行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
建立全長第八因子的表達系統及從第八因子的細胞內運轉
過程了解血友病的致病機轉(3/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC92-2314-B-002-264- 執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學醫學院醫事技術學系暨研究所 計畫主持人： 林淑華 報告類型： 完整報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 93 年 11 月 16 日
1 研究成果報告 中文摘要 A 型血友病是由於病人血液中缺乏第八因子活性所造成，此疾病為性聯 遺傳，在男性發生率約五千到一萬分之一。第八因子由肝臟合成分泌，在血 漿中第八因子濃度非常低（約為 100ng/ml），與構造相似的蛋白－第五因子相 比低了 100 倍。已知無任何細胞株可自然表現此蛋白，而體外細胞培養系統 也無法大量合成第八因子（表現量比其它重組凝血因子蛋白低一百到一千 倍），使得第八因子在生合成及結構功能的相關研究、治療用蛋白的開發，以 及基因治療上都受到限制。為了建立高產量的重組第八因子表達系統及適合 活體細胞內觀察方法，以研究第八因子蛋白在細胞的生合成及運轉過程，故 進行下列實驗：一、利用肝細胞專一載體pBS-HCRHPI-A 於肝癌細胞株中表 達全長之重組第八因子蛋白。二、參照hydrodynamics- based transfection 建立 小鼠活體內重組第八因子蛋白表達系統。三、以FlAsH- EDT2染劑進行第八 因子蛋白在肝細胞內之活體標定。四、利用高純度的重組第八因子蛋白進行 抗第八因子單株抗體之製備。五、參照血友病人的基因突變，建構六個點突 變第八因子表達質體（突變146、386、1689、1789、1823 及 1942），並合成 其重組蛋白，來進行相關研究。本研究目前已完成所有質體之建構，並以DNA 定序確認；在活體外培養哺乳動物細胞株表達系統中，進行穩定表達重組第 八因子蛋白細胞株之選殖；在小鼠活體表達系統中，除已建立相關條件和分 析方式外，分析更偵測到蛋白表達量較以往表達系統高出 500 倍之多。另外 於活體標記系統上，已完成活體標定染劑FlAsH- EDT2最適宜濃度及相關染 色步驟的測試；在抗第八因子單株抗體之製備上，也挑選出八個細胞聚落進 行第二次限數稀釋，以得單株化細胞株。未來可利用活體標記技術，在活體 外及表現量超高的活體小鼠表達系統，分析正常第八因子在肝細胞內生合成
2 及運轉過程，以探討第八因子低表現量的原因外；更可比較該過程於正常第 八因子及病人的突變蛋白之異同，以了解第八因子各結構功能區之可能功 能，以期將來可應用於更高效能、更具經濟價值之治療用重組第八因子蛋白 之開發。 關鍵詞：凝血第八因子、哺乳細胞表達系統 、A 型血友病的致病的分子機制。
前言
A 型血友病是人類最常見的先天性出血性血液凝固異常疾病，此疾病是因 為病人血液中缺乏第八因子（factor VIII）活性所導致，屬性聯遺傳，發生率大
約是每5000-10000 男性中有一位（1,2）。第八因子是活化的第九因子（activated
factor IX；FIXa）的輔因子；在凝血機轉中，活化的第九因子會切割活化第十 因子（factor X），導致下游一連串酵素反應而產生血纖維凝塊（fibrin clot）使 血液凝固（4），在此過程中，活化的第八因子可催化活化的第九因子切割第十 因子的速率達10000 倍以上（2）。 第八因子基因位於X 染色體長臂的尾端（Xq28），基因全長 186 kb，含有 26 個表現序列（exon），mRNA 長約 9 kb，轉譯出 2351 個胺基酸的多肽鏈；其 中第1 - 19 個胺基酸為訊號胜肽鏈（signal peptide），成熟的第八因子具有 2332 個胺基酸（3,5）。依蛋白質胺基酸序列，可將第八因子蛋白區分成 A、B、C 三 種結構功能區（domain），由 N 端到 C 端依序為 A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2 （5）；其中a1、a2、a3 為酸性區域是含有多個天冬胺酸（Asp）及穀胺酸（Glu） 的小間隔區，其構造與另一個凝血因子－第五因子非常相似。第八因子主要由 肝細胞製造（6），在血漿中的濃度很低（約為 100ng/ml），是第五因子的百分之
一（4,8）。在血液循環中第八因子會與vWF 因子（von Willedrand factor）結合，
形成非共價複合物。一旦經凝血酶切割後，第八因子會與vWF 因子解離並活
化，形成三聚體：A1-a1 / A2-a2 / A3-C1-C2，始具有輔因子活性（7）。活化第 八因子以輕鏈（A3-C1-C2）與 vWF 因子 （9-11）、活化的蛋白質 C（12）及磷
脂質（9）結合，而第九因子的結合區則位於A2 及 A3 結構功能區（13），另外
B 結構功能區不參與第八因子的功能（9,14）。
針對A 型血友病患的治療，除了由人類血漿純化所得的第八因子濃縮液外
