石墨烯與金奈米粒子疊層結構材料應用於基質輔助雷射脫附游離質譜儀之分析

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(1)國立臺灣大學師範大學化學系碩士論文. 石墨烯與金奈米粒子疊層結構材料應用於基質輔助雷射脫附游離質譜儀之分析 Layer by layer Matrix Based on Reduced Graphene Oxide - Au Nanoparticles (rGO -Au) for MALDI-TOF analysis. 研究生：邱瑀指導教授：陳家俊博士中華民國一百零一年六月. I.

(2) 總目錄總目錄......................................................................................................... I 謝誌............................................................................................................ V 中文摘要 ................................................................................................. VI Abstract ................................................................................................... VII 第一章緒論 ................................................................................................ 1 1-1 石墨烯簡介 .......................................................................................1 1-2 金奈米粒子介紹 ..............................................................................3 1-3 MALDI 近年文獻回顧 ....................................................................5 1-4 研究動機 ........................................................................................12 第二章基質輔助雷射脫附游離質譜儀介紹 ..........................................13 2-1 MALDI 的發展 ...............................................................................13 2-2 MALDI 原理簡述 ...........................................................................15 2-3 MALDI-TOF-MS 優點 ...................................................................16 2-4 基質的特性 .....................................................................................17 2-5 飛行時間質量器 29, 30 .....................................................................19 2-6 影響 MALDI 分析的因素 ..............................................................22 I.

(3) 第三章實驗 ..............................................................................................23 3-1 實驗藥品與試劑 ............................................................................23 3-2 實驗設備 .........................................................................................24 3-3 實驗方法 .........................................................................................25 3-3-2 石墨氧化物合成 .....................................................................26 3-3 金奈米與石墨層狀結構 ................................................................27 3-4 樣品點樣配製 .................................................................................28 3-5 SALDI-MS 條件 .............................................................................31 第四章結果與討論 ................................................................................32 4-1 13nm 金奈米粒子鑑定 ................................................................32 4-2 石墨氧化物(GO)之鑑定與分析 ...................................................33 4-3 Layer by Layber 結構分析 ............................................................35 4-4 醣類對 MALDI 分析之探討 .........................................................37 4-4-1 木棉糖之不同堆疊結構層數之探討 .....................................37 4-4-2 不同基質與木棉糖對 MALDI 分析之探討 ..........................38 4-4-3 不同基質與葡萄糖對 MALDI 分析之探討 ..........................38 4-4-4 不同基質與核糖對 MALDI 分析之探討 ..............................39 II.

(4) 4-4-5 不同基質與麥芽糖對 MALDI 分析之探討 ..........................39 4-5 胺基酸對 MALDI 分析之探討 ......................................................46 4-5-1 不同層數與苯丙胺酸對 MALDI 之分析探討 .......................46 4-5-2 不同基質與苯丙胺酸對 MALDI 之分析探討 .......................47 4-5-3 不同基質與精胺酸對 MALDI 分析之探討.............................47 4-5-4 不同基質對纈胺酸對 MALDI 分析之探討............................48 4-5-5 不同基質與絲胺酸對 MALDI 分析之探討............................49 4-6 胜肽對 MALDI 分析之探討 .......................................................56 4-6-1 不同層數與穀胱甘肽 MALDI 分析之探討.............................56 4-6-2 不同基質與穀胱甘肽 MALDI 分析之探討.............................57 4-6-3 穀胱甘肽 MALDI 訊號之穩定度探討 .....................................57 4-6-4 阿斯巴甜與 Bradykinin 對 MALDI 分析之探討....................57 第五章結論 ............................................................................................64 文獻參考 ..................................................................................................66. III.

(5) 圖目錄圖(1-1)-碳家族成員 ......................................................................................................... 1 圖(2-5)-直線型與反射型 TOF 示意圖 ............................................................................. 21 圖-(3-1)金奈米 UV -Vis spectrum 與 TEM 成像圖 ........................................................... 32 圖-(4-2)石墨氧化烯鑑定 ................................................................................................ 34 圖-(4-3-2) 石墨烯與金奈米 2-20 層堆疊結構鑑定圖 ..................................................... 36 圖(4-4-1)-不同石墨烯與金奈米堆疊層結構為基質對木棉糖之質譜圖 ........................... 41 圖(4-4-2)-不同基質對木棉糖之質譜圖 .......................................................................... 42 圖(4-4-3)-不同基質對葡萄糖(Glucose)之質譜圖, ........................................................... 43 圖(4-4-4)-不同基質對核醣(Ribose)之質譜圖 .................................................................. 44 圖(4-4-5)-不同基質對麥芽糖(Maltose)之質譜圖 ............................................................ 45 圖(4-5-1)-以金奈米與石墨烯堆疊結構為基質之不同層數對苯丙胺之探討 ................... 50 圖(4-5-5)-不同基質對精胺酸(Arginine)之質譜圖 ........................................................... 52 圖(4-5-4)-不同基質對纈胺酸(Valine)之質譜圖............................................................... 53 圖(4-5-5)-不同基質對絲胺酸(Serine)之質譜圖............................................................... 54 圖(4-6-1)-以金奈米與石墨烯堆疊結構為基質之不同層數對穀胱甘肽之探討 ................ 58 圖(4-6-2-a)-不同基質對穀胱甘肽(Glutathione)之質譜圖 ............................................... 59 圖(4-6-2-b)-不同基質對穀胱甘肽(Glutathione)之質譜圖 ............................................... 60 圖(4-6-3)-穀胱甘肽訊號穩定度之探討 .......................................................................... 61 圖(4-6-4)-不同基質對阿斯巴甜之探討與 Bradykinin 之質譜圖 ...................................... 62. 表目錄表(一)-MALDI 發展背景與歷史 ................................................................................... 13 表(二)-常見有機酸基質 ................................................................................................. 17 表(三) 實驗藥品與試劑 ................................................................................................ 23 表(四) 實驗設備 ........................................................................................................... 24 表(五)-分析物結構與分子量 ......................................................................................... 29. IV.

(6) 謝誌首先感謝陳家俊老師兩年來的栽培與指導，以及台東大學胡焯淳老師、原分所張煥正老師撥冗擔任論文口試委員，給予建議與指導使得論文得以更加完善，在此致上深深的感謝。再來感謝實驗室的郭博士、迪彥學長、政宏學長在實驗上的敦敦教誨與精神勉勵和耐心訓練，讓我在兩年的時間內培養發現與解決問題的能力，受益良多，知識漸長，也感謝陪伴我碩士生涯的奮鬥夥伴小黃、紀洋、延展、宥廷、新然和介孟，跟你們的一起奮鬥的日子是開心且難以忘記的，謝謝你們的在實驗上幫助以及精神上的鼓勵。感謝我最親愛的家人，默默陪伴著我，在任何時刻都給予我滿滿的支持與關心，讓我在求學的路上能夠心無旁騖並專注在實驗上，面對各種挑戰，得以順利完成碩士學業。最後由衷的感謝曾經在實驗室的每一位夥伴，以及曾經幫助我的每一位貴人，兩年說長不長說短不短，但因為有你們，讓我的生命更加多采多姿，在此敬上萬分的感謝，謝謝大家。. V.

(7) 中文摘要本篇研究是發展出一種新穎疊層結構材料應用在表面基質輔助雷射脫附質譜儀之分析,一方面藉由近年來廣泛受到注目石墨烯材料, 利用其多苯環以及片狀材料所導致的良好傳熱及導電性,搭配常見傳統的偵測小分子基質-金奈米粒子利用旋度塗覆的方式,形成多層的疊層結構,藉由兩者都為良好的基質特性,進一步達到增加分析物游離的效果以及增強分析物的分析訊號並提高其靈敏度，由於材料疊層結構的穩定性使得分析物在測量過程中有良好再現性。儀器條件方面是採正離子模式，折返式偵測器下進行偵測，樣品濃度皆為 10-4M，點樣的方法皆取 1.5μL 點樣，在材料鑑定方面我們可從 SEM 看出材料剖面疊層結構厚度大約是 200nm，另外再從紫外光吸收儀也可以看出同時具有金奈米粒子與石墨烯的吸收波長。在比較 2、5、10、15、25 不同層數材料基質的質譜圖中，在訊號強度及背景訊號干擾的考量下，以 10 層的結構較適合最為進一步條件的探討，析物方面，我們選擇了不同種類的分析物如醣類分子、多種胺基酸以及胜肽進行偵測，結果而本研究所開發的疊層材料能夠有效偵測溶於不同分析物，且此新穎疊層結構改善與金有特殊之鍵結之化合物之分析訊號。關鍵字: 基質輔助游離脫附質譜儀、石墨烯、金奈米 VI.

