Wnt/beta-catenin訊號傳遞路徑基因:ICAT及HBP1之分子變異及肺癌臨床相關性研究

全文

(1)參、文獻總論. 一、引言 (一)臺灣肺癌的重要性根據 2007 年行政院衛生署最新統計資料顯示：2005 年國人癌症死亡率高達每十萬人口 163.8，佔當年死亡總人口數的 26.8%。在台灣地區大約每四個死亡人口就有一人死於癌症，每五個癌症死亡人口就有一人死於肺癌。肺癌死亡率在女性及男性分別高居癌症死亡的首位及第二位，每十萬女性人口肺癌死亡率為 19.9，男性則為 44.0，每年約有 7000 多人死於肺癌 (1)。近年來儘管肺癌的診治隨著醫學的進步也有相當的進展，但是肺癌的治療成果仍然有進步空間。其中最大的原因是當確定診斷出患有肺癌時，多已發生一段時間，甚至可能轉移至其他部位而難以利用手術或藥物治癒，導致死亡率偏高 (2, 3)。肺癌通常分成二大類型：小細胞肺癌 (Small cell lung cancer, SCLC) 和非小細胞肺癌 (Non-small cell lung cancer, NSCLC) ，大部分 (75-88%) 台灣地區肺癌病人是屬於非小細胞肺癌；依據組織學形態分析，又可將非小細胞肺癌分為肺腺癌 (Adenocarcinoma, AD)、鱗狀上皮細胞癌 (Squamous carcinoma, SQ) 及大細胞癌 (Large cell carcinoma, LC) 三種次形式 (4)。肺腺癌為目前肺癌數量最多的一種. 5.

(2) 類型，常常是在有遠端轉移之後才出現臨床症狀，多由血路轉移，無吸煙者罹患肺癌常為此類。鱗狀上皮細胞癌又稱表皮樣癌，常見於男性吸煙者，早期多為局部向外延伸的轉移，後期則經血路擴散。大細胞癌的生長速度較緩慢，會經由血路及淋巴擴散。非小細胞肺癌的分期簡單可分為第一、二、三 A、三 B 和四期；第一、二期屬於局部早期發現，第四期為末期已轉移到脊椎骨、腦部、肝臟、皮膚等遠處的組織。非小細胞肺癌治療的原則是依據其分期之早晚而不同，局部早期以手術治療 (開刀) 為原則，但手術後發生轉移或復發的機率甚高，第三 B 及第四期是屬於晚期無法開刀，須依病人身體狀態及意願，接受化學治療及/或放射線治療，但不能開刀的病例對化學藥物及放射線治療大多不敏感。由於上述原因，肺癌病人的預後不佳。整體而言，五年的存活率僅約 13%~15% (5)。. (二)肺癌之相關癌症基因分類以及本研究動機依據目前所知，癌症的形成牽涉了許多因素，某些環境因子會導致肺癌形成，例如：二手煙、炒菜油煙、香燭、工作場所或環境污染物可能導致肺癌的形成之外 (3, 6, 7)。遺傳因子的改變也在肺癌形成過程扮演重要角色，目前的醫學研究已經知道癌症的發生是由於許多的基因發生變異，而且是許多基因同時發生基因變異而造成。與癌症形成有關的基因主要可以分成兩大類，一為致癌基因 (oncogene) 的過度 6.

(3) 活化，如 β-catenin (8)；一為抑癌基因 (tumor suppressor gene) 的失去活性，如 p53 (9)，Retinoblastoma (Rb) (10)等。但是詳細的分子致癌機制到目前為止尚未完全清楚明瞭，因此研究台灣地區肺癌發生的原因，實在是一項刻不容緩的工作。另外，在本實驗室先前使用了 177 個微衛星標竿 (Microsatellite marker) 偵測 71 位台灣非小細胞肺癌病人全基因體異質性喪失 (Genome-wide loss of heterozygosity, LOH) (Fig. 1)，研究結果中發現，台灣地區肺癌病人的染色體 1p36.2 有很高的基因座缺失 (LOH) 頻率發生，而這區域含 ICAT 基因，經由文獻搜尋發現 ICAT 蛋白會抑制 Wnt/β-catenin 訊號傳遞路徑 (Fig. 2)；另外，有研究顯示 HBP1 抑癌基因也有抑制 Wnt/β-catenin 訊號傳遞路徑的功能。因此，本論文即是針對參與 Wnt/β-catenin 訊號傳遞路徑基因：ICAT 及 HBP1，進行一系列之基因變異分析，並偵測其啟動子甲基化情形、mRNA 與蛋白之表達情形，同時探討其與臨床病理資料之間的相關性，冀望能找出 ICAT 及 HBP1 基因與 β-catenin 蛋白及其下游基因之間的關係，並釐清與台灣地區肺癌病人有關的致病機轉。 (三)Wnt/β-catenin 訊號傳遞路徑與癌症形成之關係 Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑在早期生長發育過程中扮演重要的角色。Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑的起始，是經由 Wnt 蛋白與細胞膜 7.

