國立交通大學
生化工程所
碩士論文
人 類
securin 蛋 白 質 ：
一 個 無 特 定 三 級 結 構 的 蛋 白 質
Human securin：
a structurally disordered protein
研 究 生 ： 吳 昌 祐
指 導 教 授 ： 張 家 靖 教 授
人 類 s e c u r i n 蛋 白 質 ： 一 個 無 特 定 三 級 結 構 的 蛋 白 質
學 生 ： 吳 昌 祐 指 導 教 授 ： 張 家 靖
國 立 交 通 大 學 生 化 工 程 研 究 所 碩 士 班
摘 要
人 類securin蛋 白 質 是 一 個 最 近 為 人 所 發 現 的 致 癌 基 因 (oncogene)，它 是 由 腦 下 垂 體 腫 瘤 轉 型 基 因 (pituitary tumor transforming gene) 經 轉 錄 、 轉 譯 而 來 。 而 它 在 許 多 的 癌 症 細 胞 中 都 有 其 高 量 的 表 現 ， 亦 即 當securin於 細 胞 中 大 量 表 現 時 會 促 使 細 胞 的 癌 化。但 是 對 於 他 造 成 細 胞 癌 化 的 分 子 機 制 至 今 仍 不 清 楚 。 目 前 僅 知 其 在 細 胞 分 裂 的anaphase 中 扮 演 調 控 者 的 角 色 。 其 調 控 細 胞 分 裂 的 方 式 是 藉 由 和saparase 結 合 ， 以 抑 制 saparase 之 活 性 。 除 此 之 外 ， 近 來 許 多 的 研 究 也 發 現 ，securin與 DNA修 補 和 細 胞 凋 亡 有 關 。 因 為 陸 續 的 研 究 發 現 到securin是 一 個 具 有 多 重 功 能 的 蛋 白 質 ， 開 始 有 學 者 認 為 它 可 能 是 一 個 沒 有 結 構 的 蛋 白 質。因 為 其 可 透 過 結 構 的 多 變 性 可 以 與 許 多 不 同 的 受 質 結 合 而 扮 演 不 同 之 角 色。為 了 瞭 解securin的 結 構 與 功 能 的 關 聯 性 ， 我 們 由 基 因 轉 殖 的 技 術 將securin的 基 因 轉 殖 到 E. coli中 ， 大 量 表 現 基 因 重 組 之 人 類securin蛋 白 質。並 透 過 階 段 性 溶 液 置 換 準 靜 態 過 程 (quasi-static thermal equilibrium dialysis) 將 其 重 新 摺 疊 到 其 自 然 狀 態 。 我 們 利 用 圓 二 色 光 譜 儀 (CD) 及 微 溫 差 掃 描 熱 卡 路 里 計 (DSC) 之 分 析 ， 發 現 重 新 摺 疊 的 中 間 物 及 自 然 狀 態 ， 並 無 特 定 的 二 級 結 構 ， 且 其 本 身 的 三 級 結 構 不 穩 定 。 此 外 ， 我 們 透 過far western 分 析 發 現 securin 會 和 p53 直 接 鍵 結。而 這 樣 交 互 作 用 可 能 會 在securin大 量 表 現 時 影 響 p53在 細 胞 中 的 活 性。
H u m a n s e c u r i n ： a s t r u c t u r a l l y d i s o r d e r e d p ro t e i n
Student： Cang-Yiu Wu Adviser： Dr. Chia-Ching Chang Institute of Biochemical Engineering
National Chiao Tung University
A b s t r a c t
Human securin is an oncongene which has been identified in 1997. It is a pituitary tumor transforming gene encoded protein and serves as a biomarker in several cancer cell. Namely, when securin overexpress in cell, it leads to carcinogenesis. However, its molecular mechanism of carcinogenesis remains unclear. Recently studies indicated that securin is an anaphase inhibitor which prevents premature chromosome separation by blocking the activity of separase. Meanwhile, securin may also regulate cell cycle progression, DNA repair and apoptosis. Due to its multifunctional roles, securin has been proposed as a disordered protein. In order to reveal its structure function relationship, we have cloned human securin gene from small cell lung cancer cDNA library and expressed recombinant securin in E. coli, and it has been refolded its native state. Combining both circular dichroism (CD) spectra and differential scanning calorimetery (DSC) analysis indicated that securin is a structural disordered protein. Furthermore, we found that securin binds to p53 directly by Far-western analysis. This interaction indicates that securin may regulate the function of p53.