(8) Abstract Reduced graphene oxide (rGO) sheets (two dimensional atomic layers of sp2-bonded carbon) exhibit unique thermal and electric conductivity. Here, a novel layer-by-layer (LBL) structure on the basis of sequential spin coating of rGO sheet and gold nanoparticles has been developed as a matrix for matrix-assisted laser desorption mass spectrometry (MALDI-MS) analysis. The optical and structural properties of the LBL structure were examined using UV-vis spectroscopy and scanning electron microscope (SEM). The SEM image showed that the thickness of LBL structure was about ~200 nm. Meanwhile, the absorption spectra of LBL structure showed the absorption peak of rGO (~270 nm) and gold nanoparticles (~530 nm), respectively. The LBL matrix was demonstrated for the improvement of the ionization efficiency of analytes (carbohydrates, amino acids and peptides) and enhancement of the signal-to-noise ratio in MALDI-MS analysis. Mass spectroscopy was performed in the positive mode of a reflectron-type mass spectrometer, respectively. The concentration of all samples is 10-4 M for the MALDI-MS analysis. In the MALDI-MS analysis, the 10 layers of LBL structure showed the best efficiency for desorption and ionization of analytes.. Key Word : MALDI-TOF-MS、Graphene、Au NPs. VII.

(9) 第一章緒論 1-1 石墨烯簡介石墨烯(graphenee)，如下圖所示，和石墨(graphite)類似，都是碳原子間緊密規則排列，以 sp2 軌域鍵結形成六角角環延伸成蜂巢狀的平面結構。而和和石墨不同的地方是在於墨烯只有一個原子層的厚度，是一種二維材料[3]。. 圖(1-1)-碳家族成員，包含零維巴克克球，一維奈米碳管，二維石墨烯，三維石墨 1.

(10) 石墨烯(graphene)，命名與石墨的英文(graphite)有關。是由碳氫原子所構成的碳-氫-碳-氫二維平面分子，因具有雙鍵故字尾以 ene 結尾。其實他就是僅單原子厚度的石墨，碳原子間緊密規則排列，以 sp2 軌域相互鍵結形成六角環，延伸成類似蜂巢狀的平面結構。. 目前石墨烯的製程有方法有機械剝離法(mechanical exfoliation) 1、氧化還原法 2 3、化學氣相沉積 4（chemical vapor deposition, CVD）、磊晶成長法 5（Epitaxial growth）等，石墨烯發展至今，雖然已經可以低成本生產，且深具實際應用的潛力，然而最大的瓶頸仍在於如何有效率地獲得低缺陷結構的石墨烯。. 2.

(11) 1-2 金奈米粒子介紹金奈米粒子為當今研究最廣泛的研究之一，金奈米材料的物理性質會隨尺寸大小及形狀而改變，又以形狀對材料性質的影響較顯著，當金從塊材變成奈米等級時顏色上會從金黃色轉變為紅色或是紫灰色，然而金奈米粒子在光學吸收上有一項很重要的性質，此性質為「表面電漿共振吸收」，因為不同金屬會產生不同共振吸收的結果，吸收波數及波形皆有明顯的差異，藉此性質對金屬奈米材料之形態做初步鑑定的一大依據。然而金奈米材料由於有明顯的表面電漿共振吸收峰，及可以輕易在表面修飾各式各樣的有機分子並拓展其廣泛的應用價值與潛力。. 目前最常見以及最簡便的合成方法是以 1973 年，Frens提出一個合成金奈米粒子的方法，是使用檸檬酸鈉還原法來製備粒徑均一的金奈米粒子溶液，這樣的一個方法提出後，馬上被應用於生物上的研究，同樣使用類似的方法亦有Faulk 和Taylor 等人使用white phosphorus，以及Stathis 和Fabrikanas等人使用sodium ascorbate 來還原四氯金酸溶液來金奈米粒子。這些方法所合成出來的金奈米粒子皆是內層由奈米金球所構成，外層則是包覆了一層帶負電荷的離子層，所以這些金奈米粒子會因為靜電排斥而分散於溶液相中。 3.

(12) 由於金奈米粒子尺寸縮小、質量減輕、體積縮小、表面積增加，使得許多物質的特性，例如光學性質、磁性、電性、導熱性等均改變而應用性增加應用的範圍非常廣泛，如一般電腦斷層掃描(Computed Tomography)的顯影劑6 7、化學及生物感應器8、催化劑、生醫檢測9… 等。. 4.

(13) 1-3 MALDI 近年文獻回顧近年常以表面輔助雷射脫附游離質譜儀搭配奈米粒子為基質應用於來小分子偵測，其好處是能夠大幅的降低背景干擾近年常以表面輔助雷射脫附游離質譜儀搭配奈米粒子為基質應用於來小分子偵測，而目前已有開發用金奈米粒子 10 11、硫化鋅奈米粒子 12、矽奈米粒子 13. 、二氧化鈦奈米粒子、銀奈米粒子、氧化鐵奈米粒、量子點及 14 石. 墨烯材料 15…等作為基質分析，另一方面為了進一步改善結晶性以及再現性的問題，許多研究也投注在樣品盤上的改良如多孔性的矽基材 16. 、金奈米薄膜基板 16-18. 2007 年中山大學 Wei-Lung-Tsng 團隊使用金奈米粒子 19，以不同點樣的方式進行樣品製備的探討，在不同點樣方式下發現以 Sample First 的方式，亦及先將分析物點樣後待溶液揮發後在點上基質金奈米，可以減少樣品訊號的不穩定度，以環糊精為分析物時 Simple First RSD 值為 25%優於傳統混和點樣 66%，另外進一步探討金奈米的濃度，發現以濃縮兩倍的金奈米為基質有良好的訊號，成功分析出多種醣類小分子與生物分子 GSH、Insulin 等。. 5.

(14) 2007 年 Teruyuki Seino 等人開法利用分子束磊晶成的技術 20，成長出 GeND 的基板基片(Germanium Nanodot)，在 SEM 下觀察發現顆粒大小約為 150~200nm , 而在 MALDI 分析上只要將樣品直接點樣於晶片上，不需與其他基質混合即可偵測，在比較早期的多孔性矽基板 (DIOS)分析下，有較好的訊號表現，在此篇中利用新穎的 GeND 基板材料可以成功分析出血管緊縮素、胰島素、PEG、肌紅蛋白、胰蛋白。. 2007 年 Vicki H. Wysock 團隊 13 發展利用 MALDI 並採用經過 HNO3 氧化、PFP 衍生化後的矽奈米粒子(30nm)為基質進行胜肽、藥物、殺蟲劑、酸性物質等小分子偵測，相較於傳統的 MALDI 方法，矽奈米除了需要較少的雷射能量外還可以使得圖譜上的背景訊號降低並擁有更好的偵測訊號、選擇性與再現性；在真實樣品方面，採用矽奈米粒子可以直接偵測未經前處理的尿液，中間的代謝藥物，對 MALDI 上鹽類的干擾大幅下降也可以偵測出經過簡單前處理後土壤中的殺蟲劑。. 2008 年中山大學 Hui-Fen-Wu 等人合成硫化鋅(ZnS)奈米粒子，並在表面修飾 MPA、Citrate、Cysteamine、MES 進行 MALDI 的研究探討，發現各種氧化鋅奈米粒在濃度為 1nM 的濃度下有最好的訊號表現，再調整 pH=7 之各種氧化鋅奈米粒子在偵測三種環糊精上都有 6.

(15) 良好的訊號表現，其中尤以 MPA 所修飾的氧化鋅奈米為基質有最低的偵測極限(0,01-1.8μM)及良好的線性(R2>0.99)，進一步利用 MPA 所修飾的氧化鋅當基質也可以分析出人體尿液中泛素(insulin)的訊號。. 2009 年 Xiaoyan Che 21 團隊利用 MALDI/MS/MS 利用不同基質 DHB、CHCA SA 進行三聚氰胺(Melamine)以及三聚氰酸(Cyanuric acid) 的研究探討，發現比較三聚氰胺較適合以 CHCA 為基質在正離子模式下進行研究而三聚氰酸適合以 SA 為基質在負離子模式下進行研究，在真實樣品方面利用添加 50μg、25μg、12.5μg 的標準品於尿液中簡單離心前處理的方式再，可以在 MS/MS 的質譜圖中發現與標準品同樣碎裂的訊號。. 2010 年 Dal-Hee Min22 等人發表利用石墨烯和碳奈米管所組成的玻璃基板，在玻璃基板上形成一個雙層的厚度為 13.2nm 薄膜結構，這樣的材料特性與結構有利於在 MALDI 分析游離，以進一步增強分析物訊號，在篇中所偵測的樣品只需直接點樣在材料盤上，不需與其他基質混合即可上基偵測，結果發現此方法可以分析出不同種類的磷脂質以及經由酵素水解後的磷脂質訊號且強度與再現性比傳統基質好。 7.