(4) 上的 frizzled 受體結合，使 Dishevelled (Dvl) protein 磷酸化，造成 glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) 蛋白失去功能，因此原本細胞質中 β-catenin/APC/AXIN/AXIN2 的複合體便會分離 (11)。當細胞質中的 β-catenin 蛋白累積過多，便會進入細胞核和 T-cell factor (TCF)/LEF 蛋白結合而活化其下游基因造成許多原致癌基因過度表現，進而導致腫瘤產生 (12)。研究中發現，β-catenin 蛋白會和 TCF/LEF 蛋白結合共同活化一些會引發癌症的基因，例如:c-jun、c-myc、cyclin D1 (13, 14) 及 MMP7 (15)。在細胞核中 ICAT 及 HBP1 蛋白分別會與 β-catenin 蛋白及 TCF 蛋白結合，而減少 β-catenin 蛋白和 TCF/LEF 蛋白結合，因此無法活化其下游基因。如果當β-catenin 蛋白在細胞核不正常的累積，則其與 TCF/LEF 蛋白結合而活化其下游基因造成許多原致癌基因過度表現，進而導致腫瘤產生的機會增加；若此細胞之 β-catenin/TCF/LEF 轉錄拮抗蛋白 ICAT 及 HBP1 又失去活性，將會使腫瘤細胞更加癌化。. 二、ICAT、HBP1 抑癌基因之結構與功能 (一)ICAT 抑癌基因之結構與功能 ICAT 基因，全名為 inhibitor of β-catenin and TCF，位於染色體 1p36.2 的區域，全長 62kb，包含 6 個 exons，可轉譯出一段 81 個胺基酸的蛋白質 (16) (Fig. 3)，ICAT 蛋白的 N 端是個 helilical domain 8.

(5) 會與 β-catenin 的連續重複區域 armadillo repeats 11-12 結合，C 端會與 β-catenin 的 armadillo repeats 5-10 結合，而此區域也是 TCF 的結合位置 (17)，因此在細胞核中 ICAT 蛋白會抑制 β-catenin/TCF 與其下游基因之啟動子結合，使 β-catenin/TCF 無法活化其下游基因之轉錄表現。. (二)HBP1 抑癌基因之結構與功能 HBP1 基因，全名為 high mobility group (HMG) transcription factor 1，位於染色體 7q31 的區域，全長約 33kb，包含 11 個 exons，可轉譯出一段 514 個胺基酸的蛋白質 (Fig. 4)，包含了四個具有功能的區域，分別為 RB interaction domain (18, 19)、p38 MAPK interaction domain (20)、Repression domain (21) 和 C 端的 HMG box。其中 HMG box 具有與 DNA 結合的特性，因此 HBP1 的功能為轉錄因子；RB interaction domain 與 RB 結合後會抑制細胞週期的進行並調控細胞的分化；p38 MAPK interaction domain 則會被 p38 MAPK 結合而抑制 HBP1 下游基因 cyclin D1 的轉錄活性，因此抑制細胞週期的進行；而 repression domain 會與 TCF 結合，而抑制 TCF 所調控基因的轉錄活性。上述的 4 種區域在其它能引起 protein-protein interaction 的蛋白質中都有存在，因此推測它們具有蛋白質交互作用的功能 (protein-protein interaction)。 9.

(6) 三、ICAT、HBP1 基因異常與癌症形成的相關報導 (一)ICAT、HBP1 基因/蛋白在其他癌症之異常情形有許多文獻指出，ICAT 基因位於染色體 1p36.2 的區域，此染色體區域在許多癌症中均發現常有基因座缺失 Loss of heterozygosity (LOH) 的情形，包括：神經母細胞瘤 (neuroblastoma)、大腸直腸癌 (colorectal cancer) 、乳癌 (breast cancer) 及肝癌 (heptocellular carcinoma) (22-25)。另外也有研究指出，ICAT 會抑制 APC 及 β-catenin 突變的大腸直腸癌細胞增生和 Axin 突變的肝癌細胞的增生，研究中亦發現 ICAT 會抑制 G2-M 調控蛋白的表現，即抑制 Cdc2 去磷酸化以及 cyclin B1 進入細胞核，因此推論，ICAT 抑制大腸直腸癌細胞增生的機制是引發細胞 G2/M arrest，接著細胞死亡 (apoptosis) (26)。另外，在黑色素瘤 (malignant melanomas) 的研究中發現，ICAT 基因位於染色體 1p36 的區域有 40% LOH 的頻率發生，而 ICAT mRNA 也有 78%的低表達情形 (27)。目前已有一些研究顯示 HBP1 基因可能為抑癌基因，HBP1 基因位於染色體 7q31.1 的位置，而此區域常在癌症中發現有基因座缺失或染色體易位 (chromosomal translocation) 的情形，例如：卵巢癌 (ovarian cancer) (28, 29)、前列腺癌 (prostate carcinomas) (30)、乳癌 (31)、鳞狀細胞癌、結腸癌 (32)、急性骨髓性白血病 (33) 中均發現 10.

(7) 有基因缺失的情形。在脂肪及肌肉細胞中發現，HBP1 會抑制 G1 progression (34) 並會阻斷 Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑 (35)，因此可能形成癌症。在乳癌細胞的研究中，發現 HBP1 失去功能與乳癌細胞的轉移 (invasive) 有正相關，而在轉移的病例中有 30%的 HBP1 突變發生 (36)。. (二)ICAT、HBP1 基因/蛋白在肺癌之異常情形本實驗室先前基因體缺失的研究中，使用 ICAT 基因的 microsatellite marker D1S1612 和 D1S1597 以及 HBP1 基因的 microsatellite marker D7S1818 和 D7S820，偵測到台灣非小細胞肺癌病人 ICAT 和 HBP1 發生 41% 和 17% 的基因異質性喪失 (37)。文獻中目前尚未有完整分析 ICAT 和 HBP1 此兩基因在肺癌細胞中 DNA、 mRNA 和 protein 層面的研究，希望藉由此次研究建立參與 Wnt/β-catenin 訊號傳遞途徑中的兩個成員- ICAT 和 HBP1 在台灣肺癌形成之機制和角色，並探討 ICAT 和 HBP1 基因變異是否與肺癌細胞中 β-catenin 下游基因轉錄過度活化有相關性。. 11.