（15），為避免血液疾病傳染病，目前已有從哺乳動物細胞作出的重組第八因子
作出 2351 胺基酸），且只有哺乳細胞製造出來的第八因子才有功能，無法使用 其他系統表達，合成量非常低，約為其他重組蛋白產量的一千到萬分之一（23）， 使得重組第八因子蛋白不但價格昂貴，且產量一直無法滿足病人的需要。另一 方面，基因治療現在仍在臨床第 I-II 期試驗階段（19-21），無法取代現行的治 療方式，因此如何提昇重組蛋白的產量，在未來十年內仍是急待解決的問題。 關於重組第八因子蛋白在細胞表達系統中表達量甚低，有下列幾個已知原 因，包括：一、第八因子核苷酸序列中具轉錄抑制子（transcriptional silencer） 使得訊息核苷酸（mRNA）表達量較差（20）。二、剛合成的第八因子蛋白在成
熟過程中會與內質網內的Bip 與 Calnexin 等 chaperone 互相作用，而滯留於內
質網中無法成功分泌出細胞外（21）。三、第八因子蛋白本身極不穩定，分泌出 細胞後，需與 vWF 因子結合成穩定結構以不被降解；在活體外表達系統中，常 為純化方便而不添加 vWF 因子，使第八因子在分泌的同時已有大量蛋白被降解 （22）。近年來也有許多實驗室嘗試提昇重組第八因子蛋白的表達量，例如將第 八因子 B 結構功能區刪除後，其蛋白活性與全長的第八因子蛋白並無差異，不 但可縮短第八因子 cDNA 序列約 40%，還能有效提昇重組蛋白的產量達數十倍 之多（由0.02ng/106cells/24hr 提昇至 0.084ng/106cells /24hr；23）。此外，也有報
告在第八因子cDNA 序列中加入可提高重組蛋白表達量之第九因子 intron I，亦
能提昇八到十五倍的產量（24）。 到目前為止，有關第八因子生合成的論文幾乎都是出自於Dr. Kaufman 的 實驗室（美國密西根大學），且多數實驗室均使用無B 結構功能區之重組第八 因子蛋白進行分析，雖然不具B 結構功能區的第八因子蛋白在活性上等同於全 長的第八因子；但由於B 結構功能區佔第八因子大部分 N-link 胺基醣化位置（25 個中的18 個），目前尚無法証明此高度修飾的結構功能區對第八因子在細胞內 運轉等過程的影響。為了符合人體內的模式，本實驗室決定表達全長之重組第 八因子蛋白；由於第八因子主要由肝臟製造，本實驗室使用肝細胞株進行第八 因子之生合成及細胞內運轉過程之探討，並利用含有加強子（enhencer）、肝細
胞專一性啟動子（Human α1-antitrypsin; hAAT promoter）、以及可提昇第八因子
蛋白產量的第九因子之intron I（24）的載體 pBS-HCRHPI-A 來進行實驗，並著
手進行穩定表達重組第八因子蛋白的肝細胞株之選殖。
同時，由於以往以活體外培養哺乳動物細胞株表達全長重組第八因子蛋
白，產量都很低（約為 0.02ng/106cells/24hr；23），僅為其他重組蛋白產量一千
到萬分之一；受限於重組蛋白表達量的問題，無法進一步分析。為此，本實驗
室參照hydrodynamics- based transfection 的原理：將含高濃度欲表達基因質體
DNA 的 PBS 緩沖液，在極短時間（約 6-8 秒）內，以大量體積用尾巴靜脈注射 方式注入小鼠體內；約24 小時後，即可觀察到活體小鼠肝臟表達該重組蛋白， 並可在周邊血測得。依文獻表示，以luciferase 測試，每 5µg 的質體 DNA，可 以生成約每克肝細胞組織中含45µg 重組蛋白；而以組織染色也可觀察到，在注 入ß-galactosidase 質體 DNA 後，也有近四成的肝組織細胞有該重組蛋白之表達 （27）。有鑑於此表達方式的高產量，本實驗室亦應用於重組第八因子蛋白之表 達；以期克服傳統在活體外表達系統之低產量問題，並可進一步觀察在活體內 表達系統（in vivo culture system）中，第八因子在肝細胞內的生合成及相關運 轉過程。 Dr. Gaietta 在 2002 年時發表了一種新的活體細胞標記方式：利用能自由穿 透細胞，具有雙鉮的染劑FlAsH- EDT2會與下列序列中的四個半胱胺酸 （-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys-；Xaa 為半胱胺酸外的任意胺基酸）進行高特異 性及高親和力的結合，並於結合後才會發出綠色螢光的特性來進行活體細胞標 記。這樣的標定方式不需先固定細胞，且該染劑對細胞的毒性亦不明顯，尤其 只需在欲研究之蛋白 C 端加入含此序列的小片段胜肽鏈（4-20 個胺基酸），可 使標定動作對欲研究之重組蛋白的影響降到最低。在該篇文章中，作者還利用
了另一雙鉮染劑（ReAsH- EDT2）進行標定，ReAsH-EDT2也會與上述序列中的
四個半胱胺酸呈高特異性及高親和力結合，結合後則具紅色螢光。利用這兩種
同染劑標定，藉由螢光顏色不同區分出不同時間合成的重組蛋白；此外，ReAsH- EDT2染劑亦可作為電顯觀察之標誌物，使得活體標定觀察之解析度可因電顯輔 助而大有進展（25）。本實驗欲利用此標定方式進行重組第八因子蛋白之活體標 定，來觀察第八因子的生合成及代謝過程。 由於第八因子分子巨大，且分泌濃度很低，因此探討第八因子的生合成及 結構功能關係的研究相當不易，大都必須依賴單株抗體的使用。雖然市面上有 一些第八因子的單株抗體可供使用，但一般皆十分昂貴，且可適用的用途也不