(16) 2010 年 Jeongkwon Kim23 團隊在 MALDI-MS 上採用添加 Na-TFA 之 Sodiated DHB, an ionic liquid matrix of DHB-pyridine, a binary matrix of DHB-aminopyrazine,和碳奈米管(CNT)等基質與與利用 SALDI-MS 方法採用添加 Na-TFA 在氧化鋅和金奈米為基質並搭配 μFocus MALDI Plate 偵測葡萄糖與蔗糖，在質譜圖中可發現在低分子量區域的雜訊變小，且分析物之訊號增強，而蔗糖的訊號大多高於葡萄糖，其中又以碳奈米管為基質可偵測到的濃度最廣且最低(3pmol)，雖然整體的再現性不佳，但使用廣泛的基質也提供了有價值的數據對於小分子糖類研究。. 2010 年中興大學的 Chien-Chen-Lai 團隊 16 射技術所蝕刻出多孔性結構的微米矽基材為樣品盤，利用其疏水的性質，能夠使點樣的樣品能夠更集中，改善傳統樣品盤的結晶性不均勻的問題，再進一步最佳化條件下將樣品與傳統有機雞質混和點樣偵測，成功的分析出 angiotensin I 與 B-casein peptide ,利用此實驗所製成的樣品盤訊號可以大大提升 10~100 倍優於一般樣品盤。. 8.

(17) 2010 年 Hua Zhang 團隊 24 利用氧化的石墨烯材料利用旋轉塗覆的方式塗覆在氧化矽基材上，進一步利用聯胺還原方法還原，分析環境中的有毒分子-戴奧辛，在此篇利用 2,5-DHB 為基質，比較石墨 (Graphite),石墨烯粉末(r-GO podwer),以及石墨烯薄膜(rGO-film)，研究發現以石墨烯薄膜(rGO-film)能有較低的偵測極限及較高強度的訊號表現。. 2010 年 Yinsheng Wang 團隊為第一個使用 Graphene 為 MALDI 基質偵測小分子分析物 25，此團隊提出 Graphene(吸收波長為 270nm) 具有良好的雷射析收效率以本身材料良好的電子傳導性質可以有效的使分析物脫附游離，在此團隊實驗中也證明 Graphene 確實是良好的基質不論是在有極性的小分子- amino acids, polyamines, anticancer drugs 和 nucleosides 以及無極性小分子- steroids 都有良好的訊號表現, 進一步. 2011 年 Zongwei Cai 等人 26 利用 Graphene Flakes 進行多種胜肽、胺基酸、脂肪酸、核甘酸等，在比較 Glu-Val-Phe 之 peptide 發現在負離子模式下比正離子模式下訊號強度來的好，結果發現在負離子模式. 9.

(18) 下可分析出六種混和胺基酸、核甘酸及長碳鏈的胺基酸，並有良好的訊號及再現性且在低分子量區域的背景訊號干擾質很小。. 2011 年中國 Rui Liu27 等人在比較 cysteine、4-ABT、3-MPA 修飾在金奈米表面形成自組裝的單層薄膜，此製程方法同時間基質與基板結合可直接點樣於薄膜上，最後發現以 Cysteine 所修飾的多孔性金奈多孔薄膜分析環糊精分子比起另外兩種有基分子所修飾薄膜與 2,5-DHB 有更好的訊號及低背景訊號干擾質，另外使用 benzylpyridium(BP)觀察雷射能量吸收效率發現以 Cysteineu 有良好的雷射吸收表現，在最佳化條件下可最低偵測極限環糊精為 15fmol, 也成功分析出 50ng PEG 及 50pmol Try-Val-Pro-Met-Leu 分子。. 2011 年 Chia-Chun-Chen 及 Cho-Chun Hu10 等人開法利用檸檬酸酸所修飾的 13nm 金奈米粒子，在比較不同濃度以及傳統基質 CHCA 與 2,5-DHB 分析 5-HIAA 分子標記物發現以 1 倍的金奈米粒子訊號最好，並利用添加內標準品方式定量可以有良好的 RSD 與 5-100μM 的線性範圍，並成功經由簡單的離心前處理方式以及標準添加法，分析出一系列類癌腫瘤代謝物 5-HIAA、5-HTP、HTP、5-HT 在人體尿液中的含量。 10.

(19) 2011 年 Jing Zang 等人利用利用 Hummer 所研發的石墨烯合成方法為基質 28，比較一般傳統基質 CHCA 對環境荷爾蒙多環芳化合物(PAHs)做進一步探討，發現以 r-GO 最為基質可以改善傳統基質在低分子片段的複雜訊號，較適合做為 PAHs 的研究，研究中發現分析物的苯環數越多，在 rGO 與分析物之前的電子有所傳遞的關係，因此得到的訊號會越強，進一步利用固相萃取純化的方式成功分析出河流中 Coronene 的訊號。. 11.

(20) 1-4 研究動機由於金奈米粒子的高面積以及導熱性的特性。已經廣泛應用在小分子的分析，其偵測小分子區域之質譜圖更勝於一般傳統基質的效果，但卻還是有些隱憂，相對於再現性的問題，需要尋找一個良好的訊號點，才能有良好的再現性。自 2010 年石墨烯就被廣泛討論應於 MALDI-MS 上，由於它製備容易且又便宜，另外在偵測訊號也優於一般傳統基質，其由文獻得知他有穩定的訊號表現 15，是一個新穎的基質材料。在 MALDI 的測量中，往往根據分析物的不同有不同配置樣品的方法，例如典樣順序的不同以及調整 pH 值、添加 Buffer 的需要、適當的基質濃度調整，需要針對不同分析物調整不同的條件，因此我們希望可以建構出石墨烯與金奈米粒子之疊狀結構(rGO-Au)，克服金奈米粒子上偵測訊號之不穩定，結合兩種良好的基質，提供一個好的基板同時兼具基質的效應，讓前處理作業更方便快速同時又有良好訊號表現的基板材料。. 12.

(21) 第二章基質輔助雷射脫附游離質譜儀介紹 2-1 MALDI 的發展基質輔助雷射脫附游離法從一開始的雷射脫附，到現今的基質輔助雷射脫附法重要發展如下表所要記，目前發展主要以 1988 Hillenkamp 所提出以有機酸當作基質 11，此方法靈敏度與解析度都優於 Tanka 法，因此目前常見的基質大多為 Hillenkamp 所提出的有機酸為主。Kara 和 Hellenkamp 與 Tamaka 所發展出的基質輔助雷射脫附游離法如今廣泛應用在如今蛋白質與胜肽、碳水化合物 (Carbohydrates),和藥物檢測與低分子量化合物分析，在當今分析生物分子與檢測分析技術上扮演了重要的角色。. 表(一)-MALDI 發展背景與歷史年代. 發展. 1960 初期. 雷射脫附法(Laser desorption,LD)應用分析在不穩定性的化合物. 1978. Postumus 等人利用雷射脫附質譜法(Laser desorption mass spectrometry LD-MS)成功分析核酸、胺基酸與醣類等小分子,但將高能量的雷射打在分析物上容易在圖普碎裂複雜而不易判斷 13.

(22) 1985. Karas 和 Hillenkamp 提出利用基質（matrix）輔助樣品的概念藉由加入能吸收雷射能量的色胺酸(Tryptophan)在胺基酸樣品中幫助能量傳遞且脫附，成功分析不具雷射吸收能量的胺基酸. 1987. 田中耕一(Koichi Tanaka)等人利用鈷粉末與甘油混和做為蛋白質的基質，成功脫附分析分子量 14KDa 的溶黴菌(lysozyme)。. 1988. Hillenkamp 等人利用有機酸為基質，偵測高分子的蛋白質(Albumin)，成功獲得高達數十萬 albuimun cluster 的訊號。. 1995. Sunner 等人發現利用微米級碳粉粉末混合甘油，可以當作游離及傳遞雷射能量及提供質子的基質. 1995~今日. 不同研究團隊開發不同的奈米材料和奈米材料的樣品盤以增加分析物的分析訊號及再現性。. 14.

(23) 2-2 MALDI 原理簡述一般 MALDI 樣品的配製，常見的作法是先將具有雷射吸收波長之基質與分析勿以特定的比例均勻混和，混和後容易有大量的基質與少量的分析物，再取 1mL 混和液點樣於樣品盤上，因溶液揮發後在樣品盤上形成共結晶(co-crystallization)固體。. 進一步將含有分析物與基質之共結晶樣品送入質譜儀中，以脈衝雷射光速打在樣品上，因為樣品在雷射光束照射時，雷射能量會由基質所吸收，再將所吸收的能量進一步傳遞給所環繞的分析物;而分子在瞬間接受雷射能量時因為固相轉氣相的速度遠大於熱分解，因此分析物可以保持完整的分子結構且又能脫附游離至氣相，此現象稱為脫附(desorption),同時在此過程中，電荷轉移會同時進行，一連串的離子 -分子反應(ion-molecule reaction.IMR)發生，分子因而帶上電荷，此步驟稱為游離(ionization)，產生氣相分析物離子，再經由 TOF 管柱分離與質量分析進行偵測得到數據。. 15.