(8) 肆、研究目標. 本研究主要探討參與 wnt/β-catenin 訊號傳遞路徑基因 ICAT 及 HBP1 之變異與台灣地區非小細胞肺癌形成之機制。. 1. 探討台灣地區肺癌病人 ICAT 和 HBP1 基因/蛋白變異情形 (蛋白質表現、mRNA 表現及啟動子高度甲基化情形)，並探討各種變異機制及其之間的相關性。. 2. 探討 ICAT 和 HBP1 基因/蛋白變異狀況和肺癌病人臨床病歷資料 (如性別、年齡、抽煙習慣、癌症種類、癌症分期、存活率) 之間的相關性。. 3. 探討台灣地區肺癌病人 ICAT、HBP1 異常與 β-catenin 蛋白轉錄活化（例如 β-catenin 對於下游基因轉錄活性影響）間之相關性。. 4. 將細胞株以去甲基化藥物 5’-aza-2’-dC 處理，以探討 ICAT 及 HBP1 mRNA 重新表現結果的變化，及其對 β-catenin 蛋白轉錄功能抑制之相關性。. 12.

(9) 伍、方法總論一、研究材料檢體來源及病歷資料 95 個肺癌檢體來自臺北榮總胸腔外科，其中多是屬於非小細胞肺腫瘤 (non-small cell lung cancer，NSCLC)，檢體包括 54 個肺腺癌 (Adenocarcinoma, AD) 病人、34 個鱗狀上皮細胞肺癌 (Squamous carcinoma, SQ) 病人，少部分為 AD、SQ 混合型或大細胞肺癌 (Large cell carcinoma, LC)。肺癌種類以及期數是根據世界衛生組織 (World Health Organization, WHO) 分類方法及 TNM system (T=primary Tumor；N=Regional Lymph Node；M=Distant Metastasis) 所分類。病歷資料尚包括病人的抽煙狀態:分為吸煙及沒吸煙族群，前者包含目前仍吸煙及已戒煙兩群人。外科手術之後追蹤調查其預後的情形，為第一年每兩個月追蹤調查一次，之後每三個月調查一次，追蹤至 2006 年 11 月，而所有病人的平均追蹤期為 29 個月 (分佈為 2 至 53 個月)，其中至追蹤期結束仍存活的 80 位病人，其平均追蹤期為 31 個月 (分佈為 2 至 53 個月)；至追蹤期結束已死亡的 15 位病人，其平均追蹤期為 18.5 個月 (分佈為 4 至 42 個月)。. 13.

(10) 二、β-Catenin、ICAT 與 HBP1 蛋白表現分析 1.免疫組織染色分析 (Immunohistochemistry assay, IHC) 95 個病人樣本經福馬林浸潤，包埋在石蠟的 5μm 的肺癌組織切片，經 xylene 脫蠟及酒精復水後，用 primary antibody (分析濃度及廠牌見 Table 1) 偵測蛋白表現，再使用 Biotinylated secondary antibody (DAKO LSAB kit K0675, DAKO, Carpinteria, CA, USA) 和 primary antibody 結合，再接以 streptavidin-horseradish peroxidase，此過氧化氫酵素會與 3-amino-9-ethylcarbazole containing hydrogen peroxide, AEC+Substrate-Chromogen 受質反應而呈色，使染色具有放大的效果，最後切片再經 hematoxylin (DAKO) 染色，使背景呈色，即以 mounting solution (ZYMED, San Francisco, CA, USA) 進行封片。 2.染色切片之判讀標準染色後的判讀標準：(a) 在癌組織中，細胞核沒有紅褐色反應，但其周圍之正常細胞，細胞核有紅褐色反應 (internal control)，則稱為 negative expression；(b) 在癌組織中，細胞核有紅褐色反應，則為 positive expression。經由與其他文獻 (38) 及實驗資料做一比對，所訂定出的判讀標準為： β-Catenin：為多功能蛋白，可分佈在細胞膜、質、核，因為 β-catenin. 14.

(11) 在細胞核中過度的表現會活化其下游基因表現，我們主要觀察 β-catenin 在細胞核表現，若大於 60% 細胞核有褐色反應，則歸為 β-catenin 不正常累積之病人。 ICAT：為細胞核蛋白，若<40%癌細胞核有紅褐色反應，則歸為 ICAT 低表達病人；>40%癌細胞有紅褐色反應，則歸為正常表達病人。 HBP1：為細胞核蛋白，若<40%癌細胞核有紅褐色反應，則歸為 HBP1 低表達病人；>40%癌細胞有紅褐色反應，則歸為正常表達病人。. 三、ICAT 與 HBP1 基因 mRNA 分析 1.mRNA 萃取 95 個癌組織樣本經外科手術切除癌組織塊及鄰近正常組織塊之後，以液態氮急速冷凍，mRNA 的萃取則是將組織塊由液態氮取出搗碎磨成粉之後，利用 TRIZOL 溶液 (GIBCO BRL, Life Technology, USA) 萃取，而 RNA 的濃度及純度則分別以吸光值 A260 及 A260/280 的比值 (1.8-2.0) 推算出來。. 2. 反轉錄 - 聚合酵素連鎖反應 (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 15.