廣，如American Diagnostica 公司生產的 ESH 系列單株抗體，只有註明抗體抑
制第八因子活性的能力，及少數抗體的應用項目，某些只適用於免疫沈澱但不 適用於西方點墨法，有些反之。實驗室自備單株抗體的好處在於可以大量供應， 還可以用於篩選病人突變的第八因子、純化第八因子、以及研究第八因子細胞 內的代謝（包括正常及突變）。之前實驗室利用大腸菌合成的第八因子融合蛋 白，產生了三株對結構功能區具專一性的單株抗體，D2、E6 及 B12；其中 D2 及E6 分別作用於第八因子輕鏈及 B 結構功能區的 N 端，B12 則作用於 A1 結 構功能區， D2 及 B12 分別可抑制第八因子活性 80%以上。但由於對第八因子 的親和力均太低（以biosensor 儀器測得，D2：1.62×107 M-1，E6：2.2×108 M-1， B12 則太低無法偵測），且為了得到更多作用於第八因子蛋白不同結構功能區的 單株抗體，以為日後對重組第八因子蛋白之分析應用，本實驗室亦利用高純度 重組第八因子蛋白（Hemofil M, Baxter 公司所提供）免疫小鼠，進行第八因子 單株抗體之製備。 為詳細探討第八因子的生合成及其構造與功能的相關性，之前本實驗室已 對國內 A 型血友病患之基因突變作完整的分析，完成了 102 位（87 個不同家族） 病人第八因子突變之鑑定，建立A 型血友病患臨床表型及相關突變點之資料庫 （26）。本實驗中，進一步從病人資料庫中選定了數個位於不同結構功能區、臨 床表型嚴重度亦不同之突變進行第八因子cDNA 之定點突變，針對這些突變的 重組第八因子蛋白進行研究分析，以進行相關之結構功能探討。
研究目的 利用活體外哺乳動物肝細胞株及活體小鼠之表達系統，分析正常第八因子 在肝細胞內生合成及運轉過程，以探討第八因子低表現量的原因。同時比較該 過程於正常第八因子及病人的突變蛋白之異同，以了解第八因子各結構功能區 之可能功能，以期將來可應用於更高效能、更具經濟價值之治療用重組第八因 子蛋白之開發。 研究方法 壹、質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII 之建構 由於載體pBS-HCRHPI-A 上沒有適用的限制脢，故先將連接子 SMS
（Sac-MluI-SacI linker）接入其 NdeI 切割序列中，形成載體 pBS-HCRHPI-A－ SMS；再將包含第八因子 cDNA 之質體 pYL1-fVIII 以限制脢 MluI 及 SalI 切割
後，純化出含有全長第八因子cDNA 大小 7.1 Kb 之 DNA 片段，接入載體 pBS-HCRHPI-A－SMS 中相同的限制脢位置，以 T4連接脢連結之；轉形 （transform）至勝任細胞後，以兩條分別位在載體 pBS-HCRHPI-A－SMS 及第 八因子 cDNA 上之引子組成 colony PCR 進行篩選。具有反應物之菌株再以限制 脢 EcoRV 切割確認後，進行 DNA 定序分析。 貳、肝癌細胞株之轉感（transfection） 本實驗中利用之人類肝癌細胞株（Hep3B、HepG2、Huh7）均以外加 10% FBS、2 mM L-glutamine、100 unit/ml penicillin、100μg/ml streptomycin 之 DMEM （Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培養液培養；繼代培養時，Hep3B 和 Huh7 以 0.05% Trypsin，HepG2 以 0.25% Trypsin 作用後，打散細胞，取適量細 胞繼續培養。本實驗共使用了三種轉感方法：
各細胞株所用條件如下： 細胞濃度 cells/ml 體積 ml 質體DNA 量 μg 電擊緩衝液 電擊電 壓 V 電擊電 μF 溫度 ℃ Hep3B 7 x 106 0.5 40 MEM 320 500 25
HepG2 107 0.4 20 PBS buffer 300 960 on ice
Huh7 7 x 106 0.5 40 MEM 320 500 25
細胞電擊後於直徑10 公分的培養皿中培養 48 小時後，進行觀察分析。
二、
磷酸鈣沈澱法（calcium phosphate precipitation）轉感前一天取適量之肝癌細胞株於六格培養盤（6-well plate）中培養 12 至 16 小時後，細胞生長達七成滿即可進行實驗。取 125μl 質體 DNA（5μg）加
入 125μl 氯化鈣溶液中，混合均勻後，以一秒一滴的速度緩慢加入 250μl 的 2
倍 HBS 溶液（0.28 M Nacl / 1.5 mM sodium phosphate / 50 mM Hepes，pH 7.1）
並同時打入氣泡，以利於磷酸鈣沈澱之產生。加完後劇烈震盪20 秒並靜置室溫
20 分鐘，再均勻加進細胞培養液，培養 16 小時後，再以 PBS 沖洗細胞三次，
繼續培養 48 小時後進行觀察分析。
三、