(24) 2-3 MALDI-TOF-MS 優點基質輔助雷射脫附游離法法自發展以來已經廣泛應用在各種大分子及小分子的偵測，如今也已成為分析胜肽，蛋白質與碳水化合物的常見方法，它可以迅速分析出一個完整的細胞或蛋白質成分，其優點如下列所示: (1). 快速且靈敏 MALDI-TOF-MS 是一個快速且靈敏的微量分析技術，相較於其他層析質譜技術，所分析的時間只需要數分鐘即可，且樣品只需 1μL~2.5μL,而在尋找最佳化條件後可測得如 fmol 的訊號，相當適用於不易取得微量生物分析樣品。. (2). 分析質量範圍廣泛由於分離技術是採用游離脫附法，樣品可以有完整性的氣態脫離，從一百的分子量到數十萬的分子量，皆可以經由適當的基質選擇後再經由質量分析器分析而獲得良好的數據。. (3). 樣品製備簡易只需取微量的分析物與基質混和點樣於樣品盤上，待溶液揮發後形成共結晶固體即可上機偵測，不頇另外添加及其他作業。. 16.

(25) 2-4 基質的特性基質的選擇必頇要能搭類雷射波長，因此所選用的基質在特定雷射波需具有良好的吸收率，才能使分析物游離有良好的訊號，目前 MALDI 常見搭配的紫外光範圍雷射有氮氣雷射(337nm)、金女以雷射 (355nm 及 266nmNd:YAG)，目前最廣泛使用的 MALDI-TOF-MS 為波長為 337nm 的氮氣雷射，而常見的基質多為具有共軛雙鍵或具有梭酸的芳香族環小分子，如下圖所示，這些小分子可以有效地吸收氮氣的雷射光、提供氫離子給分析物，使其游離化。表(二)-常見有機酸基質 NAME. structure. α-Cyano-4-hydroxycinnami c acid. CHCA. 2,5-Dihydroxybenzoic acid. 2,5-DHB. Sinapic acid. SA. 選擇適當的基質為是否能得到分析物訊號為最重要因素，除了分析 17.

(26) 物與基質的比例，若在比例上分析物為多則基質無法有效吸收且傳遞反而會大大降低訊號的產生，另外質譜的操作條件為高真空下 (10-6~10-7torr),因此還要考量溶液的揮發性與共結晶的形成，這些因素都會大大影響分析物訊號。因此適當的基質必頇具有以下特性:12. (1) 良好的能量吸收且傳遞基質必頇具有可以吸收雷射能量的特性，並且在短時間內可以將此能量傳遞給鄰近的分析物分子，使其固相轉變為氣相順利外進行相轉移的脫離過程。 (2) 良好的共結晶基質占樣品的主要部分，添加基質是希望能夠增強傳遞能量但也希望能夠有效的將分析物分散，避免聚集在一起，若是樣品聚集則進行實驗時再現姓與能量傳遞就會受到很大的干擾。 (3) 提供電荷離子在游離脫附的過程中需要有電荷離子進進行游離化的過程，因此有官能基的基質是分析物良好的質子提供者。. 18.

(27) 2-5 飛行時間質量器 29, 30 MALDI 在游離之後會進入到飛行管柱，用飛行時間(time of flight,TOF)時間差,進行質量的分析，原理是當離子形成之後，施加一個高壓的電場，離子因為電壓而得到充分的動能進入到飛行管中，而 MALDI 在離子源中所產生的離子在經過相同電場後均有相同的動能，在管柱中會因為離子的荷質比(m/z)不同而有不同的速度，因此抵達偵測器的時間也會不同。. 飛行速度與荷質比關係如公式(1)所列:. 飛行時間與荷質比關係如公式(2)所列在這裡鍵入方程式。. 公式中英文字母代號為: KE:動能. v:離子的速度. e: 電子電量. m:離子的質量. V:加速電壓. 19. z:離子的電荷數.

(28) 因此當離子都具有相同電量的電荷時，質量小的會有比較快的飛行速度，所走的管柱路徑會比較長，反之則質量大的飛行速度較慢路徑較短，因此我們可以根據到達偵測器時間的不同，區分不同的荷質比的離子進而轉換成質譜圖分析。. 而商業化的 TOF 有直線型(Linear)主要偵測大分子量以及反射行 (Reflectron)偵測小分子量兩種形式以下圖所示，而以 TOF 為質量分析器分析質譜的優點如下: (1). 質量準確度高. (2). 偵測質譜範圍廣泛(高達幾十萬). (3). 偵測時間短(微秒). (4). 可偵測大量的離子. 20.

(29) r. Detector r. Detectorr. N2 337nm Laser. N2 337nm Laser. Sample plate. Sample plate. 圖(2-5)-直線型與反射型 TOF 示意圖. 21.

(30) 2-6 影響 MALDI 分析的因素目前 MALDI-TOF-MS 已經廣泛應用在各式各樣的生物分子分析，也已經針對基質所影響分析物提出的解決方法，包括基質的選擇、樣品與基質互溶的情形與比例等，但傳統的 MALDI 並對於低分子量的區域分析仍難非常的困難，主要是因為下列因素所影響 (1). 小分子有機酸(CHCA、DHB)造成的低分子量的碎裂，在分析時我們需要添加基質輔助游離，但這些小分子基質由於受到雷射的能量在低分子區域，碎裂成複雜的片段，導致在低分子區域背景質干擾，使得分析物訊號判斷困難。30, 31. (2). 在共結晶的過程中，很容易產生結晶不均勻的情況，造成訊號再現性不佳，部分訊號強部分訊號弱，在實驗上定量困難。. 目前研究也有發展針對上列兩點提出基質的改善，1995 年 Sunner 等人發現利用微米級碳粉粉末混合甘油，可當作吸收及傳遞雷射能量及提供質子的基質，稱為表面輔助雷射脫附游離質譜法(surface -assisted Laser desorption/ionization-mass spectrometry (SALDI-MS))，其好處是能夠大幅的降低背景干擾，可以應用在小分子的偵測，隨後研究變開法不同奈米材料為基質，為 MALDI 的發展及應用展開全新的一面。 22.

(31) 第三章實驗 3-1 實驗藥品與試劑 13nm 金奈米與石墨烯氧化物合成藥品與實驗中所需清洗溶劑藥品名稱與廠牌如下表所示。. 表(三) 實驗藥品與試劑英文名稱. 廠牌. Graphite podwer,<20micro. Aldrich. Potassium permanganate(KMNO4). SHOWA. Hydrogen Peroxides(H2O2). 島久. Sulfuric Acid,96%(H2SO4). ACROS. Sodium nitrate(NaNO3). Acros. Sodium tetrachloroaurate(III) dehydrate,99% Trisodium citrate dehydrate,99%. Simga. Acetone. Merk. Methanol. MerK. Iso-propanol. Alfa. 23. Sigma.

(32) 3-2 實驗設備表(四) 實驗設備儀器. 廠牌/型號. MALDI. Bruker /microflex. Sonication. Delta/DC400. UV visable. HP8453. 離心機. Hsiangtai/CN-830. Plasma. HARRIC/PDO-32G. Transmission Electron Microscope(TEM). Hitachi H-7100. 天平. DENVEK. XRD. BrukerAXS/D8 advance. FT-IR. JASOC200e. 24.

(33) 3-3 實驗方法 3-3-2 金奈米粒子合成. 利用冷凝迴流系統加熱 50 mL 4 mM 的 trisodium citrate 至沸騰後，快速加入 0.5 mL 之 NaAuCl4 溶液 100 mM 至沸騰溶液中，在沸騰的狀態下持續攪拌 3 分鐘以確保所有的金離子都被還原成金奈米粒子（AuNPs），此時溶液的顏色會從原本的透明無色轉變為酒紅色，將熱源移開並且將金奈米粒子置於冰浴中冷卻至室溫，使用紫外可見光吸收儀(UV-Vis)鑑定後，將 AuNPs 溶液保存在 4 ℃冰箱中待用。. 50 mL 4 mM 的 trisodium citrate 在冷凝迴流系統下煮沸. 加入 0.5 mL 之 NaAuCl4 溶液 100 mM 持續加熱 3 分鐘. 熱源移開並且將金奈米粒子置於冰浴中冷卻. 進行紫外可見光吸收儀鑑定後保存於 4℃冰箱待用μL 回溶. 25.