(12) 由病人之正常細胞與肺癌組織塊所萃取出之 mRNA，經反轉錄酵素反應 (Reverse transcriptase reaction, RT) 後製成 cDNA，其過程為：總反應體積為 20 μl，包括 50 unit 之 SuperSCRIPTTM 反轉錄酵素 (Gibco)、4 μl 的 5 倍緩衝溶液、2.5 μg 之 RNA、0.2 μg 之 oligo dT 引子和 0.1mM 之 dNTP。此反應物於 70℃加熱 10 分鐘後，置於 42℃反應 50 分鐘，再以 70℃加熱 10 分鐘，最後加入 80 μl 去離子水 (ddH2O)，保存於-20℃。ICAT、HBP1、MMP7 基因 mRNA 表現程度即是以 cDNA 進行 PCR，並佐以 GAPDH 基因之 mRNA 表現程度做為 internal control，其值當作此檢體基因表現的基準值，來計算所欲偵測基因片段的基因表現相對值，再算出所欲偵測之基因其 cDNA 表現量，藉此偵測 ICAT、HBP1、MMP7 基因 mRNA 表現情形。PCR 產物總體積為 25 μl，其中包含 1 μl cDNA、10xPCR buffer (Takara)、 0.2mM dNTP、10 pmol PCR 引子和 0.1 μl Taq (Takara)，PCR 引子設計 (Table 2) 和反應條件如下： ICAT-cDNA：95oC、5 分鐘將雙股 DNA 打開，接下來做下列步驟 32 個循環：Denature 溫度 95oC、30 秒，引子黏合溫度值 (Tm 值) 65oC、30 秒，Extension 溫度 72oC、30 秒，最後 72oC、10 分鐘結束反應。 HBP1-cDNA：95oC、5 分鐘將雙股 DNA 打開，接下來做下列步驟 35. 16.

(13) 個循環：Denature 溫度 95oC、30 秒，引子 Tm 值 60oC、 30 秒，Extension 溫度 72 oC、30 秒，最後 72oC、10 分鐘結束反應。 MMP7-cDNA：95oC、5 分鐘將雙股 DNA 打開，接下來做下列步驟 35 個循環：Denature 溫度 95oC、30 秒，引子 Tm 值 60oC、30 秒，Extension 溫度 72 oC、30 秒，最後 72oC、 10 分鐘結束反應 GAPDH-cDNA：95oC、5 分鐘將雙股 DNA 打開，接下來做下列步驟 30 個循環：Denature 溫度 95oC、30 秒，引子 Tm 值 55oC、30 秒，Extension 溫度 72oC、30 秒，最後 72oC、 10 分鐘結束反應。反應完成之 PCR 產物以 1.5%洋菜膠進行電泳，並以 ethidium bromide 染色 10 分鐘，最後以紫外光顯影照相分析儀定量 cDNA 強度之 Integrated Density Value (IDV 值)。. 3.判讀標準每個檢體之正常細胞和肺癌細胞的 ICAT、HBP1、MMP7 cDNA 強度 (IDV 值)，以 GAPDH cDNA 強度 (IDV 值) 校正後，再將肺癌細胞與正常細胞相比，若相比之後，肺癌細胞/正常細胞之值小於 0.5，. 17.

(14) 則判定為低度表達 (39)。. 四、ICAT、HBP1 基因啟動子過度甲基化分析 1.DNA 萃取 95 個肺癌組織樣本之組織塊及鄰近正常組織，在液態氮中分別搗碎磨成粉後，加入 800µl lysis buffer (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.4%SDS and 0.4mg/ml proteinase K)，水浴 56oC， 2-3 小時後，以 phenol-chloroform 萃取出上清液。依次加入 RNase (40µg/ml)，56oC，45 分鐘；proteinase K (0.2 mg/ml) 及 SDS (0.1%)， 56oC，45 分鐘後，利用 phenol-chloroform 以及酒精沉澱的步驟純化出 DNA，每管樣本以 50µl 的無菌水溶解，存放在-80oC 冰箱中保存備用。 2.Methylation-specific PCR, MSP assay 將 DNA 用 sodium bisulfite 處理 16 小時之後，若此 DNA 之 CpG islands 沒有甲基化，則 cytosines 便會轉變為 uracil；反之，若此 DNA 之 CpG island 有甲基化的話，則 cytosines 便不會轉變為 uracil；因此，經過 sodium bisulfite 處理的甲基化與沒有甲基化之 DNA 序列是不同的，利用設計不同之引子 (Table 2) 來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，以判讀啟動子是否有過度甲基化的情形。PCR 產物總體積為 18.