lipofection 轉感法利用Lipofectamine™ 2000 轉染試劑組（invitrogen™ life technologies 公司）
進行轉染。在轉感前一天取適量之肝癌細胞株以2 ml 不含抗生素之培養液於六
格培養盤（6-well plate）中培養 12 至 16 小時，細胞生長達九成滿即可進行實
驗。分別將欲轉染之質體DNA 與 10μl Lipofectamine™ 2000 轉染試劑稀釋於
不含血清的250μl Opti-MeM® 培養液中，靜置室溫5 分鐘後，將兩者均勻混合，
置於室溫 20 分鐘，再均勻加進細胞培養液，培養 48 小時後進行觀察分析。
參、hydrodynamics- based transfection 重組蛋白表達法
一、
hydrodynamics 小鼠尾巴靜脈注射抽出，並取適量之基因質體DNA 稀釋於注射用 PBS 緩沖液中。取四周大之 ICR 品系公鼠，在6-8 秒內，每隻小鼠以 22 號針頭由尾巴靜脈注射入含 100μg 質 體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII DNA 之 2 毫升 PBS 緩沖液。在固定時間點後， 以眼窩採血法收集老鼠周邊血，離心取得血漿後，即可利用酵素連結免疫吸附 試驗（ELISA）分析老鼠血漿中人類重組第八因子蛋白之含量；同時犧牲小鼠， 取得小鼠肝臟製成切片，進行肝臟切片免疫染色分析。
二、
人類重組第八因子蛋白酵素連結免疫吸附試驗 取實驗室自備抗第八因子單株抗體D2 稀釋在 50 mM bicarbonate 緩沖液 中，使濃度為20μg/ ml，各取 100 μl 加入 96 孔微量盤中，在 4℃吸附過夜後， 用TBST 清洗三次，加入含 5%脫脂牛奶的 TBST 於 4℃作用過夜，之後置於 4 ℃保存。測量檢體時，取出適當數量的微量盤，吸掉TBST 溶液後，用 TBST 清洗三次，依序加入100μl 待測檢體（稀釋於 TBS/ 0.1%BSA 當中），在 4℃作 用過夜後，再加入稀釋5000 倍有鹼性磷酸脢標示的抗第八因子多株抗體（Enzyme Research Laboratory 公司），在室溫作用兩小時後，用 TBST 清洗三
次，最後加入受質溶液Enhanced K-Blue® TMB Substrate（Neogen 公司）在室溫
作用 15 分鐘，呈色後放入微量盤判讀儀（SPECTRAmax340 microplate reader，
Molecular Devices 公司），於波長 450nm 下讀取吸光值。 肆、重組第八因子蛋白之活體標定
一、
質體TA-fVIII -CTCD 之建構 引子fVIII-CTCD 全長 86bp，為反向引子，包含第八因子 cDNA 3`端序列 （18bp），並於轉譯終點（TGA）前插入 16 個胺基酸，其中含有四個半胱胺酸， 最後接上限制脢SalI 切割序列 （5`-AAA/CGC/GTC/GAC/TCA/TGC/CCT/AGC/ACA/ACA/CTC/CCT/ACA/AC A/AGC/CTC/CCT/TGC/GGC/AGC/CTC/TGC/GAT/GAG/GTG/GTG/TGC/CTC/G C-3`）。利用此引子與位在第八因子 exon 23 之引子 8E23U 進行聚合脢連鎖反益生生技公司），完成質體TA－fVIII－CTCD 之建構，並進行 DNA 定序分析 確認。
二、
質體pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII -CTCD 之建構質體TA－fVIII－CTCD 以限制脢 SalI 及 SwaI 切割後，純化出 600 bp 之
DNA 片段，再接入質體 pBS-HCRHPI-A－SMS－fVIII 上相同的限制脢位置； 再轉形（transform）至勝任細胞，利用限制脢 PstI 切割篩選，並進行 DNA 定 序確認。
三、
以染劑FlAsH- EDT2進行活體細胞標記利用FlAsH- EDT2 Labeling Kit（PanVera 公司）進行肝癌細胞株活體標記。
先將欲標記細胞以PBS 沖洗二次後，與染劑 FlAsH- EDT2 0.125μM （溶於 10 μM EDT 1g/l 葡萄糖 HBSS 中）於 37℃作用一小時後，再以清洗緩衝液（250 μM EDT 1g/l 葡萄糖 HBSS）沖洗 2 次，每次各 10 分鐘。最後再以 PBS 沖 洗細胞三次，並利用 4% formardehyde 進行固定，完成封片後即可於螢光顯微 鏡下觀察。 伍、抗第八因子單株抗體製備
一、
小鼠免疫 選用6 週大、純品系的 BALB/ c 小鼠，第一次免疫取等體積的重組第八因子蛋白（75μg，由 Baxter 公司所提供）溶液與 Freund 完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，Sigma 公司）混合完全後，採皮下注射，共免疫三隻小鼠。之後每隔
十天追加免疫一次，皆以等體積的重組第八因子蛋白溶液與Freund 不完全佐劑
（Freund’s incomplete adjuvant，Sigma 公司）混合，進行皮下注射。分別於免
疫前、第三次及第五次免疫後一週自眼角採血，以 ELISA 檢測血清中抗體效價，