誌 謝
轉 眼 間 二 年 的 時 間 就 這 樣 過 去 了 ！ 當 初 ， 為 了 想 換 一 個 跟 大 學 不 一 樣 的 環 境 而 到 了 新 竹 來 唸 書 ， 從 一 開 始 的 不 適 應 新 環 境 ， 到 後 來 做 不 完 的 實 驗 ， 最 後 則 是 昏 天 黑 地 的 趕 論 文 ， 雖 說 整 個 過 程 都 是 非 常 忙 碌 的 ， 不 過 我 很 慶 幸 我 過 得 很 充 實 且 愉 快 。 在 這 兩 年 的 碩 士 班 日 子 裡 ， 不 敢 說 學 到 的 東 西 我 都 扎 扎 實 實 地 非 常 瞭 解 ， 但 我 真 的 學 到 不 少 的 東 西 ， 且 我 知 道 自 己 比 以 前 進 步 了 ， 且 對 於 研 究 有 更 深 一 層 的 認 識 ， 而 這 都 要 感 謝 我 的 指 導 教 授 張 家 靖 老 師 。 這 兩 年 一 路 跟 著 老 師 從 實 驗 室 的 建 立 、 實 驗 的 操 作 及 討 論 到 參 加 研 討 會 及 最 後 撰 寫 論 文 ， 老 師 都 不 斷 的 給 予 我 不 同 的 看 法 、 想 法 及 鼓 勵 ， 不 但 讓 我 對 於 自 己 的 實 驗 及 研 究 更 有 信 心 ， 也 使 我 對 自 己 更 有 自 信 ， 很 慶 幸 自 己 能 在 老 師 的 實 驗 室 當 研 究 生 。 感 謝 老 師 您 的 指 導 ！ 這 裡 也 要 對 在 實 驗 上 幫 助 我 最 大 的 學 亮 及 姿 亘 至 上 敬 意，因 為 有 你 們 的 幫 忙 才 能 讓 我 順 利 度 過 實 驗 上 的 難 關 ， 真 的 很 感 謝 你 們 ！ 此 外 ， 也 非 常 的 感 謝 亦 良 學 長 在 我 最 後 準 備 寫 作 論 文 、 趕 實 驗 數 據 及 準 備 口 試 的 時 候 ， 給 予 幫 忙 及 指 導 ， 讓 我 能 夠 順 利 完 成 論 文 。 而 對 於 提 供 許 多 在 物 理 觀 念 上 的 解 惑 及 碩 士 班 過 來 人 經 驗 的 健 彰 學 長，特 別 感 激 你 ！ 還 有 常 在 我 不 順 心 時 給 我 鼓 勵 的 美 儀 ， 謝 謝 妳 讓 我 能 夠 迅 速 從 不 順 心 的 情 緒 中 恢 復 。 張 簡 及 寶 明 學 長 ， 也 非 常 謝 謝 你 們 時 常 給 予 我 許 多 實 驗 及 研 究 上 的 建 議 。 至 於 奕 辰 學 長 ， 雖 然 你 常 給 我 捅 婁 子 ， 但 還 是 要 感 謝 你 常 在 我 實 驗 忙 不 過 來 時 給 予 協 助 。 這 邊 我 也 要 跟 師 母 及 實 驗 室 的 佩 欣 、 芳 馨 、 碩 士 班 的 學 弟 妹 、 大 學 部 的 學 弟 說 聲 感 謝 ， 感 謝 你 們 在 我 碩 士 班 的 兩 年 裡 在 實 驗 上 給 予 的 協 助 ， 及 生 活 上 的 關 心 和 問 候 。 最 後 要 謝 謝 我 的 家 人 ， 我 父 親 跟 母 親 。 感 謝 你 們 對 我 的 支 持 ， 讓 我 能 夠 順 利 並 沒 有 後 顧 之 憂 地 完 成 我 碩 士 的 學 位。而 這 兩 年 碩 士 班 的 訓 練 讓 我 更 獨 立 自 主 ， 也 希 望 你 們 能 夠 放 心 。 謝 謝 大 家 二 年 來 的 照 顧 和 支 持 ， 謝 謝 大 家 。 昌 祐 ． 2007． 7月目 錄
摘 要 ... I Abstract ... II 誌 謝 ... III 目 錄 ... IV 圖 目 錄 ... VI 縮 寫 表 ... VIII 第 一 章 、 序 論 ... 1 1-1 研 究 動 機 ： ... 1 1-2 蛋 白 質 摺 疊 簡 介 ... 1 1-2-1 蛋 白 質 復 性 ... 2 1-2-2 復 性 方 法 ... 2 1-3 人 類 securin蛋 白 質 簡 介 ... 3 1-3-1 細 胞 週 期 與 癌 症 ... 3 1-3-2 細 胞 週 期 調 控 ... 4 1-3-3 人 類 securin的 發 現 ... 71-3-4 人 類 securin基 因 家 族 (Human securin gene family) ... 7
1-3-5、 Securin功 能 ... 7
1-3-6、 Securin與 tumar suppressor p53 之 間 的 關 係 ... 10
1-3-7、 Securin結 構 ... 13 1-3-8 無 特 定 構 形 蛋 白 質 (Disordered protein) ... 14 第 二 章 、 實 驗 原 理 ... 19 2-1 蛋 白 質 securin的 製 備 ... 19 2-2 蛋 白 質 摺 疊 ... 19 2-3 圓 二 色 旋 光 光 譜 儀 (Circular Dichroism: CD) ... 21 2-4 螢 光 光 譜 (Fluorescence Spectroscopy) ... 22
2-5 微 溫 差 掃 描 熱 卡 路 里 計 (Differential Scanning Calorimetry: DSC) ... 22
3-1 Securin基 因 之 選 殖 ... 24
3-2 Securin蛋 白 質 的 重 新 摺 疊 ... 26
3-3 圓 二 色 旋 光 光 譜 儀 (CD) ... 27
3-4 動 態 光 散 射 儀 (Dynamics light scattering: DLS) ... 27