(15) 25µl，其中包含 6μl DNA，Gold 10XPCR buffer，2.5mM 的 MgCl2， 2.5mM dNTP，10pmol PCR 引子和 0.2μl 的 AmpliTaq polymerase (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) ，PCR 反應條件如下： ICAT-methyl-U：95oC、10 分鐘，再經 40 個循環：95oC、30 秒，Tm 值 57oC、30 秒，72oC、30 秒，最後 72oC、10 分鐘結束反應。 ICAT-methyl-M：95oC、10 分鐘，再經 40 個循環：95oC、30 秒，Tm 值 55oC、30 秒，72oC、30 秒，之後再經 35 個循環： 95oC、30 秒，Tm 值 58oC、30 秒，最後 72oC、10 分鐘結束反應。 HBP1-methyl-U：95oC、10 分鐘，再經 35 個循環：95oC、30 秒，Tm 值 55oC、30 秒，72oC、30 秒，最後 72oC、10 分鐘結束反應。 HBP1-methyl-M：95oC、10 分鐘，再經 20 個循環：95oC、30 秒，Tm 值 65oC、30 秒，72oC、30 秒，之後再經 30 個循環： 95oC、30 秒，Tm 值 70oC、30 秒，最後 72oC、10 分鐘結束反應。 3.判讀標準：若在設計增量有甲基化之引子得到 PCR 產物多於未甲基化的， 19.

(16) 則判定此病人啟動子有甲基化情形發生 (39)。. 五、細胞處以去甲基化藥物 5’-aza-2’-deoxycytidine (5'-Aza-2'-dC) 之相關分析 1.細胞培養將肺癌細胞株 CL1-5 及 CL1-5-F4 以培養基 DMEM 培養於 37oC、 5%CO2 培養箱中；細胞株以倒立式顯微鏡觀察，當細胞長滿為單層 (monolayer) 時，即可進行繼代培養 (subculture) 。在無菌操作台 (laminar flow) 內，以抽氣機吸去上層液，再以 5 ml phosphate-buffered saline (PBS) 清洗細胞兩次，吸去 PBS 並加 1 倍 trypsin-EDTA 1ml，前後左右搖晃培養皿使 trypsin 均勻分散於細胞層，並置於培養箱中約 2~3 分鐘後，搖晃培養皿同時以倒立式顯微鏡觀察，待細胞層脫落並浮起時，取適當比例的細胞於新的培養基中 (至總體積 8ml)，以十字型搖散細胞，培養在 37oC，5% CO2 培養箱中；待 2-3 天細胞株長滿培養皿後，即可再行繼代培養。. 2.細胞加藥處理本研究以去甲基化藥物 5'-Aza-2'-dC 處理肺癌細胞株 CL1-5 及 CL1-5-F4。於加藥的前一天取1x106 細胞種於10cm細胞培養基中培 20.

(17) 養，隔天加入5μM的去甲基化藥物5’-Aza-2’-dC處理細胞，之後在繼代培養時同時加入5μM的去甲基化藥物5’-Aza-2’-dC處理細胞至少3 細胞代數 (cell doubling)。處理指定時間後，每盤細胞分別抽出RNA 及DNA以做分析。. 3.細胞株DNA及mRNA的抽取、定量及分析使用 QIAamp DNA Mini Kit 抽取細胞株的 DNA，首先將培養皿上的 DMEM 吸乾，拿刮杓將細胞刮至乾淨的 eppendorf 中，加入 20μl Proteinase K 及 200μl Buffer AL，水浴 56 oC，10 分鐘後加入 200μl 99.9% 酒精，將所有檢體放入 QIAamp spin column，離心 8000 rpm 1 分鐘，之後再分別加入 500μl Buffer AW1 及 AW2，離心後，需將 column 下收集管內的 buffer 移除，最後將 QIAamp spin column 置於乾淨的 eppendorf 上，並加入 200μl Buffer AE 於室溫下 1 分鐘，離心、收集 DNA 定量備用。細胞株 DNA 分析採用 MSP 方法，與「方法四」中基因啟動子高度甲基化分析相同。至於細胞株 mRNA 的抽取、定量及 RT-PCR 方法則與「方法三」中基因 mRNA 分析相同。. 六、統計分析. 21.

(18) 以分析的結果將病人區分為變異組與正常組，利用 Pearson χ2 test，分析 95 個肺癌病人其 ICAT 及 HBP1 啟動子過度甲基化、mRNA 之表現情形及蛋白異常表現與各種病理分類 (包含性別、年齡、癌症種類、癌症分期、抽煙狀況) 關係的統計分析。其中癌症分期之 Stage I、II 定義為較早期的病人族群，Stage III、IV 定義為較晚期的病人族群；而抽煙狀況則分為有抽煙和沒抽煙兩個族群，有抽煙者包含目前仍在抽煙和已戒煙者，所有分析作業均以 SPSS (11.0 版) 軟體進行。預後分析方面，利用 Kaplan-Meier 方法，以時間和存活率分別為橫、縱軸而計算出 median survival time (40)；Life test 則用以計算兩群體間存活的差異性。. 22.

