行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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計畫類別： 個別型計畫
□整合型計畫
計畫編號：NSC 90－2611－B－002－002－
執行期間：90 年 08 月 01 日至 91 年 07 月 31 日
計畫主持人：王重雄教授
執行單位：國立台灣大學昆蟲學系
中
華
民
國
91 年
10 月 23 日
蝦白點症病毒在細胞株中的病原性分析及毒力突變株之分離
The Analysis of in vitro Pathogenicity of WSSV and
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫編號：NSC 90-2611-B-002-002
執行期限：90 年 08 月 01 日至 91 年 07 月 31 日
主持人：王重雄教授
一、中文摘要
蝦白點症(white spot syndrome)之病原 體稱之蝦白點症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)。是危害蝦業養殖之重要病原 體。利用蝦血球細胞之初級培養以增殖蝦 白點症病毒的實驗已穫得初步的成功。並 經由電子顯微鏡的觀察證實此體外增殖法 確可用作蝦白點症病毒體外操作。從超微 構 造 及 蝦 白 點 症 病 毒 形 成 團 (virogenic stroma, VS)的分佈位置可知確有變異株存 在。VS 除了典型在核內外，胞質亦有病毒 形成團的存在。後者之胞核正常，但胞質 內之胞器多數已降解，而呈現許多空泡。 三 種 血 球 細 胞 中 以 透 明 血 球 (hyaline hematocytes)接受 WSSV 感染為最高，其次 是半顆粒細胞 (semigranulocytes)，而顆粒 細胞 (granulocytes)最低。此結果在類淋巴 結(lymphoid organ)之電子顯微鏡的觀察下 亦證實有此二不同的病毒形成團存在，而 且在類淋巴結之各類細胞皆可發現。 關鍵詞：蝦白點症病毒，蝦血球細胞，變 異株 Abstract
The causative agent of white spot syndrome (WSS) has been identified to be white spot syndrome virus (WSSV). WSSV is an important pathogen that causes a great impact on the shrimp culture industry. The in vitro propagation of WSSV in the primary
culture of shrimp hemocyte had been
established successfully in this study. Under electron microscopy, we not only confirmed our result, but also we found one WSSV mutant which formed a virogenic stroma in cytoplasm. The cytoplasm of infected cells with virogenic stroma showed the degenerated phenomena: degraded organelles and vacuolation, but their nuclei were more or less in normal shape. The hyaline hematocytes are the highest WSSV susceptibility cells, followed by semigranulocytes, and then granulocytes. The mutant was also confirmed by the electron microscopic observation of lymphoid organ and could be found in all kinds of lymphoid cells.
Keywords: WSSV, Shrimp hemocytes,
mutant
二、緣由與目的
蝦白點症(white spot syndrome)之病原
體稱之蝦白點症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)，是危害蝦業養殖之重要病原 體。其特性前已有詳盡的報導 (Wang et al., 1995)，目前尚未確定其分類地位，極有可 能另成立一病毒科 (Liu et al., 2001)。目 前尚未有任一種蝦類對此病毒具有抗性， 可見 WSSV 的宿主範圍甚寬，為害甚廣 (Lo et al., 1996)。 WSSV 是一相當大的 DNA 病毒 (70-150 x 250-300nm)，台灣株具有 307,287nt (AF440570)，雖然台灣株與泰國 和大陸株略有差異，但有關 WSSV 的變異