並選取第五次後，血清稀釋 105倍下仍具高效價小鼠，於一個月後進行最後一
次免疫，直接注射重組第八因子蛋白溶液至腹腔內，3 天後進行細胞融合。
二、
細胞融合及單株抗體的製備大微生物研究所蔡錦華博士贈與），以2:1 的比例混合，加入 PEG4000 進行細 胞融合（28）。融合瘤細胞經過 HAT 培養基篩選，然後收集培養液，以 ELISA 篩選分泌第八因子抗體的細胞聚落，然後選取呈陽性反應的融合瘤細胞聚落接 著進行限數稀釋法（limiting dilution），以得到單株化細胞株。
三、
以酵素連結免疫吸附試驗篩選融合瘤細胞 將全長重組第八因子蛋白（由Baxter 公司所提供）稀釋在含 5mM 鈣離子 的 TBS 溶液中，使濃度為 1μg/ ml，各取 100 μl 加入 96 孔微量盤中，在 4℃吸 附過夜後，用TBST 清洗三次，加入含 5%脫脂牛奶的 TBST 於 4℃作用過夜， 之後置於4℃保存。測量檢體時，取出適當數量的微量盤，吸掉 TBST 溶液後， 用TBST 清洗三次，依序加入 100μl 待測檢體（稀釋於 TBS/ 0.1%BSA 當中） 或是細胞培養上清液，在室溫作用三小時後，再加入稀釋5000 倍有鹼性磷酸脢 標示的抗老鼠免疫球蛋白（pharmacia 公司），在 37℃作用兩小時後，用 TBST清洗三次，最後加入受質溶液Enhanced K-Blue® TMB Substrate（Neogen 公司）
在室溫作用15 分鐘，呈色後放入微量盤判讀儀（SPECTRAmax340 microplate reader，Molecular Devices 公司），於波長 450nm 下讀取吸光值。 陸、突變第八因子質體之建構 之前實驗室已參照數位血友病患之第八因子基因突變，來進行第八因子 cDNA 之定點突變，本實驗接續對這些突變第八因子進行 DNA 定序，確定該突 變點正確且該區段其他序列亦未改變後，選擇適當的限制脢將含有突變點之 DNA 片段切出（因各突變點不同而有差異），純化後接入質體 pYLI-fVIII 及 pBS-HCRHPI-A-SMS- fVIII－CTCD 上相同的限制脢切點，與正常第八因子 cDNA 進行置換，利用 colony PCR 及限制脢切割進行篩選後，進行 DNA 定序 分析確認。
結果與討論
壹、利用載體 pBS-HCRHPI-A 於肝癌細胞株表達全長重組第八因子蛋白
一、質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII 之建構
以 SalI 及 MluI 切出質體 pYL1-fVIII 上的第八因子 cDNA，接入同樣經 SalI
及 MluI 切割之載體 pBS-HCRHPI-A－SMS，完成質體
pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII（圖一）之建構。為確認質體中第八因子 cDNA 之 完整性（3`具譯讀終點核苷酸 7206）及轉譯起始序列（ATG，位在第八因子 cDNA
核苷酸151）前並未因建構動作而構成其他轉譯起點，利用位在載體
pBS-HCRHPI-A SMS 上引子（primer: pBSCF）及位在第八因子 cDNA exon 25 之引子（primer: 7003U）定序第八因子 cDNA 與載體 pBS-HCRHPI-A－SMS 頭 尾連接處，確定沒有發生錯誤。 二、肝癌細胞株轉感方式之選擇 第八因子主要由肝細胞合成，為了符合在人體內的表達模式，故構築了會 專一性表達於肝細胞中的表達載體pBS-HCRHPI-A－SMS-fVIII；由於之前報告 顯示，重組第八因子蛋白表達量會因不同細胞株而有差異，故選用三種人類肝 癌細胞株（Hep3B、HepG2 及 Huh7）進行表達研究。為找出各細胞株轉感效能 最好（transfection efficiency）之轉感方式，我們使用三種方法（電穿孔法、磷 酸鈣沈澱法及 lipofection 轉感法），以綠螢光表達質體（pEGFP-C3）進行測試， 轉感48 小時後觀察有表達綠螢光蛋白之細胞比例來了解轉感效能，結果顯示這 三種細胞以lipofection 轉感法進行轉感時，其效能較其它兩種方法好，平均可 以有三成左右的細胞表現綠螢光，因此之後實驗均選擇以lipofection 轉感法進 行轉感。 三、lipofection 轉感法之最佳化 根據Lipofectamine™ 2000 產品說明書建議，可調整質體 DNA (μg)與 lipofectamine（μl）之比例以得到最佳效果，因此我們取用不同量之質體
pEGFP-C3 與 10μl lipofectamine 反應，依下列比例（1:0.5, 1:1.5, 1:2.5, 1:3.5 及 1:5）來進行 lipofection 轉感，48 小時後觀察表達綠螢光蛋白之細胞比例，在同
為細胞全滿情況下，螢光顯微鏡200 倍視野下隨機選取 10 個視野進行細胞計數
來比較，其結果見表一。Hep3B 及 HepG2 在 DNA (μg)與 lipofectamine 10μl
作用比例 1:1.5 的轉感效能較好，而 Huh7 則在作用比例 1:3.5 時有較好的轉感
效能。
四、穩定表達重組第八因子蛋白肝細胞株之選殖