(19) 陸、結果. 一、探討臺灣地區肺癌病人 ICAT 基因/蛋白之變異情形 (ㄧ) ICAT 蛋白表達情形與病歷資料相關性利用免疫組織染色法，分析 95 位 NSCLC 病人的癌組織切片之 ICAT 蛋白表現，染色代表圖見 (Fig. 5A-D)。實驗結果顯示：在分析的 95 個檢體中，有 26% (25/95) 的病人，其癌組織切片之癌細胞的細胞核褐色反應小於 40%，判定為 ICAT 蛋白低表達或不表達的病人；另外在病歷資料分析方面，發現 ICAT 蛋白低表達或不表達的情形，與病人之性別、年齡、抽煙狀況、癌症種類、癌症分期間並無明顯相關性 (P>0.05) (Table 3)。. (二) ICAT mRNA 表達情形與病歷資料相關性利用 RT-PCR 方法，分析 95 位 NSCLC 病人癌組織及其鄰近正常組織 ICAT mRNA 表達情形，引子所夾的區域為 exon3 至 exon6，全長為 347bp，RT-PCR 代表圖見 (Fig. 6A)。實驗結果顯示：在檢驗中的 95 個檢體中，有 37.9% (36/95) 的病人，其癌組織 mRNA 表現比正常細胞降低一半以上；另外在病歷資料分析方面，發現 ICAT mRNA 低表達或不表達的情形，與病人之性別、年齡、抽煙狀況、癌症種類、 23.

(20) 癌症分期間並無明顯相關性 (P>0.05) (Table 3)。值得注意的是，ICAT 基因 mRNA 低表達之肺癌病人其存活率有較 ICAT mRNA 正常表達者顯著的下降 (P=0.025) (Fig. 7A)；另外，ICAT mRNA 低表達之肺腺癌病人其存活率亦有較 ICAT 正常表達者顯著的下降 (P=0.048) (Fig. 7B) (三) ICAT 基因啟動子過度甲基化情形與病歷資料相關性利用設計不同之引子來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，甲基化引子所夾長度為 114bp (-664~-777bp)，沒有甲基化引子所夾長度為 125bp (-656~-780bp)，MSP 代表圖見 (Fig. 8A)。實驗結果顯示：在分析的 95 位病人中，有 36.8% (35/95) 病人的 ICAT 基因啟動子有過度甲基化的情形，另外在病歷資料分析方面，發現 ICAT 啟動子高度甲基化情形，與病人之年齡、抽煙狀況、癌症種類、癌症分期間並無明顯相關性存在 (P>0.05);但值得注意的是，在性別方面，女性的 ICAT 基因啟動子甲基化情形有高於男性的趨勢 (P＝0.058) (Table 3)。. (四) ICAT mRNA、蛋白不表達與啟動子甲基化間之相關性利用 Pearson χ2 test 分析 ICAT mRNA、蛋白不表達與啟動子甲基化之間的相關性 (Fig. 9A)。首先分析 ICAT mRNA 與蛋白表達間的相關性，結果 mRNA 有表達/蛋白亦有表達，與 mRNA 低表達/蛋白亦. 24.

(21) 低表達的病人佔全部之 73.7% (70/95)，且達顯著相關 (P<0.001)；而在啟動子甲基化與否和 mRNA 表達情形方面，發現啟動子過度甲基化/mRNA 低表達，與啟動子沒有過度甲基化/mRNA 有表達的病人佔全部之 63% (60/95)，二者間達顯著相關性 (P＝0.038)；至於啟動子過度甲基化和蛋白表達之間並無明顯相關性存在 (P>0.05)。. 二、探討臺灣地區肺癌病人 HBP1 基因/蛋白之變異情形. (一) HBP1 蛋白表達情形與病歷資料相關性利用免疫組織染色法，分析 95 位 NSCLC 病人的癌組織切片之 HBP1 蛋白表現，染色代表圖見(Fig. 5E-H)。實驗結果顯示：在分析的 95 個檢體中，有 31.6% (30/95) 的病人，其癌組織切片之癌細胞的細胞核褐色反應小於 40%，判定為 HBP1 蛋白低表達或不表達的病人；另外在病歷資料分析方面，發現 HBP1 蛋白低表達或不表達的情形，與病人之性別、年齡、抽煙狀況、癌症種類、癌症分期間並無明顯相關性存在 (P>0.05) (Table 4)。. (二) HBP1 mRNA 表達情形與病歷資料相關性利用 RT-PCR 方法，分析 95 位 NSCLC 病人癌組織及其鄰近正常組織 HBP1 mRNA 表達情形，引子所夾的區域為 exon9 至 exon11， 25.

(22) 全長為 396bp，RT-PCR 代表圖見(Fig. 6B)。實驗結果顯示：在檢驗中的 95 個檢體中，有 33.7% (32/95) 的病人，其癌組織 mRNA 表現比正常細胞降低一半以上；另外在病歷資料分析方面，發現 HBP1 mRNA 低表達或不表達的情形，與病人之性別、癌症種類、癌症分期間並無明顯相關性 (P>0.05) 。但值得注意的是，有抽煙習慣病人中， HBP1 mRNA 低表達頻率高於未抽菸的病人 (P=0.035)；在癌症種類方面，發現在鱗狀上皮細胞肺癌病人中，HBP1 mRNA 低表達頻率也高於腺肺癌病人 (P=0.021) (Table 4)。. (三) HBP1 基因啟動子過度甲基化情形與病歷資料相關性利用設計不同之引子來增量甲基化及沒有甲基化之 DNA，甲基化引子所夾長度為 222bp (-153~69bp)，沒有甲基化引子所夾長度為 223bp (-153~70bp)，MSP 代表圖見 (Fig. 8B)。實驗結果顯示：在分析的 95 位病人中，有 45.3% (43/95) 病人的 HBP1 基因啟動子有過度甲基化的情形，另外在病歷資料分析方面，發現 HBP1 啟動子高度甲基化情形，與病人之性別、年齡、抽煙狀況、癌症種類、癌症分期間並無明顯相關性存在 (P>0.05) (Table 4)。. (四) HBP1 mRNA、蛋白不表達與啟動子甲基化間之相關性利用 Pearson χ2 test 分析 HBP1 mRNA、蛋白不表達與啟動子甲 26.