(34) 3-3-2 石墨氧化物合成取 2.5g 的 graphite 在 0。C 下與 1.5g 硝酸鈉和 96mL 的稀硫酸混和攪拌 15 分鐘，保持 0。C 下加入 9g 過錳酸鉀反應 90 分鐘後除去冰塊室溫下反應 5 天，待時間到後加入少量稀硫酸顏色從墨綠色轉為紫紅色，隨之再加入加入 30mL 雙氧水顏色轉變為黃褐色，即完成合成的步驟，最後利用離心 16000rpm 的方式將上層液液體轉變為 pH=7 即可定量後使用。 2.5g Graphite、5g NaNO 與 67.5mL 硫酸攪拌 15 分鐘. 緩緩加入 9g KMnO4 攪拌五天(顏色轉為墨綠色). 加入稀硫酸攪拌兩個小時顏色轉為紅紫色. 加入 30mL 雙氧水顏色轉變為黃褐色. 用離心方式去雜質直到上層液為 pH=7. 利用 UV 鑑定波長後存放陰涼處備用. 26.

(35) 3-3 金奈米與石墨層狀結構首先將洗好的基板利用電漿的方式除去表面的雜質後，取 50mL 的石墨烯溶液，利用旋轉塗覆機以轉速 3000rpm 60 秒的方式鋪在基板上後再取金奈米粒子 50mL 以一樣的方式覆蓋在基板上面，重複此步驟達到所要塗覆的層數，將基板平放在玻璃皿中，利用少許的聯胺滴在玻璃皿中，加熱 90 度後維持兩個小時即完成石墨的還原，檢述步驟如下表所示。. GO spin coating for 3000rpm. 13nmAuNP spin coating for 3000rpm. Repeat. Reduce GO by hydrazine at 90°C for few hours. 27.

(36) 3-4 樣品點樣配製將所有欲分析的標準樣品溶於去離子水中或是甲醇中配製成 10-4M 之母液並存放於 4 ℃待用。實驗前，取出適當體積以超音波震盪 10 分鐘後取 1.5μL 直接點樣於層狀結構的基板材料上進行偵測，另一方面以傳統的金奈米和一般有機酸為基質則是取等量體積 1.5μ L 基質點樣於不銹鋼板上隨後立即取等量的 1.5μL 標準樣品在不銹鋼板上均勻混合,即完點樣的方式待溶液揮發後即可上機偵測。. 28.

(37) 表(五)-分析物結構與分子量. 結構式. 英文名稱. 中文名稱. 分子量. Glucose. 葡萄糖. 180.16. Ribose. 核醣. 150.13. Raffinose. 木棉糖. 504. Maltose. 麥芽糖. 342. Valine. Phenylalanine. 纈胺酸. 苯丙胺酸. 117.15. 165.19. 絲胺酸 Serine. 29. 105.09.

(38) 結構式. 英文名稱. 中文名稱. 分子量. Arginine. 精胺酸. 174.20. 307.32. (Arg-Pro-Pro-GlyPhe-Ser-Pro-Phe-Arg). Glutathione. 穀胱甘肽. Aspartame. 阿斯巴甜. 294.30. x. 1061.. Bradykinin. 30.

(39) 3-5 SALDI-MS 條件本次實驗中是以 Bruker microflex TOF MS 進行實驗。並以折返式偵測器、正離子模式進行偵測。氮氣雷射波長為 337 nm，加速電壓為 20 kV，脈衝數為 150 shot，頻率為 10 Hz。雷射強度以能夠達到當天最適當的訊雜比和解析度為調控的基準。SALDI-MS 在偵測前先以金奈米粒子進行校正，校正訊號為 m/z 38.96 [K] +、m/z 196.966 [Au] +、m/z 393.932 [Au2] +、m/z 590.899 [Au3] +。. 31.

(40) 第四章結果與討論 4-1 13nm 金奈米粒子鑑定本次實驗我們採用簡易的檸檬酸鈉所修飾過的金奈米粒子 19, 32 利用加熱迴流系統下還原方式進行反應，在金奈米鑑定上首先利用穿透式顯微鏡下可看到奈米粒子的大小為 13nm，另一方面我們從紫外線吸收光譜儀上也可發現在 520nm 有金奈米的主要吸收波長如下圖 (3-1)所示，因此更進一步確定金奈米的材料特性。. 圖-(3-1)金奈米 UV -Vis spectrum 與 TEM 成像圖. 32.

(41) 4-2 石墨氧化物(GO)之鑑定與分析本研究室採用 Hummer 法改良利用氧化法將石墨先還原成石墨氧化物後再進一步利用聯胺還原，使其還原成氧化石墨烯，在這種利用以溶液方式還原的石墨烯材料在鑑定上參考文獻[36][37][38] [39][40]，我們可以從穿透式顯微鏡(TEM)所示可以看出其片狀薄膜以及原子力顯微鏡(AFM)觀察期片狀結構的大小，結構其大小約為 1~100 微米，另一方面我們在另用紫外線光譜吸收儀應證在波長 230nm 有石墨氧化物的吸收波長，而在 XRD 的圖形中我們可以觀到所合成的石墨氧化物與所符合於文獻的訊號，最後從 IR 圖形中也可以看出，所合成的材料官查出在 3000–3400 cm-1 有 OH 訊號及 1720 cm-1 之 C=O 之訊號以及 1020cm-1 有 C-0 訊號，其鑑定圖譜如下圖(4-2) 所示。. 33.

(42) 圖-(4-2)石墨氧化烯鑑定之(a) UV-Vis spectrum (b) FT-IR spectrum (c)XRD (d) TEM 成像圖(e) AFM 成像圖. 34.

(43) 4-3 Layer by Layber 結構分析經由不斷旋轉塗覆的過程，因為在 GO 以及 AuNPs 之間會有電荷吸引力的關係，所以會形成堆疊的結構，真實基材所呈現的情況如下圖(4-3-1)所示，確實因為經由不斷塗覆個過程厚度與顏色都有改變，另外一方面由於金奈米粒子與石墨烯氧化物都有吸收波長我們進度一藉由鋪在石英玻璃上的堆疊結構觀察其吸收波長的變化，發現隨著層數的增加，在 230nm 的石墨烯吸收值有上升的趨勢，而在 520nm 金奈米的訊號有些許的紅位移到 575nm 但也有上升的趨勢，而根據文獻經過聯胺還原後，石墨氧化烯的吸收訊號會從 230nm 位移到 270nm,而在我們進行聯胺還原後我們也可得到相同的印證，確實證明材料從石墨氧化物還原成石墨烯，進一步我們再使用 SEM 的剖面圖進行材料的研究探討，觀察堆疊 20 層的結構厚度，在圖中我們可以觀察到厚度約為 250nm 左右，與我們所塗覆 20 層的厚度符合。其實驗圖譜如下圖(4-3-2)所示。. 35.

(44) 圖-(4-3-2) 石墨烯與金奈米 2-20 層堆疊結構鑑定圖 (a) 波長 200-700 之石墨氧化物與金奈米圖譜 (b) 波長 450nm-750nm 之石墨氧化物與金奈米圖譜 (c) 基板塗覆不同層數真實樣品 (d) SEM 之 20 層石墨烯與金奈米堆疊結構剖面圖. 36.

(45) 4-4 醣類對 MALDI 分析之探討. 4-4-1 木棉糖之不同堆疊結構層數之探討. 由於我們所塗覆在基板上的材料同時也兼具了基質的特性，所以分析樣品方面，只需直接將分析物點樣於我們的基板上，不需另外混合基質；在 MALDI 的研究中也發現，基質與分析物的比例會影響分析結果，基質太多太少就無法有效傳遞能量給分析物游離，因此我們進一步對不同堆疊層數的基板與分析物進行探討。在選擇分析物方面，我們選擇了多種醣類，醣類在人體有很重要的地位，醣類是身體產生熱量的主要來源，另外近年國人糖尿病問題也日益嚴重，所以在醣類的偵測是有一定的重要性，因此我們先進一步進行堆疊層數探討，本實驗發現以分析物在濃度為 10-4M 之下,並參考文獻的資訊，我們可以發現在質譜圖中[Raffinose+Na]+= 527 之訊號，其中又以塗覆 10 的堆疊結構能有良好的訊號表現。其結果如下圖(4-4-1)所示。進一步我們利用 10 層的堆疊結構做進一步的探討，我們選擇了不同形式的醣類，有單醣的葡萄糖及核醣、雙醣的麥芽糖以及多醣的木棉糖，我們以相同的濃度 10-4M 比較傳統一般有機基質 CHCA 以 37.