3-5 微 溫 差 掃 描 熱 卡 路 里 計 (Differential Scanning Calorimetry : DSC) .. 28
3-6 Far Western ... 28 第 四 章 、 實 驗 結 果 ... 29 4-1 Securin基 因 鑑 定 ... 29 4-2 Securin電 泳 膠 片 之 分 析 結 果 ... 33 4-3 Western blotting 分 析 結 果 ... 35 4-4 Securin蛋 白 質 的 二 級 結 構 分 析 ... 37 4-5 螢 光 光 譜 分 析 蛋 白 質 疏 水 性 核 心 之 形 成 ... 40 4-6 以 DLS分 析 securin摺 疊 中 間 體 粒 徑 大 小 的 分 布 ... 42 4-7 Securin摺 疊 中 間 物 的 熱 穩 定 性 ... 47 4-8 Securin蛋 白 質 透 過 DisEMBL程 式 分 析 無 特 定 結 構 的 情 形 ... 51
4-9 Far western blotting分 析 結 果 ... 54
第 五 章 、 討 論 ... 56
5-1 Securin基 因 與 蛋 白 質 序 列 分 析 ... 56
5-2 Securin電 泳 膠 片 與 western blotting Securin電 泳 膠 片 之 分 析 ... 56
5-3 Securin摺 疊 過 程 中 ， 摺 疊 中 間 體 與 自 然 狀 態 之 結 構 與 熱 穩 定 性 變 化 ， 及 無 特 定 結 構 蛋 白 質 程 式 分 析 結 果 。 ... 56 (1) Securin摺 疊 ... 56 (2) 摺 疊 中 間 體 與 自 然 狀 態 之 結 構 與 熱 穩 定 性 變 化 ... 57 (3) 無 特 定 結 構 蛋 白 質 程 式 分 析 結 果 ... 58 5-3 Securin與 p53 之 間 的 關 聯 ... 58 參 考 文 獻 ... 61 附 錄 ... 69 圖 1: 質 體 pET200 securin架 構 圖 。 ... 69 Table 1: 蛋 白 質 復 性 緩 衝 液 配 方 。 ... 70 Table 2: Hpttg家 族 蛋 白 質 序 列 比 對 3 8。 ... 71
圖 目 錄
圖 1- 1、 有 絲 分 裂 中 各 個 時 期 模 式 圖 ... 4 圖 1- 2、 細 胞 週 期 調 控 圖 ... 6 圖 1- 3、 AN A P H A S E P R O M O T I N G C O M P L E X 與S E C U R I N的 作 用 關 係 圖 。 ... 8 圖 1- 4、 KU P R O T E I N C O M P L E X修 復 雙 股 斷 裂DNA示 意 圖 ... 9 圖 1- 5、A P O P T O S I S示 意 圖 。 ... 12 圖 1- 6 、S E C U R I N序 列 圖 。 ... 14 圖 1- 7、 4EBPS與EIF4E結 合 誘 導Α-H E L I X形 成 示 意 圖 8 3。 ... 16 圖 4- 1、PET200 S E C U R I N質 體PCR鑑 定 結 果 圖 。 ... 30 圖 4- 2、 S E C U R I N基 因DNA定 序 圖 ... 31 圖 4- 3、S E C U R I N基 因 定 序 比 對 結 果 。 ... 32 圖 4- 4、 SE C U R I N SDS-PAGE分 析 ... 34 圖 4- 5、破 菌 上 清 液 及 內 涵 體 SDS-PAGE與 WE S T E R N B L O T T I N G分 析 結 果 。 ... 36 圖 4- 6、 蛋 白 質S E C U R I N各 摺 疊 中 間 體 的CD圖 譜 。 ... 38 圖 4- 7、 蛋 白 質S E C U R I N各 摺 疊 中 間 體 之 二 級 結 構 分 布 分 析 表 。 ... 38 圖 4- 8、 蛋 白 質S E C U R I N各 摺 疊 中 間 體 及 自 然 態 之 二 級 結 構 分 布 比 例 。 39 圖 4- 9、S E C U R I N摺 疊 中 間 物 螢 光 圖 譜 。 ... 41 圖 4- 10、 蛋 白 質 螢 光 光 譜 位 移 分 析 。 ... 41 圖 4- 11、 動 態 光 散 射 儀 量 測 未 摺 疊 蛋 白 質S E C U R I N的 粒 子 大 小 分 布 圖 。 4 - 12、 動 態 光 散 射 儀 量 測 蛋 白 質S E C U R I N摺 疊 中 間 體M1 的 粒 子 大 小 。 3 圖 4 圖 4 圖 4 圖 4 圖 4 圖 4 ... 43 - 13、 動 態 光 散 射 儀 量 測 蛋 白 質S E C U R I N摺 疊 中 間 體M2 的 粒 子 大 小 。 ... 44 - 14、 動 態 光 散 射 儀 量 測 蛋 白 質S E C U R I N摺 疊 中 間 體M3 的 粒 子 大 小 。 ... 44 - 15、 動 態 光 散 射 儀 量 測 蛋 白 質S E C U R I N摺 疊 中 間 體M4 的 粒 子 大 小 。 ... 45 - 16、 動 態 光 散 射 儀 量 測 蛋 白 質S E C U R I N摺 疊 中 間 體M5 的 粒 子 大 小 。 ... 45 - 17、 動 態 光 散 射 儀 量 測 蛋 白 質S E C U R I N各 個 摺 疊 中 間 體 的 粒 子 大 小分 布 圖 。... 