(23) 基化之間的相關性 (Fig. 9B)。首先分析 HBP1 mRNA 與蛋白表達間的相關性，結果 mRNA 有表達/蛋白亦有表達，與 mRNA 低表達/蛋白亦低表達的病人佔全部之 68% (65/95)，二者間達顯著相關性 (P=0.006)；啟動子甲基化與否和 mRNA 表達情形相符合者佔 63% (60/95)，且達顯著相關 (P=0.016)；而啟動子甲基化與否和蛋白表達情形相符合者佔 61% (58/95)，且達顯著相關 (P=0.05)。. 三、探討臺灣地區肺癌病人 β-catenin 蛋白及其下游基因 MMP7 之變異情形利用免疫組織染色法，分析 95 位 NSCLC 病人的癌組織切片之 β-catenin 蛋白表現，染色代表圖見 (Fig. 5I-L)。實驗結果顯示：在分析的 95 個檢體中，有 42% (40/95) 的病人，其癌組織切片之癌細胞的細胞核褐色反應大於 60%，判定為 β-catenin 蛋白在細胞核過度表達的病人。另外在病歷資料分析方面，發現 β-catenin 蛋白過度表達的情形，與病人之性別、年齡、抽煙狀況、癌症種類、癌症分期間並無明顯相關性 (P>0.05) (Table 5)。在分析的 50 位病人中，β-catenin 蛋白過度表現的有 26 位，其中 HBP1 蛋白低表達的有 10 位，再檢查 β-catenin 蛋白下游基因 MMP7 (Fig. 6C) 之表現，其中有 8 位 (80%) 其 MMP7 基因為過度表達的情形 (Table 6)。. 27.

(24) 四、細胞以去甲基化藥物 5’-aza-2’-deoxycytidine (5’-Aza-2’-dC) 之處理結果 5’-Aza-2’-dC 為 cytosine 的類似物，在細胞進行複製時，會鑲嵌到 DNA 中取代 cytosine，使所有的 cytosine 都呈現沒有甲基化現象。我們將原本為 HPB1 過度甲基化及 mRNA 低表達之 CL1-5 細胞處理 5’-Aza-2’-dC (5μM, 3 細胞代數)，觀察當 HBP1 基因啟動子去甲基化之後，對 HBP1 基因的 mRNA 的表現影響如何？研究結果顯示：當細胞處以 5’-Aza-2’-dC 之後，會使 CL1-5 細胞株的 HBP1 基因啟動子去甲基化 (Fig. 10A)，且伴隨者 HBP1 mRNA 表現量上升 (Fig. 10B)。因此我們推論：HBP1 基因啟動子甲基化確實會對其 mRNA 的表現造成重要的影響。. 28.

(25) 柒、討論肺癌在國內為十大癌症死亡原因之一，且有逐年增加的趨勢。根據衛生署最新統計，肺癌在國人癌症排行中，男性居第二，女性居首位 (1)。由於肺癌難以早期偵測，開刀成功率或化療效果皆不理想，而預後情況差，通常診斷發現時已屆末期，導致死亡率偏高。而肺部是一個與空氣直接接觸的臟器，一些空氣污染物容易進入肺臟，再加上許多肺癌患者有抽煙或接觸環境中致癌因子的情形，如果長期受到致癌因子的刺激，可能直接或間接的啟動一些訊號傳遞路徑，而造成細胞無限制的增生與擴散，就可能導致癌細胞的形成。在許多文獻中已知，Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑主要參與胚胎發育過程及癌症的形成 (12, 41)。如果 Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑中的基因發生變異，形成癌症的機率將會非常高，因此，研究 Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑中的基因在肺癌患者中的變異情形，是非常重要之課題。近年來，探討 Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑與癌症之間相關性，主要是研究分解 β-catenin 蛋白機制有關成員的變異情形，若調控 β-catenin 分解的蛋白質發生變異，會導致 β-catenin 蛋白在細胞核中不正常的累積，而形成癌症。例如：在大腸直腸癌細胞中常觀察到有 APC 抑癌基因的突變 (42)；Axin 突變則可能造成肝癌發生 (43)。由於文獻顯示 β-catenin 蛋白會和 TCF 蛋白結合共同活化一些會 29.