利用之前測試轉感效能最好的作用條件，在欲表達之肝細胞株中進行質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII 及抗藥性質體 pSV2-neo 之 lipofection 共同傳感，再 進行傳感細胞株抗藥性篩選( G418 selection)。為確定所篩選出抗藥性細胞株也
同時具有第八因子質體，進行轉感時，我們將質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII
及質體 pSV2-neo 的濃度調為 10:1。轉感 24 至 48 小時後，以適量比例繼代培養，
並同時以適當濃度G418 進行細胞株抗藥性篩選，約一星期後得到抗藥性細胞
株。
貳、hydrodynamics- based transfection 重組蛋白表達 一、注射後重組蛋白最高表達天數測試 為確定小鼠施與 hydrodynamics 尾巴靜脈注射後，重組第八因子是否會表 達及表達最高天數，分別在進行 hydrodynamics 尾巴靜脈注射 100μg 質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII DNA 後的 24、48、72、96 小時，取小鼠周邊血， 分析老鼠血漿中人類重組第八因子蛋白之含量，結果如圖二。可見小鼠以此重 組蛋白表達法，最高表現量可到5.799 ng/ml（約為正常人體內含量 5.8 %），最 高表達天數則在進行 hydrodynamics 尾巴靜脈注射後的 24 小時（平均每隻為 2.427 ng/ ml）至 48 小時（平均每隻為 1.513 ng/ ml）間。 二、注射質體DNA 量與重組蛋白表達量關係 為找出達最高重組蛋白表達量時，所需小鼠尾巴靜脈注射的質體DNA 量， 我們測試了每隻老鼠分別施打100、150、200、300μg 質體
pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII DNA 24 及 48 小時後，小鼠周邊血中人類重組第八 因子蛋白之含量，結果如圖三、圖四。以施打100μg 質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII DNA 的表達量最高；注射後 24 小時重組第八因子 蛋白產量最高，平均每隻為 2.427 ng/ ml（約為正常人體內含量 2.5%），48 小時 後則平均每隻產量為 1.513 ng/ ml（約為正常人體內含量 1.5%）為次高。 參、重組第八因子蛋白在肝細胞株內之活體標定 一、質體 pBS-HCRHPI-A－SMS－fVIII－CTCD 之建構 為了進行活體細胞標記法，故在第八因子蛋白C 端加上一小段胜肽鏈，此 胜肽鏈含有下列序列-Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys-（Xaa 為半胱胺酸外的任意胺 基酸），可被FlAsH- EDT2染劑結合染色。我們利用聚合脢連鎖反應來插入所需
的核苷酸序列，所設計之引子（primer: fVIII-CTCD），包含第八因子 cDNA 3`
端序列及插入的核苷酸序列及限制脢SalI 切割點。將引子 fVIII-CTCD 與引子
8E23U 進行聚合脢連鎖反應，得到的反應產物接入 TA cloning 的質體中構成質
體TA－fVIII－CTCD，經過 DNA 定序分析後，確定含有所需之 DNA 片段且方
向正確。藉由引子fVIII-CTCD 所外加之 SalI 限制脢切點及原本位在第八因子
cDNA 上之單一限制脢切點 SwaI，便可將所需 DNA 片段從 TA－fVIII －CTCD
切出，接入質體pBS-HCRHPI-A－SMS-fVIII 同樣的位置上，完成質體
pBS-HCRHPI-A－SMS－fVIII－CTCD。以引子 8E23U 進行 DNA 定序分析，確
定轉譯終點前已成功插入具四個半胱胺酸序列之DNA 片段。
二、測試活體標記中染劑FlAsH- EDT2等溶液對活體細胞毒性
為了確定活體標記的步驟及使用溶液不會傷害細胞，我們先以下列幾組溶
液與細胞37℃作用一小時，包括 1) 0.125μM FlAsH- EDT2染劑溶於10μM EDT
1g/l 葡萄糖 1 倍 HBSS 中，2)10μM EDT 1g/l 葡萄糖 1 倍 HBSS 溶液， 3) 1g/l 葡萄糖 1 倍 HBSS 溶液，4)0.01%酒精 1g/l 葡萄糖 1 倍 HBSS 溶液
（EDT 分子溶於酒精中，最後染劑中酒精濃度約為 0.01%），再以 250μM EDT
察細胞形態是否受影響，以確保染色步驟不會對活細胞有影響。結果顯示細胞 形態都沒有受到影響，表示這些溶液不會對細胞造成傷害。
三、染劑FlAsH- EDT2進行活體細胞標記之適合濃度測試
為了選出染劑FlAsH- EDT2最適合的濃度，我們先測試0.125μM FlAsH-
EDT2及 0. 5μM FlAsH- EDT2對細胞進行染色，在螢光顯微鏡下觀察細胞非特
異性結合的情形。如圖五Hep3B 的結果顯示，0. 5μM FlAsH- EDT2產生的非