4 4- 18、 LY S O Z Y M E利 用DSC測 定 其 結 構 熱 穩 定 性 。 ... 48 6 圖 圖 4- 19、 SE C U R I N蛋 白 質 在M1時 的 熱 穩 定 性 。 ... 48 圖 4- 20、 SE C U R I N蛋 白 質 在M2時 的 熱 穩 定 性 。 ... 49 圖 4- 21、 SE C U R I N蛋 白 質 在M3時 的 熱 穩 定 性 。 ... 49 圖 4- 22、 SE C U R I N蛋 白 質 在M4時 的 熱 穩 定 性 。 ... 50 圖 4- 23、 SE C U R I N蛋 白 質 在M5時 的 熱 穩 定 性 。 ... 50 圖 4- 24、 DI SEMBL分 析 結 果 圖 。 ... 52 圖 4- 25、 DI SEMBL各 部 分 分 析 序 列 圖 。 ... 53 圖 4- 26、 FA R W E S T E R N結 果 圖 ... 55 圖 4- 27、 FA R W E S T E R N 結 果 圖 ... 55 圖 5- 1、S E C U R I N影 響P53 功 能 示 意 圖 2 1 , 5 1 , 5 6 , 5 7。 ... 59
縮 寫 表
以 英 文 字 母 順 序 排 列Apaf-1 A poptosis a ctivating f actor- 1 細 胞 凋 亡 活 化 因 子-1
APC A naphase p romoting c omplex 細 胞 核 分 裂 後 期 促 進 錯 合 體
CD C ircular d ichroism 圓 二 色 光 譜 儀
CDK C yclin d ependent k inase 細 胞 週 期 素 依 賴 激 酶
CKI C yclin dependent k inase i nhibitor 細 胞 週 期 素 依 賴 激 酶 抑 制 物
D box D estruction b ox 降 解 序 列
DED D eath e ffector d omain 死 亡 受 動 器 區 域 DLS D ynamic l ight s cattering 動 態 光 散 射 儀
DSC D ifferential s canning c alorimetry 微 溫 差 掃 描 熱 卡 路 里 計 DSSP D efinition of s econdary s tructure
of p roteins 蛋 白 質 二 級 結 構 預 測 資 料 庫
eIF4G E ukaryotic i nitiation f actor 4G 真 核 生 物 轉 錄 活 化 因 子-4G HRP H orseradish p eroxidase 山 葵 過 氧 化 酶
IgG Immunoglobulin G 免 疫 球 蛋 白 G
IPTG I so p ropyl β- D
-1- t hio g alactopyranoside 異 丙 基-β-D-硫 . 代 半 乳 糖 苷 MAPK M itogen a ctivated p rotein k inase 增 生 因 子 活 化 型 激 脢
NCBI N ational c enter for b iotechnology
i nformation 美 國 國 家 生 物 技 術 資 訊 中 心
NMR N uclear m agnetic r esonance 核 磁 共 振 儀 PCR P olymerase c hain r eaction
PTTG
聚 合 酶 鏈 反 應 P ituitary t umor t ransforming
g ene 腦 下 垂 體 腫 瘤 轉 型 基 因
PVDF P oly v inylidene d i f luoride 尼 龍 轉 印 紙
RB R etino b lastoma tumor suppressor 視 網 膜 胚 細 胞 瘤 基 因
TRAIL
gene
T NF- r elated a poptosis i nducing l igand
子 相 關 細 胞 凋 亡 誘 導 受 質
第 一 章 、 序 論
1-1 研 究 動 機 ：
癌 症 是 人 類 最 為 關 切 的 疾 病 之 一 ， 但 是 癌 症 的 成 因 非 常 複 雜 不 易 全 盤 瞭 解 與 調 控 。 目 前 所 知 癌 症 的 成 因 ， 多 半 與 細 胞 本 身 細 胞 週 期 調 控 失 常 有 密 切 的 關 係 。 因 此 我 們 對cyclin相 關 基 因 與 其 調 控 極 感 興 趣 。 securin是 近 年 來 剛 為 人 所 發 現 之 蛋 白 質1， 人 類 的securin蛋 白 質 已 知 與 細 胞 週 期 調 控 有 關1， 亦 即 所 謂 的 致 癌 基 因 (oncogene）。 然 而 對 於 securin本 身 的 分 子 機 制 、 功 能 、 結 構 及 它 造 成 許 多 細 胞 癌 化 的 成 因 依 舊 是 不 清 楚 。 由 於 這 類 與 細 胞 週 期 有 關 之 蛋 白 質 在 細 胞 中 表 現 時 期 不 是 很 長2， 而 在 純 化 及 實 驗 分 析 上 有 其 困 難2， 因 此 本 實 驗 利 用 基 因 擴 增 法 選 殖 人 類securin的 基 因 後 ， 再 運 用 基 因 重 組 的 方 式 來 取 得securin蛋 白 質 ， 並 透 過 重 新 摺 疊 的 方 式 ， 來 了 解 其 自 然 體 結 構 與 摺 疊 過 程 中 蛋 白 質 結 構 之 變 化 ， 並 瞭 解 其 摺 疊 機 制 。 此 外 我 們 利 用far western blotting來 分 析 他 與 p53 之 間 是 否 存 在 直 接 的 連 結 。 因 為p53 是 一 個 與 細 胞 週 期 調 控 與 細 胞 凋 亡 有 關 的 蛋 白 質 ， 當 其 功 能 喪 失 的 時 候 ， 則 會 引 起 癌 症 的 發 生3， 加 上securin為 一 個 致 癌 基 因(oncogene）， 故 藉 由 far western blotting瞭 解 securin與 p53 之 間 是 否 存 在 直 接 的 鍵 結 ， 這 樣 的 鍵 結 可 能 會 影 響p53 的 作 用 ， 而 影 響 細 胞 週 期 的 表 現 或 是 造 成 細 胞 的 癌 化 。