(46) 及常見的奈米基質金奈米進行比較觀察訊號。19, 23. 4-4-2 不同基質與木棉糖對 MALDI 分析之探討. 木棉糖(Raffinose)方面我們可以在圖譜上觀察到在以金奈米粒子、石墨烯為上層之 10 層堆疊結構以及有機酸 CHCA 為基質，同時都可以在質譜圖上發現 m/z: [Raffinose + Na ]+ = 527 以及 m/z: [Raffinose + K ]+ = 543 但是以石墨烯為上層之 10 層堆疊結構擁有最好的訊號。其結果如下圖(4-4-2)所示。. 4-4-3 不同基質與葡萄糖對 MALDI 分析之探討. 在葡萄糖(Glucose)方面，同樣的我們參考文獻比較了不同基質做探討，在圖譜上我們可以觀察到只有以石墨烯為上層之 10 層堆疊結構有 m/z: [Glucose + Na ]+ = 203 之訊號，其他基質無法觀察到有葡萄糖的其他種類的訊號表現。其結果如下圖(4-4-3)所示。. 38.

(47) 4-4-4 不同基質與核糖對 MALDI 分析之探討. 在核醣(Ribose)方面從圖譜上在比較不同基質的結果我們發現以石墨烯為上層之 10 層堆疊結構有 m/z: [Ribose + Na ]+ = 173 之訊號，在金奈米粒子方面無法觀察到有任何的訊表現，在 CHCA 為基質方面雖然在分子量為 173 有強度很強的訊號，但對照 CHCA 本身的 BLANK 發現，是本身 BLANK 的訊號干擾所致。其結果如下圖(4-4-4) 所示。. 4-4-5 不同基質與麥芽糖對 MALDI 分析之探討. 在麥芽糖(Maltose)方面從圖譜上的觀察中我們得知，在比較不同材料為基質時我們可以在 CHCA 看到很弱的訊號，在金奈米粒子無法觀察到訊號的表現，若以石墨烯為上層之 10 層堆疊結構為基質我們可以觀察到良好的[Maltose+Na]+= 365 訊號表現。其結果如下圖 (4-4-5)所示。. 總結以上葡萄糖、核糖、麥芽糖以及木棉糖等醣類分子，在圖譜中可以發現以我們材料所建構出的堆疊層狀結構所呈現的訊號遠優 39.

(48) 於一般金奈米與 CHCA 基質之輔助游離，甚至有些在金奈米與 CHCA 無法觀察到，而在木棉糖中比較不同層數結構中可發現以 10 層堆疊結構有較好的訊號表現，因此再利用此層數結構進行進一步探討其他醣類分子，都可以有觀察到良好的訊號表現，因此本實驗所建構的基板是一個有效輔助游離的基板。. 由於我們是採用旋轉塗覆的方式進行基材的堆疊，在結構上會比一般傳統典樣方式來的平整，分子之間的分散性也比較好，會有效的減少結晶性不均勻的問題，而我們採用兩種都是良好應用在 MALDI 中的基質-金奈米與石墨烯材料，因此在能量傳遞比較完整且大大增強分析物游離，導致有更良好的訊號. 40.

(49) 圖(4-4-1)-不同石墨烯與金奈米(rGO-AuNPs)堆疊層結構為基質對木棉糖(Raffinose)之質譜圖，質譜圖訊號 m/z: [Raffinose + Na ]+ = 527 , [Raffinose + K ]+ = 543 (a)2 層堆疊結構 (b)5 層堆疊結構 (c10 層堆結構 (d) 15 層堆疊結構(e) 20 層堆疊結構。. 41.

(50) 圖(4-4-2)-不同基質對木棉糖之質譜圖, 質譜圖訊號 m/z: [Raffinose+Na]+ = 527 , [Raffinose + K ]+ = 543 (a)LBL-BLANK (b)以石墨烯為最上層的 10 層結構(c)金奈米粒子 (d)有機酸 CHCA 為基質。. 42.

(51) 圖(4-4-3)-不同基質對葡萄糖(Glucose)之質譜圖,質譜圖訊號 m/z: [Glucose+Na]+ = 203 (a)LBL-BLANK (b)以石墨烯為最上層的 10 層結構基板為基質 (c)金奈米粒子為基質 (d)有機酸 CHCA 為基質. 43.

(52) 圖(4-4-4)-不同基質對核醣(Ribose)之質譜圖,質譜圖訊號 m/z: [Ribose+Na]+ = 173 (a)LBL-BLANK (b)以石墨烯為最上層的 10 層結構基板為基質(c)金奈米粒子為基質 (d)CHCHA-BLANK (e)有機酸 CHCA 為基質. 44.

(53) 圖(4-4-5)-不同基質對麥芽糖(Maltose)之質譜圖,質譜圖訊號 m/z: [Maltose+Na]+ = 365 (a)LBL-BLANK (b)以石墨烯為最上層的 10 層結構基板為基質(c)金奈米粒子為基質 (d)有機酸 CHCA 為基質. 45.

(54) 4-5 胺基酸對 MALDI 分析之探討胺基酸(amino acid)是由胺基(-NH2)和羧基(-COOH)所組成的分子，不同的胺基酸經由脫水縮合後會形成肽(peptide-由兩個胺基酸以上胺基酸組合而成) ，而肽是蛋白質(protein)生成的前體，因此胺基酸是構成蛋白質的基本單位。若有一天身體內的某種胺基酸耗盡了，身體也無法製造需要此胺基酸的蛋白質。這導致蛋白質缺乏，容易引起各種疾病。因此在質譜中若是可以從蛋白質分子中觀察到胺基酸的訊號是具有相當意義的，因此我們選擇了四種不同胺基苯丙胺酸、精胺酸、絲胺酸及纈胺酸進行研究。. 4-5-1 不同層數與苯丙胺酸對 MALDI 之分析探討苯丙胺酸是腦部及神經細胞製造神輕傳導物「新腎上腺素」的原料，新腎上腺素可以使我們精神上保持警覺，改善記憶及對抗憂鬱。因此在人體中具有相當意義的分子。一開始我們利用苯丙胺酸進行不同層數的探討，，本實驗發現以分析物在濃度為 10-4M 之下，探討塗覆 2、5、10、15、20 層的堆疊結構，在圖譜中我們可以發現 [Phenylalanine+Na]+= 527 之訊號，其中又以塗覆 10 的堆疊結構能有良好的訊號表現。其結果如下圖(4-5-1)所示。. 46.

(55) 因此我們用此 10 層結構進行不同基質的探討，來比較我們所建構出來的基板是不是一個有效且實用的材料，在比較基質分面我們選擇了一般廣泛應用的金奈米粒子以及傳統有機基質 CHCA 進行討論。. 4-5-2 不同基質與苯丙胺酸對 MALDI 之分析探討進一步我們針對不同基質進行苯丙胺酸的探討，同樣的我們利用一般有機酸基質進行比較，在圖譜中我們可以觀察到[Phenylalanine +H ]+= 166 之訊號，而在 CHCA 的圖譜其他區域我們可以看到一些碎裂片斷的雜訊，在金奈米粒子方面我們在圖譜在無法觀察到任何的訊號，若是以石墨烯為上層之 10 層堆疊結構為基質我們可以觀察到高強度的[Phenylalanine+Na]+= 188 以及[Phenylalanine+K]+= 204。其結果如下圖(4-5-2)所示。. 4-5-3 不同基質與精胺酸對 MALDI 分析之探討精胺酸(Arginine)可以增強人體對抗細菌、病毒及腫瘤之免疫力、促進生長激素之分泌，促進傷口癒合及肝細胞再生及肌肉形成及減少脂肪囤積。在質圖譜中我們可以觀察到[Arginine +H ]+= 175,[Arginine 47.

(56) +Na ]+= 197 之訊號，分別 CHCA 的圖譜中我們只有觀察到[Arginine +H ]+= 175，在金奈米粒子方面我們在圖譜在無法觀察到任何的訊號，若是以石墨烯為上層之 10 層堆疊結構為基質我們可以觀察到 [Arginine +H ]+= 175,[Arginine +Na ]+= 197 。其結果如下圖(4-5-3)所示. 4-5-4 不同基質對纈胺酸對 MALDI 分析之探討纈胺酸(valine)為必頇胺基酸功用為促進腦力，改善肌肉協調功能及安定情緒。在進行 MALDI 精胺酸的探討，利用一般有機酸基質與廣泛應用的金奈米進行比較，在圖譜中我們可以觀察到[Valine +H ]+= 118,[Valine+Na ]+= 140, [Valine+K ]+= 156 之訊號,分別在 CHCA 的圖譜中我們只有觀察到[Valine +H ]+=118，在金奈米粒子方面我們在圖譜在無法觀察到任何的訊號，若是以石墨烯為上層之 10 層堆疊結構為基質我們可以觀察到[Valine +Na]+= 175,[Valine +K]+= 197 。其結果如下圖(4-5-4)所示. 48.

(57) 4-5-5 不同基質與絲胺酸對 MALDI 分析之探討絲胺酸(Serine) 幫助肌肉及肝臟儲存肝糖，協助製造抗體，合成神經纖維之外鞘。在質圖譜中我們可以觀察到[Serine+H ]+=106 [Serine+Na ]+= 128, [Serine+K]+= 143 之訊號，分別 CHCA 的圖譜中我們只有觀察到[Serine+H ]+=106，在金奈米粒子方面我們在圖譜在無法觀察到任何的訊號，若是以石墨烯為上層之 10 層堆疊結構為基質我們可以觀察到[Serine+Na ]+= 128, [Serine+K]+= 143 之訊號。其結果如下圖(4-5-5)所示. 49.

