19-431. 表二、所有 aberrant transcripts 之大小及其可能之影響. 21.

(22) Genotype CTA/CTA CTA/CTG CTG/CTG. Frequency (%) 16 (66.7) 2 (8.3) 6 (25). 表三、 CTA66 → CTG多形性變化現象之頻率. 22.

(23) 伍、討論我們實驗的結果，發現染色體 11q22-24 處的 PPP2R1B 基因，不論是在子宮頸的腫瘤組織(5/24)、或是正常組織(8/24)都存在有異常的轉錄。根據 Wang 等人的研究，他們從肺癌、大腸癌及乳癌的腫瘤組織和癌細胞株中，都可找到 PPP2R1B 基因之多種 aberrant transcripts，因此，推斷其可能為一腫瘤抑制基因[23]。 Calin 等人對肺癌、乳癌及黑色素細胞瘤分析發現，在部分乳癌細胞的 PPP2R1B 基因有缺失(deletion)之現象。其發生比例雖然不高，但相對的，在正常組織則無此現象，故他們認為 PP2A 蛋白質應具有一定程度誘發癌症的作用[31]。 Campell 等人在卵巢腫瘤的研究，則有不同的結果。他們發現在卵巢癌的細胞中，PPP2R1B 部位雖有 32%發生 LOH 現象，然而卻沒有任何一個檢體有 aberrant transcript 的出現。因此，對於 PPP2R1B 基因可能是腫瘤抑制基因的看法，他們認為應做保留[36]。而且 Campell 等人也發現在 76 個卵巢腫瘤細胞樣本中，僅有四個之 GàA 橫移取代。這麼低的發生率。實不便以此來解釋其即為 tumor suppressor gene[36]。. 23.

(24) 我們的研究發現，前述肺癌、乳癌及大腸癌的變化，並未出現在子宮頸癌的組織中。而在少部分組織(25%)中所發現的 CTA66àCTG 橫位取代現象(transition)，應該是非病理性的多形性變化。我們的實驗經過仔細的 internal control 以求取實驗之正確性。在所有的組織都可找到一段長 1907bp 之正常的 cDNA 片段。同時在部分之檢體，包括腫瘤組織及正常組織的實驗結果，都有出現一些淡的較小的 DNA 片段。經過直接定序分析的結果，發現這些應該都是來自 PPP2R1B 基因的 alternative splicing 之產物。由於在腫瘤組織的分析中，不論細胞量的多寡，都可在 RT-PCR 產物中找到正常的轉錄片段。而且在非腫瘤之正常組織中出現 aberrant transcripts 的頻率也相當高。由此可推測 PPP2R1B 基因的 aberrant transcripts 與子宮頸癌的發生，應無直接之關係。在 Wang 等人的研究中，PPP2R1B 基因的序列變化，除了有多種 aberrant的transcripts 外，. 也. 有. 多. 處. 的. 核. 酸. 密. 碼. 變現象(point mutation)。如較常見之 G298àA 將使 Gly90 為 Asp 所取代。他們認為這雖可能是多形性變化現象，但也很可能是一種突變的結果。我們對子宮頸癌的研究中，雖然取代的位置不同，但仍然可見到呈現多形性變化的現象。最近有報告指出，在多種癌症發現有抑癌基因 PTEN/MMAC1 及. 24.

(25) FHIT 的突變現象。然而，根據 Chang[38] 和 Wang[39]的研究，這些基因的突變應為 alternative splicing 所產生的 aberrant transcription.而與癌症的發生無直接的關係。本研究的結果發現，不管在子宮頸癌或正常組織，都可找到染色體 11q22-24 處 PPP2R1B 基因的 aberrant tanscripts，我們推斷這些變化與子宮頸癌的發生應無直接的的關係。. 25.

(26) 26.

(27)