1-2 蛋 白 質 摺 疊 簡 介
一 般 認 為 蛋 白 質 能 否 具 有 正 確 的 三 級 結 構，與 其 生 物 的 功 能 息 息 相 關 4 。 當 蛋 白 質 因 外 在 環 境 的 劇 烈 改 變 將 使 得 蛋 白 質 錯 誤 摺 疊 (misfold)， 進 而 使 彼 此 聚 集 (aggregation) 沉 澱 時 。 抑 或 當 蛋 白 質 內 穩 定 結 構 的 作 用 力 遭 到 完 全 破 壞 時 ， 蛋 白 質 將 形 成 變 性 結 構 (denature structure)， 最 後 導 致 其 喪 失 生 物 的 功 能 性 。 而 蛋 白 質 如 何 由 一 無 特 定 構 形 鬆 散 的 胺 基 酸 序 列 摺 疊 至 具 特 殊 構 形 的 過 程 ， 及 這 過 程 中 分 子 內 結 構 的 變 化 與 交 互 作 用 ， 是 科 學 家 們 努 力 想 探 討 的 部 分4。 而 在 本 實 驗 室 中 我 們 已 經 成 功 建 立 一 套 方 法 讓 蛋 白 質 能 摺 疊 至 正 常 的 結 構1 , 5 , 6 , 7 , 8。如 此 一 來 我 們 可 以 透 過 基 因 重 組 的 方 式 利 用 微 生 物 來 大 量 製 造 所 需 之 基 因 重 組 蛋 白 質 。 因 為 基 因 重 組 蛋 白 質 在 細 胞 內 大 量 表 現 的 時 候 ， 會 造 成 此 一 蛋 白 質 在 細 胞 內 形 成 不 具 活 性 的 內 涵 體 (inclusion body)。我 們 可 以 藉 由 將 此 一 喪 失 功 能 的 蛋 白 質 摺 疊 至 具 活性 的 正 常 結 構 下 ， 來 研 究 此 一 蛋 白 質 在 摺 疊 過 程 中 結 構 的 變 化 及 其 摺 疊 至 其 自 然 結 構 （native structure） 時 所 具 有 的 結 構 特 性 與 機 制 。
1-2-1 蛋 白 質 復 性
透 過 內 涵 體 這 樣 的 方 式 來 取 得 大 量 蛋 白 質 ， 有 一 重 要 的 就 是 它 是 由 大 量 蛋 白 質 聚 集 而 成 ， 且 蛋 白 質 因 結 構 變 性 而 不 具 活 性 ， 而 我 們 需 要 透 過 復 性 （renaturation） 的 方 式 將 其 變 成 具 有 活 性 的 蛋 白 質 。 所 謂 的 復 性 是 為 讓 蛋 白 質 從 未 摺 疊 或 是 錯 誤 摺 疊 的 情 況 下 恢 復 具 有 活 性 的 構 形4。 而 蛋 白 質 的 結 構 會 受 到 許 多 的 環 境 因 素 所 影 響 ， 包 括 溫 度9、pH值 、 離 子 強 度 1 0及 壓 力7等 。 所 以 當 我 們 將 蛋 白 質 溶 液 環 境 改 變 時 ， 蛋 白 質 會 為 了 要 因 應 新 的 環 境 而 改 變 其 構 形 ， 如 此 才 能 夠 達 到 新 的 平 衡 。 故 從 熱 力 學 觀 點 來 看 ， 當 蛋 白 質 處 在 於 含 有 高 濃 度 變 性 劑 的 環 境 中 ， 其 未 摺 疊 態 的 構 形 能 量 相 對 於 其 自 然 態 而 言 是 較 低 的 ， 而 我 們 將 變 性 劑 的 濃 度 逐 漸 降 低 甚 至 移 除 的 時 候 ， 蛋 白 質 分 子 內 將 形 成 鍵 結 。 當 蛋 白 質 分 子 內 形 成 一 些 鍵 結 的 時 候 ， 而 這 樣 的 鍵 結 會 造 成 蛋 白 質 態 的 轉 變 ， 態 的 轉 變 將 會 釋 放 出 能 量 來 使 蛋 白 質 達 到 最 低 構 形 能 量 態 ， 即 與 環 境 達 成 新 平 衡 。 最 後 蛋 白 質 復 性 產 生 具 有 活 性 的 結 構 時 ， 即 是 處 於 最 低 構 形 能 量 態 下1。1-2-2 復 性 方 法
在 實 驗 室 裡 常 用 的 摺 疊 方 法 包 括 有 ， 直 接 稀 釋 法1 1與 連 續 式 透 析 法1 2 來 進 行 復 性 。 其 目 的 都 是 藉 由 將 蛋 白 質 周 圍 環 境 的 變 性 劑 濃 度 降 低 或 是 移 除 ， 使 其 無 法 破 壞 蛋 白 質 結 構 。 以 下 就 兩 種 不 同 的 稀 釋 的 方 法 做 簡 單 之 介 紹 ： ( 1 ) 直 接 稀 釋 法 （ D i r e c t D i l u t i o n ）1 1 此 方 法 為 直 接 將 含 有 高 濃 度 變 性 劑 的 未 摺 疊 態 蛋 白 質 直 接 稀 釋 自 然 態 溶 液 中 。 復 性 機 制 如 前 面 所 述 ， 降 低 變 性 劑 濃 度 使 其 無 法 破 壞 穩 定 蛋 白 質 結 構 之 力 量，蛋 白 質 即 可 自 行 摺 疊。