(58) 圖(4-5-1)-以金奈米與石墨烯堆疊結構為基質之不同層數對苯丙胺 (Phenylalanine)之探討，質譜圖訊號 m/z:[Phenylalanine+H]+ = 188 ; [Phenylalanine+Na]+ = 204 (a)10LBL-BLANK (b)2 層堆疊結構 (c)5 層堆疊結構 (d) 10 層堆結構 (e) 15 層堆疊結構(f) 20 層堆疊結構。. 50.

(59) 圖(4-5-2)-不同基質對苯丙胺酸(Phenylalanine)之質譜圖, 質譜圖訊號 m/z: [Phenylalanine +Na]+ = 188 ; [Phenylalanine +K]+ = 204 (a)LBL-BLANK (b)以石墨烯為最上層的 10 層結構為基質(c)金奈米粒子為基質(d)有機酸 CHCA 為基質. 51.

(60) (a). (b). (c). (d). 圖(4-5-5)-不同基質對精胺酸(Arginine)之質譜圖, 質譜圖訊號 m/z: [Arginine + H ]+ = 175 ; [Arginine + Na ] = 197 (a)LBL-BLANK (b)以石墨烯為最上層的 10 層結構(c)金奈米粒子 (d)有機酸 CHCA 為基質. 52.

(61) 圖(4-5-4)-不同基質對纈胺酸(Valine)之質譜圖, 質譜圖訊號 m/z: [Valine + H ]+ = 118, [Valine + Na ]+ = 140 ; [Valine + K ]+ = 156 (a)LBL-BLANK (b)以石墨烯為最上層的 10 層結構(b) 以金奈米粒子 (d)有機酸 CHCA 為基質. 53.

(62) 圖(4-5-5)-不同基質對絲胺酸(Serine)之質譜圖, 質譜圖訊號 m/z: [Serine + Na ]+ = 126 ; [Serine + K ]+ = 143 (a)LBL-BLANK (b)以石墨烯為最上層的 10 層結構為基質 (c)金奈米粒子為基質 (d)有機酸 CHCA 為基質. 54.

(63) 因此由上面的實驗結果發現，若是以我們材料基板為基質，比起以傳統金奈米粒子為基質時，我們可以偵測出金奈米所偵測不出的化合物，而且是有良好的訊號表現，另一方面我們比較傳統有機基質 CHCA 我們同樣可以達到相等的訊號偵測，更一步進有優勢的是，在低分子量的背景值，CHCA 常有很嚴重的干擾，而以我們的基材是在背景值是比較沒有雜訊，這在做比較深入的真實樣品的分析的時候，我們的材料是可以更佔有優勢的。. 由於我們的材料最後一層所塗覆的是石墨烯，因此可以大量避免分析物與金奈米粒子所接觸，在胺酸酸裡的官能基含有 NH2 及 COOH, 這兩種官能基都與金有良好的鍵結能力，常用來修飾金奈米表面，因此我們將石墨烯塗覆在最上層可以有效的減少胺基酸分析物與金奈米有直接的接觸，而進行反應，因此可以大大改善游離的問題，我們推測此原因，所以我們的基材擁有比金奈米粒子有更好的訊號偵測結果。. 55.

(64) 4-6 胜肽對 MALDI 分析之探討胜肽是較短的蛋白質，許多胜肽有重要的生物功能或活性,胜肽鍵 (peptide bond) 是由一個胺基酸的酸基，與次一胺基酸的胺基，行脫水縮合反應而成的 C-N 鍵，具有雙鍵的性質, 兩個胺基酸以胜肽鍵連成的二元体，稱之為雙胜 (dipeptide)，三個胺基酸則以兩個胜肽鍵連成三胜 (tripeptide)，許多胺基酸連成多胜 (polypeptide)；再大的胜肽即為蛋白質。因此我們想要進一步研究由胺基酸所組成的胜肽在我們所建構的基材是不是也有良好的訊號表現。. 4-6-1 不同層數與穀胱甘肽 MALDI 分析之探討穀胱甘肽(Glutathione)屬於三肽（Tripeptide），由穀胺酸、半胱胺酸及甘胺酸所構成, 是細胞內濃度最高的的抗氧化劑，可消除自由基存在於身體每一個細胞中，以肝臟內最多，協助解毒工作目前已廣泛應用於肝疾病之治療劑及解毒劑等。一開始我們利用穀胱甘肽進行不同層數的探討，本實驗發現以分析物在濃度為 10-4M 之下，探討塗覆 2、5、10、15、20 層的堆疊結構，在圖譜中我們可以發現[GSH+Na]+= 330 及[GSH+K]+= 346 之訊號，其中又以塗覆 10 的堆疊結構能有良好的訊號表現。其結果如下圖(4-6-1)所示。. 56.

(65) 4-6-2 不同基質與穀胱甘肽 MALDI 分析之探討我們用此 10 層結構進行對穀胱甘肽進行不同基質的探討，基質的比較我們選擇了金奈米粒子、CHCA、單純塗覆 10 層的金奈米基板為基質、單純塗覆 10 層的石墨烯基板為、以金奈米為最上層的 10 層層狀結構基板為基質基質、以石墨氧化物為最上層的 10 層層狀結構基板為基質，以石墨基為最上層的 10 層層狀結構基板為基質進行一系列的比較，在質譜中我們可以得到[GSH+H]+= 308 [GSH+Na]+= 330 及[GSH+K]+= 3465 之訊號。其結果如下圖(4-6-2-a)、圖(4-6-2-b) 所示。. 4-6-3 穀胱甘肽 MALDI 訊號之穩定度探討我們進一步使用金在上層以及石墨烯在上層的 10 層疊狀結構進行穩定度的探討，我們在同一個樣品收集 25 次的訊號其結果如下圖 (4-6-3)所示. 4-6-4 阿斯巴甜與 Bradykinin 對 MALDI 分析之探討根據之前的探討我們使用 10 層堆疊結構進行偵測且比較金奈米粒子為基質進行比較，在阿斯巴甜質圖譜中我們可以觀察到 [Aspartame +Na]+=317 [Aspartame+K ]+= 333 之訊號。其結果如下圖. 57.

(66) (4-6-2)所示。另一方面在 Bradykinin 的質譜同中，我們可以觀察到 [Bradykinin+H]+=1061 之訊號。其結果如下圖(4-6-2)所示. 圖(4-6-1)-以金奈米與石墨烯堆疊結構為基質之不同層數對穀胱甘肽 (Glutathione)之探討，質譜圖訊號 m/z:[Glutathione +H]+ = 330 ; [Glutathione e+ K ]+ = 346 (a)2 層堆疊結構 (b)5 層堆疊結構 (b)10 層堆結構 (d) 15 層堆疊結構(e) 20 層堆疊結構。. 58.

(67) (a). (b). (c). (d). (e). 圖(4-6-2-a)-不同基質對穀胱甘肽(Glutathione)之質譜圖, 質譜圖訊號 m/z: [Glutathione + Na ]+ = 330 ; [Glutathione + K]+ = 347; (a) 金奈米為基質(b) 以金奈米為最上層 10 層堆疊結構為基質(c) 有機酸 CHCA 為基質(d) 以石墨烯 10 層結構為基質(e) 以石墨烯為最上層的 10 層堆疊結構基質. 59.

(68) (a). (b). (c). 圖(4-6-2-b)-不同基質對穀胱甘肽(Glutathione)之質譜圖, 質譜圖訊號 m/z: [Glutathione + Na ]+ = 330 ; [Glutathione + K]+ = 347; (A)金奈米粒子塗覆 10 層為基質(B) 石墨烯塗覆 10 層為基質(C)以石墨烯為最上層的 10 層疊狀結構為基質. 60.

(69) (a). (b). 圖(4-6-3)-穀胱甘肽訊號穩定度之探討 (a)金奈米為 10 層堆疊結構及石墨烯為 10 層堆疊結構穩定度 (b)樣品實際圖. 61.

(70) 圖(4-6-4)-不同基質對阿斯巴甜 (Aspartame)之探討與 Bradykinin 之質譜圖, 質譜圖訊號 m/z: [Aspartame + Na ]+ = 317 ; [Glutathione + K]+ = 333; [Bradykinin + H ]+ =1061; [Bradykinin + Na ]+ =1083; [Bradykinin + K]+ =1099 (a) 金奈米粒子為基質偵測阿斯巴甜(b) 以石墨烯為最上層的 10 層結構為基質偵測阿斯巴甜(C) 金奈米粒子為基質偵測 Bryadykinin(d)以石墨烯為最上層的 10 層結構為基質偵測 Bryadykinin. 62.