株，只有幾篇報導，如來自不同蝦類之三 種分離株(Cesar et al., 1998) 以及不同地理 株 (Lo et al., 1999)，此項的研究皆未見後 續的報導。主要因素是未有適當的 WSSV 體外增殖法以供變異株的篩選與單株化。 建立 WSSV 可接受體外培養系統以增 殖和操作此病毒，以期突破 WSSV 的研究 之一相當大的瓶頸。在各方面的努力下， 雖然有細胞株的建立 (Hsu et al., 1995) 和 高滲透壓。高 pH 值培養的昆蟲細胞的嘗 試，但可惜的是皆未能接受 WSSV 的感 染。類淋巴結初級細胞培養已證實是一種 可行的方法 (Wang et al., 2000)。但健康蝦 的類淋巴結不易獲得，因類淋巴結內至少 有 7-8 種以上的不同病毒被分離到 (Spann et al., 1995)，並常可見共感染現象。本研 究建立以蝦血球之初級細胞培養方法，期 能提供更有力的工具或方法，以為 WSSV 之病毒增殖及體外操作之用。 三、結果與討論 1. 血球細胞的抽取與培養 健康蝦來自台灣省水產試驗所屏東分 所。經 WSSV 檢測 (Lo et al., 1996)是不帶 原的蝦，以作為本研究的試驗蝦。蝦血液 由蝦腹面第二腹節抽取後即與修改的 L15 培養液 (530 mOs; pH 7.2)混勻，輕注入 培養皿，置放半至一小，蝦血球細胞即可 均勻附著在培養皿上，即放置於 28 0 C，以 供感染之用。未感染的血球細胞可繼續維 持活力達 8-10 天。 2. 血球細胞之感染及病毒之檢測 蝦血球細胞均勻附著在培養皿上後一 小時，以 WSSV 的懸浮液吸咐感染一小時 後，以新鮮修改的 L15 培養液 (530 mOs; pH7.2) 更替。在不同時序下 (8; 16 ; 32; 64; 及 72 hr)，取出血細胞分別利用 PCR 檢測 及電子顯微鏡的觀察。蝦血球細胞含有三 種: 透明血球 (hyaline hematocytes)，半顆 粒 細 胞 (semigranulocytes) 和 顆 粒 細 胞 (granulocytes)。 此三種血球皆出現在未感 染及感染的培養皿內。此證實三種血球皆 可成功地培養，數量上以透明血球佔多 數，其次是半顆粒細胞，而顆粒細胞最少。 感染後 8 小時，血細胞雖然 PCR 是正 反應。但超微觀察下。多數病毒可見於胞 質，少數在細胞間。至 32 小時，偶可見病 毒 於 胞 核 內 ， 但 未 見 明 顯 的 細 胞 病 變 (cytopathic effect, CPE)。感染後 64 小時， 約有 1/5 的細胞可見典型的細胞病變，如細 胞圓化;胞質空泡化並含有大的內含體，內 含體內有纖維狀構造及電子緻密顆;胞核 膜漲大，核膜之內外膜間形成大囊池，核 孔明顯; 細胞核漲大，核中央呈電子疏鬆， 內有發育中的病毒粒子，只含有少數的成 熟病毒粒子。此時具細胞病變的血球以透 明血球為主，少數是半顆粒細胞。只有極 少數的血球的胞質可見病毒粒子，此種感 染細胞可分成兩種: 病毒粒子散佈在胞質 中或病毒粒子集中在胞質之內含體內。前 者細胞質產生退行性細胞病變，亦即細胞 空泡化，大部份的胞器都消失;而後者有些 胞器仍存在。二者之共有的現象是具有一 超微構造正常的核，但其核膜間隙因漲大 而呈現大的囊池 (cisternae) 。感染後 72 小時，至少有半數以上的細胞可見典型的 細胞病變(Wang et al., 1995) 及少數的血 細胞之胞質具有內含體，前者血細胞包括 了透明血球，半顆粒細胞及顆粒細胞，而 後者只可見於透明血球及半顆粒細胞。有 些細胞因感染而崩解，因此培養液內可見 細胞碎片及球狀顆粒，在電檢下，可見游 離的病毒粒子，含有病毒粒子的內含體及 漲大的核。 從以上的結果我們可作下列幾項的結 論: (1) 血球細胞的初級培養可用以作 WSSV 之病毒增殖及體外操作之用。 (2) 所有的血球細胞皆可接受 WSSV 的感染。 (3) WSSV 可直接攻擊細胞，導至細胞的崩 解。 (4) 血球細胞中以透明血球對 WSSV 接受力最高，其次是半顆粒細胞。而顆粒 細胞接受力最低。 (5) WSSV 之形成及增 殖多數在核內，少數在胞質的內含體內。 後者是否是 WSSV 的變異株。有待追一步 的研究。
3. 感染 WSSV 蝦之類淋巴結的電顯觀察 以相同的病毒液注入健康蝦，於接種 後 72 至 96 小時，取出類淋巴結進行電顯 的處理及觀察。根據 Wang et al. (2000) 之 體外培養的類淋巴結初級細胞所分類的細 胞種類可知網狀細胞 (reticular cells) 是類 淋 巴 結 的 管 細 胞 ; 類 纖 維 毋 細 胞 (fibroblast-like cells) 是類淋巴結的基質細 胞 (cells of the stromal matrix); 吞噬細胞 和顆粒細胞 (phagocytes and granulocytes) 則是血球細胞; 而脂肪細胞 (adipose cells) 在類淋巴結細胞中的極少數，它參入基質 細 胞 中 ; 最 後 則 是 具 濃 核 的 細 胞 (cells with pycnotic nuclei) 實 際 是 退 化 細 胞 (degenerated cells)。電顯觀察的結果令人 驚異的是各類細胞 (除濃核細胞和吞噬細 胞外)，皆可見典型的 WSSV 細胞病變外。 有些細胞之胞質內具有含有病毒粒子的內 含體，內含體內亦含有纖維狀搆造及電子 緻密顆粒，亦即內含體內的搆造實際上是 病毒形成團。唯吞噬細胞只可見胞質內具 有含有病毒粒子的內含體，但不見典型 WSSV 細胞病變，此結果與上期的報告 (Wang et al., 2000) 相符合。 從類淋巴結之感染細胞的超微構造， 我們亦可作下列結論: (1) 類淋巴結細胞 除濃核細胞和吞噬細胞皆可受 WSSV 感染 而呈典型的 WSSV 細胞病變。 (2) 除濃核 細胞外，所有類淋巴結細胞皆可見胞質內 具有含有病毒粒子的內含體。 (3)胞質內 具有含有病毒粒子的內含體。此結果與血 球細胞的結果一致。 (4) 胞質內之具有的 WSSV 內含體，是否真正因突變株所致亦 或因其他因素 (如吞噬作用，或蝦之緊迫 亦或營養問題) 則有待近一步研究。 四、計畫成果自評 本計畫建立一極為方便的蝦初級培養 系統，以供 WSSV 體外增殖及操作之用， 咸信此法的建立將有助於 WSSV 之研究。 WSSV 之體外 (血球細胞) 和體內 (蝦體) 感染，皆證實可能有在胞質增殖之變異株 存在，可惜的是在本研究之期限內未能將 此變異株單株化，以測其致病力，並分析 其基因體，應對防治 WSSV 之感染有大的 助益。 五、參考文獻
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