特異性背景太強，0.125μM FlAsH- EDT2的背景較能接受，其他兩種細胞結果 相同，故之後實驗將會使用0.125μM FlAsH- EDT2來進行肝癌細胞株活體標記 試驗。 肆、抗第八因子單株抗體製備
一、
小鼠免疫 利用高純度的重組第八因子蛋白進行6 週大、純品系的 BALB/ c 小鼠免 疫，不會有之前文獻所提，利用部份純化的第八因子免疫動物所遇到的困難 （29），也可避免血漿第八因子製劑內含大量白蛋白，造成小鼠有強烈的抗白蛋 白等反應。經五次免疫後，將依序採得眼角血，以ELISA 檢測血清中抗體效價； 並選取其中一隻在第五次免疫後，血清稀釋105倍下仍具高效價小鼠進行細胞 融合。二、
細胞融合及單株抗體的製備 取出免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞NS-1 以 2:1 的比例混合，加入 PEG4000 進行細胞融合，並將融合瘤細胞分至 12 盤 96 孔微量盤中，進行一週 的HAT 培養基篩選，然後收集培養液，以 ELISA 篩選分泌第八因子抗體的細 胞聚落，結果有四個融合瘤細胞聚落呈陽性反應。接著再進行這四個融合瘤細 胞聚落之限數稀釋，把每株融合瘤細胞聚落以每孔10 個細胞及每孔 1 個細胞分 別分到96 孔微量盤中，再收集培養液，以 ELISA 篩選，並挑選其中陽性反應 較強的八個細胞聚落再進行限數稀釋，以得到單株化細胞株。 伍、突變重組第八因子蛋白之表達一、突變第八因子cDNA 之序列分析 對這些突變第八因子進行DNA 定序分析，來確定該突變點正確且該區段 其他序列亦未改變。附件六為突變1789（位在 A3 結構功能區）之定序結果， 分析了核苷酸5076 至 6719，確定突變點 1789 在核苷酸 5572 上由 C 變成 T， 所轉譯之胺基酸亦由異白胺酸（Isoleucine）轉變為苯丙胺酸（Phenylalanine）， 而該區段其他序列並未改變。 二、突變重組第八因子表達質體之構築 之前本實驗室已收集多個臨床表型嚴重度不同之A 型血友病患，並選擇其 中六個突變點，包含突變146、386（位在 A1 結構功能區），突變 1689、1942、 1823 及 1789（位在 A3 結構功能區），進行第八因子 cDNA 定點突變（表二）。 本人接續將上述突變第八因子cDNA 片段，以適當的限制脢接入質體 pYLI-fVIII 中，與正常的第八因子cDNA 進行置換。為了在肝細胞株中表達及進行活體標
記，進一步將含有突變的DNA 片段由 pYLI-fVIII (mutant)質體上以適當的限制
脢切出，於pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII -CTCD 質體上進行置換動作。目前六個
突變之表達質體均構築完成，連接點及以及突變點附近之DNA 定序也已完成，
確認無誤。之後將表達於肝癌細胞株內，合成突變的重組第八因子蛋白，進行 活體細胞標記等工作，比較與正常第八因子蛋白在肝細胞內生合成等過程之異 同，來探討各突變所造成的影響。
計畫成果自評 本研究至目前已完成所有載體之建構，並以DNA 定序確認之。為能於肝 細胞株中表達重組第八因子蛋白，亦針對各肝癌細胞株建立效率最好之轉感步 驟，故未來可在最符合人體內的模式下，對重組第八因子蛋白之生合成過程及 產量進行分析，來克服目前在重組第八因子蛋白上之重大難題。 此外，有鑑於以往以活體外培養哺乳動物細胞株表達全長重組第八因子蛋
白產量偏低的問題，本實驗室亦參照hydrodynamics- based transfection 的方式，
建立小鼠活體內重組第八因子蛋白表達系統。目前系統相關條件和分析方式均 以建立完成，且初步分析，該系統表達量最高可達正常人體內濃度的5.8 %，較 以往實驗室以傳統活體外培養哺乳動物細胞株產量多500 倍以上，如此高產量 對日後在第八因子相關研究分析上將更具優勢。 而本實驗嘗試建立第八因子活體標記步驟，進而改善傳統以抗原抗體螢光 染色標定法所遇到的重重困難。目前已初步測試活體標定染劑FlAsH- EDT2最 適宜濃度及相關染色步驟，並已成功建構於第八因子蛋白 C 端加上具四個半胱 胺酸胜肽序列之表達質體，以供活體標記使用。未來可利用此一標記方式，對 重組第八因子在活體細胞內之生合成、運轉及降解過程進行分析，該標記法還 能以電顯觀察及具有 pulse-labeling 的特性，可得到較抗原抗體螢光染色更高解 析度之觀察結果，且可追蹤正常生理情形下的變化。 為使日後研究工具更為多樣性且便利，也有鑑於目前市面上所提供之第八 因子單株抗體，昂貴且用途不廣。本實驗室也利用高純度的重組第八因子蛋白 進行抗第八因子單株抗體之製備。目前已挑選出八個陽性反應較強的細胞聚落 進行第二次限數稀釋，最後所得到的單株化細胞株大量製備後，可用於篩選病 人突變的第八因子、純化第八因子、以及研究第八因子細胞內的代謝（包括正 常及突變）。 除了正常的第八因子外，本實驗亦收集臨床表型嚴重度不同之A 型血友病
患之基因突變，合成具點突變之重組第八因子蛋白。目前已完成所有的表達載
體，未來更可結合染劑FlAsH- EDT2進行活體細胞標記法，同時在活體外及活