(71) 由實驗結果發現，在所分析的四種胺基酸都在金奈米粒子為基質的偵測下，都無法發現訊號的產生，而以 CHCA 為基質時可以偵測到訊號但低分子區域還是有許多背景干擾訊號，而以我們堆疊材料為基質可以偵測到良好的訊號且低背景干擾之質譜圖。. 進一步我們利用穀胱甘肽進行更深入的探討，穀胱甘肽同時具有 NH2 ,COOH,SH 這三種官能基，同時這三種官能基都是與金有良好鍵結能力，我們想要進一步研究這樣的分子結構若以金奈米為基質是不是會影響訊號的表現，結果發現如果以石墨烯堆疊結構為上層可以有效的偵測此化合物，並擁有良好的訊號表現，另一方面我在比較金奈米與石墨烯為上層的堆疊結構進行穩定度的探討，更證明以石墨烯為上層的結構有較好的穩定性。. 最後我們比較金奈米粒子與我們的基材當基質偵測以胺基酸所組成的牲肽，因為胜肽還有多個 NH2 與 COOH 官能基，我們相信這類的化合物會以金奈米為基質會難以產生良好的訊號，結果同樣也證實，以金奈米粒子偵測胜肽的訊號不佳，可能就是因為分析物產生的鍵結反映導致游離困難，而我們所塗覆石墨烯為上層能避免分析物與石墨烯接觸能有良好的訊號表現。. 63.

(72) 第五章結論本實驗成功合成 13nm 金奈米粒子與石墨氧化物，並且為第一次使用旋轉塗覆的方法堆疊出金奈米粒子與石墨烯之堆疊結構，再將其應用在基質輔助雷射脫附游離質譜儀，這樣的方式可以有較平整的結構能夠有更好的能量傳遞的效果。. 比較不同層數進行分析物探討，以石墨烯在最上層的十層堆疊結構有比較好的訊號，進一步我們比較了廣泛應用在小分子分析的金奈米粒子及一般有機酸，金奈米粒子與石墨烯之堆疊結構，普遍有較好訊號表現及低背景干擾。. 本實驗所建構的基材是以石墨烯塗覆在最上層，這樣的結構是比較疏水性的，因此點樣的過程中會有比較集中的液珠，另外也可以避免如穀胱甘肽這類分子具有與金奈米良好鍵結的官能基直接接觸反應，而增加游離過程的困難所導致訊號不佳的情形。. 針對穀胱甘肽的穩定度進行探討，發現以上層為石墨烯的基材比以金奈米為上層的基材有更好的訊號強度及穩定性，其中石墨烯為上層的有較好穩定度(RSD=15%) 64.

(73) 本研究開發的是基板同時兼具了基質的特性，在點樣前製備過程中是簡單且快速的，且我們成功分析出小分子的醣類、胺基酸及大分子胜肽，在未來的研究是極具潛力且發展性。. 65.

(74) 文獻參考 1. Riedl, C.; Coletti, C.; Iwasaki, T.; Zakharov, A. A.; Starke, U. Phys. Rev. Lett. 2009, 103, (24), 246804. 2. Chen, B.; Meinertzhagen, I. A.; Shaw, S. R. J Comp Physiol A 1999, 185, (5), 393-404. 3. Marcano, D. C.; Kosynkin, D. V.; Berlin, J. M.; Sinitskii, A.; Sun, Z.; Slesarev, A.; Alemany, L. B.; Lu, W.; Tour, J. M. ACS Nano 2010, 4, (8), 4806-4814. 4. Li, X.; Cai, W.; An, J.; Kim, S.; Nah, J.; Yang, D.; Piner, R.; Velamakanni, A.; Jung, I.; Tutuc, E.; Banerjee, S. K.; Colombo, L.; Ruoff, R. S. Science 2009, 324, (5932), 1312-4. 5. Novoselov, K. S.; Geim, A. K.; Morozov, S. V.; Jiang, D.; Zhang, Y.; Dubonos, S. V.; Grigorieva, I. V.; Firsov, A. A. Science 2004, 306, (5696), 666-9. 6. Popovtzer, R.; Agrawal, A.; Kotov, N. A.; Popovtzer, A.; Balter, J.; Carey, T. E.; Kopelman, R. Nano Lett. 2008, 8, (12), 4593-4596. 7. Alric, C.; Taleb, J.; Duc, G. L.; Mandon, C.; Billotey, C.; Meur-Herland, A. L.; Brochard, T.; Vocanson, F.; Janier, M.; Perriat, P.; Roux, S.; Tillement, O. JACS 2008, 130, (18), 5908-5915. 8. Im, J.; Chandekar, A.; Whitten, J. E. Langmuir 2009, 25, (8), 4288-92. 9. Yigit, M. V.; Zhu, L.; Ifediba, M. A.; Zhang, Y.; Carr, K.; Moore, A.; Medarova, Z. ACS Nano 2010, 5, (2), 1056-1066. 10. Kuo, T. R.; Chen, J. S.; Chiu, Y. C.; Tsai, C. Y.; Hu, C. C.; Chen, C. C. Anal Chim Acta 2011, 699, (1), 81-6. 11. Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1985, 57, (14), 2935-2939. 12. Lund, B. C.; Abrams, T. E.; Gravely, A. A. J Rehabil Res Dev 2011, 48, (5), vii-ix. 13. Wen, X.; Dagan, S.; Wysocki, V. H. Anal. Chem. 2006, 79, (2), 434-444. 14. Liu, C. W.; Chien, M. W.; Chen, G. F.; Chen, S. Y.; Yu, C. S.; Liao, M. Y.; Lai, C. C. Anal Chem 2011, 83, (17), 6593-600. 15. Liu, Y.; Liu, J.; Yin, P.; Gao, M.; Deng, C.; Zhang, X. J Mass Spectrom 2011, 46, (8), 804-15. 66.

(75) 16. Chen, S.-Y.; Li, K.-I.; Yu, C.-S.; Wang, J.-S.; Hu, Y.-C.; Lai, C.-C. Anal. Chem. 2010, 82, (14), 5951-5957. 17. Teng, C.-H.; Ho, K.-C.; Lin, Y.-S.; Chen, Y.-C. Anal. Chem. 2004, 76, (15), 4337-4342. 18. Nayak, R.; Knapp, D. R. Anal. Chem. 2010, 82, (18), 7772-7778. 19. Wu, H.-P.; Su, C.-L.; Chang, H.-C.; Tseng, W.-L. Anal. Chem. 2007, 79, (16), 6215-6221. 20. Seino, T.; Sato, H.; Yamamoto, A.; Nemoto, A.; Torimura, M.; Tao, H. Anal. Chem. 2007, 79, (13), 4827-4832. 21. Tang, H.-W.; Ng, K.-M.; Chui, S. S.-Y.; Che, C.-M.; Lam, C.-W.; Yuen, K.-Y.; Siu, T.-S.; Lan, L. C.-L.; Che, X. Anal. Chem. 2009, 81, (9), 3676-3682. 22. Lee, J.; Kim, Y.-K.; Min, D.-H. JACS 2010, 132, (42), 14714-14717. 23. Yang, H.-J.; Lee, A.-R.; Lee, M.-K.; Kim, W.; Kim, J.-K. Bull. Korean Chem. Soc. 2010, 31, (1), 35-40. 24. Zhou, X.; Wei, Y.; He, Q.; Boey, F.; Zhang, Q.; Zhang, H. Chem. Commun. 2010, 46, (37), 6974-6976. 25. Dong, X.; Cheng, J.; Li, J.; Wang, Y. Anal. Chem. 2010, 82, (14), 6208-6214. 26. Lu, M.; Lai, Y.; Chen, G.; Cai, Z. Anal. Chem. 2011, 83, (8), 3161-3169. 27. Liu, R.; Liu, J.-f.; Zhou, X.-x.; Jiang, G.-b. Anal. Chem. 2011, 83, (10), 3668-3674. 28. Zhang, J.; Dong, X.; Cheng, J.; Li, J.; Wang, Y. J Am Soc Mass Spectrom 2011, 22, (7), 1294-8. 29. Marvin, L. F.; Roberts, M. A.; Fay, L. B. Clin. Chim. Acta 2003, 337, (1-2), 11-21. 30. Chernushevich, I. V.; Loboda, A. V.; Thomson, B. A. J Mass Spectrom 2001, 36, (8), 849-65. 31. Sloley, S.; Smith, S.; Gandhi, S.; Caldwell Busby, J. A.; London, S.; Luksch, H.; Clayton, D. F.; Bhattacharya, S. K. Journal of Proteome Research 2007, 6, (6), 2341-2350. 32. Huang, Y.-F.; Chang, H.-T. Anal. Chem. 2006, 78, (5), 1485-1493.. 67.

(76)