(26) 引發癌症的基因，例如:c-jun、c-myc、cyclin D1 及 MMP7 (13, 14)。在細胞核中 ICAT 及 HBP1 蛋白分別會與 β-catenin 蛋白及 TCF 蛋白結合，而減少 β-catenin 蛋白和 TCF 蛋白結合，因此無法活化其下游基因。因此，本研究主要是探討位於細胞核中，會拮抗 β-catenin 蛋白與 TCF 轉錄因子之間轉錄活化功能的兩個蛋白質 ICAT 和 HBP1 的變異情形。我們針對 95 位台灣 NSCLC 病人的 ICAT 與 HBP1 基因之啟動子甲基化、mRNA 以及蛋白質表現做一完整的探討，並且和 β-catenin/TCF 下游目標基因 MMP7 mRNA 表現與病人病歷資料做統計分析。目前已知，在肺癌病人中 ICAT 基因所在的染色體 1p36.2 位置有很高的 LOH 頻率 (37, 44)，但對於 ICAT 基因變異在肺癌中的重要性則未有文獻報導。本研究結果顯示，在 95 位病人中，有 26% 的 ICAT 蛋白質表現降低；在 RNA 層面，有 37.9% 的癌組織 mRNA 表現量比正常組織降低了一半以上；在 DNA 層面，有 36.8% 的 ICAT 基因啟動子有高度甲基化情形，且多發生在女性，具有達邊緣統計相關。我們將 ICAT 基因、mRNA 及蛋白質表現做統計分析，發現 ICAT 基因之蛋白質與 mRNA 之間的表現呈統計上顯著性，而 ICAT mRNA 低表現與其啟動子過度甲基化之間也呈統計上顯著性。由此可知，ICAT 啟動子甲基化與否可能會影響其轉錄調控作用。未來將以甲基酵素抑 30.

(27) 制劑處理的細胞模式來證實 ICAT 基因不表現之主要機制為啟動子過度甲基化。至於 ICAT mRNA 低表達者在肺癌病人有較差的存活率，未來此存活率分析可針對肺癌病人做一個大規模研究，以確定 ICAT 低表達者是否可以作為肺癌臨床應用性的存活率分子指標。在 HBP1 基因方面，有 31.6% 的蛋白質表現降低，且多發生在鳞狀上皮細胞肺癌的病人；而有 33.7% 的癌組織中其 mRNA 表現量比正常組織降低一半以上，且 mRNA 低表達情形通常發生在有抽菸習慣及鱗狀上皮細胞肺癌的病人；有 45.3% 其啟動子有甲基的現象。我們將 HBP1 基因、mRNA 及蛋白質表現做統計分析，結果顯示 HBP1 蛋白、mRNA 和啟動子甲基化三者之間具有相當高的一致性。因此，HBP1 基因啟動子甲基化與否可能會影響其轉錄調控作用。去甲基化藥物 5’-Aza-2’-dC 處理肺癌細胞株 CL1-5 的研究結果發現：當 CL1-5 以 5’-Aza-2’-dC 去甲基化藥物處理之後， HBP1 基因的 mRNA 表現量會上升。因此我們推論，肺癌病人中， HBP1 基因啟動子的甲基化與否，確實會對其 mRNA 的表現造成影響。另外，本研究將 Wnt/β-catenin 訊號傳遞路徑中，ICAT 及 HBP1 蛋白分析，結果顯示：在 95 位病人中，此兩蛋白同時發生變異的只有 6 位，但 ICAT 和 HBP1 任一蛋白質有不正常表現 (低表達) 的情形則有 49 人 (51.6%)。此結果顯示，這兩個抑癌基因對於肺癌的形 31.

(28) 成具有相當的重要性，只要一個基因發生變異，可能就會造成 Wnt/β-catenin 訊號傳遞路徑的異常活化而導致癌症發生。在臨床病理資料的分析方面，顯示 ICAT 低表現與肺腺癌病人的存活率有關，而 HBP1 基因變異則較好發於鱗狀上皮細胞肺癌的病人，顯示此二基因分別在二個主要的肺癌次形式癌症佔有一重要角色。本研究亦分析了 β-catenin/TCF 的下游目標基因 MMP7 的變異情形，在分析的 50 位病人中，發現 β-catenin 蛋白與 MMP7 mRNA 同時過度表達或同時正常表現者有相當高的一致性。而這 50 位病人中有 26 人有 β-catenin 蛋白過度活化的現象，其中有 10 人有 HBP1 蛋白低表達情形，再分析 β-catenin 蛋白下游基因 MMP7 的表現，發現有 80% (8/10) 的病人有 MMP7 mRNA 低表達情形，結果顯示 HBP1 蛋白的變異，的確會失去對 β-catenin/TCF 的調控作用而活化其下游基因 MMP7，而造成細胞無限制的增生與擴散，就可能導致癌細胞的形成。. 32.

(29) 捌、結論及研究應用與未來工作. 結論：Wntβ-catenin 訊息傳遞路徑基因 β-catenin、ICAT 和 HBP1 在台灣非小細胞肺癌形成中扮演重要角色。當 β-catenin 蛋白大量在細胞核中累積，ICAT 或 HBP1 蛋白若發生變異（主要由啟動子過度甲基化）而失去其抑制 β-catenin/TCF 的活化轉錄功能，可能是造成肺癌形成的重要原因。. 未來工作： 1. 持續完成 CL1-5-F4 細胞處理 5’-Aza-2’-dC 後，觀察當 ICAT 基因啟動子去甲基化之後，對 ICAT 基因的 mRNA 的表現影響如何？ 2. 利用 siRNA 的方法在細胞模式中研究 ICAT 和 HBP1 蛋白拮抗 β-catenin/TCF 轉錄活化的影響。目前我們只針對 Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑中的 ICAT 和 HBP1 做分析，但是由於 Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑中基因並不止於這兩者，且癌症形成牽涉許多基因的變異，因此我們未來還需要將參與 Wnt/β-catenin 訊息傳遞路徑中基因 (如：Wif-1、Gask-3β、Dvl 和 APC… 等) 做更深入的探討。. 33.

(30)