但 缺 點 就 是 蛋 白 質 的 濃 度 會 下 降 許 多， 而 造 成 後 續 的 實 驗 上 之 困 難 。 因 此 ， 以 稀 釋 法 復 性 需 提 高 復 性 溶 液 的 稀 釋 倍 數 ， 此 對 於 產 品 回 收 和 純 化 皆 不 適 宜 ， 且 因 高 濃 度 的 蛋 白 質 周 圍 環 境 經 過 劇 烈 的 變 化 將 會 形 成 錯 誤 摺 疊 與 聚 集 體 (aggresome)1 3。( 2 ) 準 靜 態 熱 平 衡 透 析 法 ( Q u a s i - s t a t i c t he r m al d y n a m i c s E q u i l i b r i u m D i a l y s i s ) 透 析 的 方 式 是 指 將 蛋 白 質 利 用 透 析 膜 的 特 性，將 溶 於 變 性 溶 液 的 蛋 白 質 放 置 在 透 析 膜 中 ， 然 後 於 膜 外 放 置 大 量 之 復 性 溶 液 ， 由 於 透 析 膜 本 身 的 特 性 （ 透 析 膜 是 有 許 多 孔 徑 相 當 小 的 材 質 ， 只 允 許 比 孔 徑 比 較 小 的 分 子 如 水 分 子 及 鹽 類 通 過 ）， 透 析 膜 內 外 鹽 類 濃 度 的 不 一 致 ， 會 造 成 滲 透 壓 的 差 異 ， 因 此 溶 液 內 離 子 藉 由 布 朗 運 動 而 自 由 移 動 ， 於 是 最 後 膜 外 與 膜 內 之 離 子 濃 度 將 會 相 同 並 且 達 到 平 衡 ， 而 達 到 使 變 性 劑 濃 度 降 低 之 目 的 。 而 本 實 驗 室 又 將 此 方 法 加 以 改 良 ， 利 用 準 靜 過 程 的 方 式 來 進 行 透 析 。 因 為 透 析 膜 內 的 溶 液 與 整 體 外 界 之 溶 液 交 換 擴 散 是 非 常 緩 慢 的 ， 加 上 本 實 驗 室 在 摺 疊 時 值 盡 量 縮 小 溶 液 的 初 始 狀 態 及 末 狀 態 的 差 異 ， 如 此 一 來 整 個 溶 液 的 置 換 過 程 會 變 的 非 常 緩 慢 。 而 透 過 這 樣 溶 液 置 換 方 式 ， 會 使 的 蛋 白 質 一 直 處 於 平 衡 狀 態 ， 對 於 蛋 白 質 來 說 這 樣 的 過 程 可 以 視 為 近 乎 靜 止 的 狀 態 ， 故 我 們 將 此 改 良 的 平 衡 透 析 法 稱 為 準 靜 態 熱 平 衡 透 析 法 (quasi-static thermal equilibrium dialysis)1 , 5 , 6 , 7 , 8。 透 過 階 段 性 溶 液 置 換 準 靜 過 程 的 方 式 我 們 可 以 獲 得 不 同 溶 液 置 換 階 段 的 中 間 體 ， 而 這 些 中 間 體 可 以 幫 助 我 們 瞭 解 蛋 白 質 摺 疊 過 程 中 結 構 的 變 化1 4。
1-3 人 類 securin 蛋 白 質 簡 介
1 - 3 - 1 細 胞 週 期 與 癌 症 癌 症 一 直 是 人 類 最 為 關 切 的 疾 病 之 一 ， 而 其 成 因 是 錯 綜 複 雜 的 ， 並 非 單 一 的 過 程1 5。 癌 症 簡 單 來 說 就 是 一 群 原 本 正 常 的 細 胞 ， 當 其 偏 離 他 原 本 正 常 生 長 的 限 制 ， 最 後 失 去 控 制 的 結 果1 6。 目 前 所 發 現 的 癌 症 成 因 ， 包 括 了 細 胞 生 長 調 控 因 子 之 突 變 造 成 細 胞 複 製 的 調 控 失 效 ， 或DNA修 補 分 子 失 去 其 功 能 等1 5。 因 此 一 旦 其 生 長 調 控 機 制 發 生 問 題 ， 會 讓 細 胞 可 以 不 斷 的 增 生 ， 並 且 一 直 複 製 出 許 多 分 化 不 良 的 細 胞 。 不 斷 的 不 規 則 生 長 ， 到 最 後 可 能 會 無 限 制 的 擴 展 而 去 侵 犯 其 他 的 組 織 ， 使 個 體 死 亡 。 如 同 前 面 所 提 到 的 ， 癌 症 的 發 生 與 細 胞 週 期 的 調 控 有 著 密 切 的 關 係 ， 因 此 我 們 可 由 瞭 解 細 胞 週 期 之 進 程 與 調 控 著 手，以 其 瞭 解 如 何 控 制 細 胞 分 裂 與 可 能 的 癌 化 機 制。1-3-2 細 胞 週 期 調 控
基 本 上 細 胞 週 期 可 以 分 成 兩 個 主 要 的 部 分 ， 分 別 是 間 期 (interphase) 及 分 裂 期(M phase)， 其 中 間 期 占 整 個 週 期 時 間 的 90%1 6。 在 間 期 中 可 分 成
G1 phase、 S phase及 G2 phase三 個 時 期 ， G1phase是 靜 止 期 ， 細 胞 不 作 用 ， S phase是 DNA合 成 期，G2 phase細 胞 繼 續 生 長，而 接 著 就 是 分 裂 期 的 進 行 。 M phase亦 分 成 數 個 時 期 ， 包 括 前 期 (prophase)、 中 期 (metaphase)、 後 期 (anaphase) 及 末 期 (telophase)。 在 有 絲 分 裂 （ mitosis） 前 期 ， 染 色 質 開 始 凝 聚 成 染 色 體 ， 且 核 仁 會 跟 著 消 失 ， 中 心 粒 往 細 胞 兩 端 移 動 ， 接 著 進 入 有 絲 分 裂 中 期 。 中 期 最 明 顯 的 辨 識 特 徵 就 是 紡 錘 絲 將 染 色 體 排 列 在 赤 道 板 中 央 。 