體內表達系統中，針對第八因子在肝細胞內之生合成、運轉及降解過程及分佈 情形進行比較，探討各突變造成的影響以及各結構功能區可能具有之角色，以 利於日後開發具更高效能、更具經濟效益之治療性重組第八因子蛋白。
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圖一、質體pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII 結構簡圖。載體上同時具有脂蛋白原 A
加強子（ApoE-HCR）、肝細胞專一性啟動子（hAAT promoter）、第九因子intron
I（hFIX intron A）及 3'端 untranslated 區域（3'-UTR）及 polyadenylation signal （bghpA）。
time after inj. (hr) 0 24 48 72 96 1 rF VII I conc. ( ng/ m l) 0 2 4 6 8 10 圖二、進行hydrodynamics 尾巴靜脈注射 100μg 質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII DNA 後的 24、48、72、96 小時，老鼠血漿中人類重組第八因子蛋白含量之平 均值與標準差。
inj. DNA conc (ug/ 2 ml PBS/ mouse) 0 0 0 0 0 0 rF VIII co nc (n g/ m l) 0 2 4 6 8 10 圖三、老鼠分別施打100、150、200、300μg 質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII DNA 24 小時後，周邊血中人類重組第八因子蛋白含量之平均值與標準差。
inj. DNA conc. (ug/ 2 ml PBS/ mouse) 0 1 2 3 4 5 rfVI II (ng/ m l) 0 1 2 3 4 5 6 7 圖四、老鼠分別施打100、150、200、300μg 質體 pBS-HCRHPI-A-SMS-fVIII DNA 48 小時後，周邊血中人類重組第八因子蛋白含量之平均值與標準差。
圖五：染劑
FlAsH- EDT
2進行
Hep3B 活體細胞標記之適合濃度測試。圖
Ａ, B 和 C, D 分別為 0. 5μM FlAsH- EDT
2及
0.125μM FlAsH- EDT
2細胞
+染色結果。其中圖 A, C 為 200 倍視野可見光下觀察結果，而圖 B, D,為
相同視野螢光下觀察結果。
表一： Hep3B、 HepG2 及 Huh7 lipofection 轉感法之最佳條件測試。質體 pEGFP-C3 DNA 與 10μl lipofectamine，依不同比 例進行lipofection 轉感，48 小時後 200 倍視野下表達綠螢光蛋白細胞顆數。 200 倍視野下表達綠螢光蛋白細胞平均顆數 質體DNA 與 lipofectamine 比例 載體DNA PEGFP-C3 μg Lipofectamine
μl Hep3B HepG2 Huh7
1: 0.5 20 10 31.5 10 26
1: 1.5 6.67 10 49 26.5 38.75
1: 2.5 4 10 33.5 22.5 43.75
1: 3.5 2.86 10 23.5 15.25 62.3
表二：已進行定點突變及表達質體構築之突變第八因子。 臨床表型嚴重度 突變情況 構築質體使用限制脢在第八因子cDNA 上位置 病人血液第八 因子蛋白濃度 (ng/ml) 病人血液第 八因子蛋白 活性(%) 胺基酸位置 所位結 構玏能 區 核苷酸突變 胺基酸突 變 質體pYLI-fVIII(mutant) 質體pBS-HCRHPI-A-SM S- fVIII -CTCD(mutant) 輕型 6.253 7.2 1789 A3 CTT→TTT Leu→Phe BstEII (核苷酸 5076) SwaI (核苷酸 6719) Eco47III (核苷酸 1980) SwaI(核苷酸 6719)
中度形 2.79 4.6 1823 A3 ATG→ATA Met→Ile BstEII (核苷酸
5076) SwaI (核苷酸 6719)
Eco47III (核苷酸 1980) SwaI(核苷酸 6719)
0.944 <1 146 A1 CCA→TCA Pro→Ser SmaI(核苷酸 596)
KpnI(核苷酸 1965) MluI(核苷酸 151 前) Eco47III(核苷酸 1980)
0.6 <1 386 A1 ATT→AGT Ile →Ser SmaI(核苷酸 596)
KpnI(核苷酸 1965) MluI(核苷酸 151 前) Eco47III(核苷酸 1980) 4.61 <1 1689 A3 CGC→CGT Arg→Cys BstEII (核苷酸 5076) SwaI (核苷酸 6719) Eco47III (核苷酸 1980) SwaI(核苷酸 6719) 嚴重形
0 <1 1942 A3 TGG→TAG Trp→stop BstEII (核苷酸
5076) SwaI (核苷酸 6719)
Eco47III (核苷酸 1980) SwaI(核苷酸 6719)