後 期 成 對 的 染 色 體 從 中 節 分 開 並 受 紡 錘 絲 的 牽 引 向 細 胞 兩 端 移 動 。 在 有 絲 分 裂 末 期 ， 各 染 色 分 體 抵 達 細 胞 兩 極 ， 子 細 胞 形 成 新 的 核 膜 ， 染 色 體 漸 漸 散 開 恢 復 到 光 學 顯 微 鏡 不 可 見 之 狀 態 ， 最 後 紡 錘 絲 消 失 進 行 質 裂 ， 亦 即 細 胞 分 裂 成 兩 個2。 （ 圖 1-1） 圖 1- 1、 有 絲 分 裂 中 各 個 時 期 模 式 圖 因 為 細 胞 週 期 是 細 胞 生 命 活 動 的 基 本 過 程 ， 其 調 控 是 非 常 重 要 的 ， 目 前 已 發 現 的 與 細 胞 週 期 調 控 有 關 的 分 子 很 多，而 主 要 分 成 三 大 類：cyclin、 cyclin dependent kinase (CDK)、 cyclin dependent kinase inhibitor (CKI)。 其 中CDKs是 調 控 網 路 的 核 心 ， CDKs對 cyclins具 有 促 進 的 功 能1 7， 相 對 而 言 CKIs是 抑 制 cyclins的 功 能 ， 透 過 這 樣 的 促 進 及 抑 制 的 機 制 ， 共 同 構 成 了 細 胞 週 期 調 控 的 分 子 基 礎1 7。 以 下 分 別 舉 例 及 詳 述 數 個 重 要 的 調 控 分 子 及 其
在 細 胞 週 期 中 所 表 現 的 功 能 (圖 1-2)
( 1 ) C y c l i n d e p e n d e n t K i n a s e ( C D K ) :
如 前 面 所 提 的 ， 在 細 胞 週 期 的 研 究 中 ， 發 現CDK在 細 胞 週 期 的 調 控 上 是 非 常 重 要 的1 7。CDKs 在 整 個 細 胞 週 期 中 的 表 現 量 是 平 穩 的 ， 但 在 細 胞 週 期 進 行 時 ， 不 同 時 期 會 有 不 同 的cyclins表 現 ， 並 與 相 應 CDKs 結 合 並 被 活 化 。 而 活 化 的cyclin-CDK complex具 有 啟 動 DNA合 成 、 促 進 細 胞 週 期 運 行 等 重 要 功 能 。 基 本 上 ， 一 種CDK可 以 結 合 一 種 以 上 的 cyclins， 如 CDK2 可 以 與cyclin D、 cyclin E和 cyclin A結 合1 8;此 外 兩 種 CDK亦 可 與 同 一 cyclin 結 合,如 ,CDK1 和 CDK2 均 可 以 結 合 cyclin A。 其 中 CDK2 可 分 別 與 cyclin E、cyclin A和 cyclin D 結 合，而 此 類 結 合 之 complex則 分 別 在 G1/ S 期、S 期 和G2 期 發 揮 不 同 的 作 用 。 透 過 不 同 cyclin與 CDK的 結 合 ， 可 以 具 有 不 同 的 調 控 功 能 ， 像CDK2是 啟 動 DNA複 製 的 關 鍵 激 酶， 也 是 細 胞 週 期 進 入 G2 期 的 必 要 條 件 ， 這 種 不 同 功 能 之 差 異 性 取 決 於 與CDK2 結 合 的 cyclin 的 種 類
1 7。 近 期 研 究 指 出 ， 細 胞 由G1期 進 入 S期 需 要 cyclin E及 CDK2的 共 同 參 與 ,
當 細 胞 進 入S期 後 ,cyclin E降 解 ,CDK2轉 而 與 cyclin A結 合 ,推 進 細 胞 由 S期 越 過 檢 查 點 進 入G2期 1 6。
( 2 ) C y c l i n s
Cyclins顧 名 思 義 ， 其 在 細 胞 中 是 一 個 週 期 性 的 表 現 。 Cyclins藉 由 與 其 相 對 應 的CDK結 合 ， 調 控 細 胞 各 種 與 細 胞 週 期 有 關 因 子 的 表 現1 7。 哺 乳 動 物 的cyclin為 一 家 族 性 的 蛋 白 質 ， 主 要 有 cyclin A、 B、 C、 D 和 E等 ， 而 這 些 不 同 種 類 的cyclin分 子 在 序 列 上 都 有 一 些 相 似 的 序 列 ,如 cyclin box及 destruction box， 前 者 負 責 結 合 CDK,後 者 與 cyclin自 身 降 解 有 關1 8。 根 據 參 與 細 胞 週 期 進 程 的 時 期 不 同 ， 可 以 分 為 參 與G1期 和 M期 的 cyclin、 在 G1 期 和G1/ S 交 界 處 發 揮 作 用 的 cyclin、 G2/M 轉 換 和 細 胞 分 裂 活 動 有 關 的 cyclin。 以 下 就 不 同 時 期 的 cyclin作 介 紹1 6：
Cyclin D :Cyclin D 是 研 究 較 為 深 入 的 cyclin。 Cyclin D 是 開 啟 細 胞 週 期 的 起 始 因 子 。 通 常 處 於G0 期 的 細 胞 在 在 生 長 因 子 (growth factor) 和 生 長 因 子 受 體 (growth factor recptor) 的 作 用 下 ， 活 化 G蛋 白 及 mitogen activated protein kinase (MAPK) 等 訊 息 傳 遞 途 徑 使 cyclin D在 G1 早 期 表 達
增 加1 9，而cyclin D會 與 細 胞 中 存 在 的 CDK4 和 CDK6 結 合，通 過 cyclin D、 CDK 4/ CDK 6 通 路 調 控 細 胞 通 過 G1 期 檢 查 點 (checkpoint)1 9。
Cyclin E: 繼 Cyclin D之 後 為 cyclin E， Cyclin E表 達 始 於 G1 中 期 ， 表 現 量 於G1/ S 交 界 處 達 最 高 ， cyclin E 的 生 合 成 受 E2F 和 Myc 共 同 啟 動
2 0。 當Cyclin D 與 CDK 4/ CDK 6 結 合 後 ， 使 RB （ R etino b lastoma tumor
suppressor） 蛋 白 磷 酸 化 ， 釋 放 轉 錄 因 子 E2F ,誘 導 Cyclin E 和 CDK2 的 表 達 ， 讓 細 胞 越 過G1/ S檢 查 點 。 當 細 胞 進 入 S期 ， cyclin E的 表 現 量 急 劇 下 降
2 0。因 為Cyclin E 控 制 細 胞 進 入 S 期 與 否 ,常 被 視 為 S 期 的 標 記 物。其 中 p5
也 參 與 這 個 時 期 的 細 胞 週 期 調 控，而 其 中 也 牽 涉 另 一 個 蛋 白 質p21
3
Cyclin A: Cyclin A 主 要 表 現 於 S期 和 M期 ， 在 cyclin E2的 部 分 有 提 到 當 細 , 期 被 表 現 及 生 合 成 ， 與CDK1結 合 在 G2/ 2 1，因 當 細 胞 的DNA受 到 損 傷 時，會 引 發 p53 的 功 能 表 現。而 這 樣 的 表 現 會 促 使 p21 被 細 胞 大 量 產 生 ， 而 大 量 產 生 的p21 會 去 影 響 CDK2 與 Cyclin E的 結 合 ， 而 使 細 胞 週 期 的 進 行 停 止 ， 直 到 損 傷 修 復 之 後 才 繼 續 進 行 細 胞 週 期2 1。
胞 進 入S期 ， cyclin E的 表 現 量 急 劇 下 降 。 此 時 CDK 2會 和 cyclin A结 合 。 此 外Cyclin A家 族 有 cyclin A1 和 cyclin A2， Cyclin A2在 G1晚 期 出 現 可 分 別 與CDK 2和 CDK 1結 合 ， cyclin A2 在 S期 能 促 進 DNA合 成 ， 促 進 細 胞 越 過G2/M期 檢 查 點 ,進 入 M期2 2。
Cyclin B: Cyclin B在 S期 晚 期 和 G2 S促 進 細 胞 進 入 M期 ， 是 M 期 cyclin2 3。
圖 1- 2、 細 胞 週 期 調 控 圖
正 確
G (pituitary tumor transforming gene
produ mor n g e n e f a m i l y ) 因 家 族，而 這 家 族 man PTTG 1的 這 個 蛋 白 質 ， 現 在 其 主 要 的 功 能 已 經 被 與 否 和 癌 症 的 形 成 亦 密 切 的 關 係 2 4。而securin (又 稱 PTTG1) 這 個 蛋 白 質 ， 在 細 胞 分 裂 中 的 間 期 裡 同 源 染 色 體 分 離 的 調 控 中 扮 演 很 重 要 的 角 色 。 而 在 許 多 的 研 究 中 發 現 到 不 論 是securin基 因 的 knock out或 是 其 不 正 常 的 大 量 表 現 於 細 胞 中 ， 都 和 許 多 癌 症 的 形 成 有 關2 5。 因 此 重 要 性 也 越 來 越 被 重 視 ， 現 在 普 遍 都 認 定 他 是 一 個protooncogene。 以 下 就 針 對 securin作 介 紹 。
1-3-3 人 類 securin 的 發 現
Securin一 開 始 被 稱 為 PTT
ct)， 它 是 由 Pei and Melmed 等 人 在 1997年 從 老 鼠 的 pituitary tu GH4細 胞 中 找 到 並 分 離 出 來 的 ， 而 以 此 命 名2 5。 同 時 他 們 也 發 現 當PTTG在 裸 鼠 (nude mouse) 中 大 量 表 現 時 ， 會 造 成 腫 瘤 的 產 生6。 不 久 之 後 ， 人 類 的securin也 被 選 殖 出 來2 6 , 2 7， 在 許 多 的 癌 症 細 胞 基 因 表 現 所 做 的 研 究 中 也 發 現 ，securin有 大 量 表 現 的 情 況 ， 像 是 在 腦 下 垂 體 產 生 的 腫 瘤2 8， 白 血 病 的 病 人2 9 , 3 0， 還 有 睪 丸 癌2 9、 卵 巢 癌2 9、 乳 癌3 1、 直 腸 癌3 2、 腦 下 垂 體 腺 瘤 3 3及 甲 狀 腺 癌3 4 , 3 5的 病 人 檢 體 中 也 都 有 同 樣 的 情 形 ， 而securin在 這 些 賀 爾 蒙 分 泌 相 關 的 癌 症 中，其 大 量 表 現 還 與 其 侵 襲 性 (invasiveness)，即 癌 細 胞 轉 移 後 傷 害 其 他 細 胞 的 能 力 有 極 高 的 相 關 性3 6 , 3 7， 在Puri等 人 的 研 究 中 發 現 當securin大 量 表 現 時 會 刺 激 basic fibroblast growth factore的 表 現 及 分 泌 ， 而 使 得 細 胞 的 分 化 被 加 強 ， 造 成 了 癌 細 胞 的 轉 移2 9， 而 這 些 現 象 都 暗 示 著securin是 一 個 和 腫 瘤 形 成 有 關 的 重 要 指 標 。 1 - 3 - 4 人 類 s e c u r i n 基 因 家 族 ( H um a n s e c ur i 而 在2000年 Chen等 人 的 研 究 中，揭 露 了 人 類 PTTG是 一 基 至 少 包 含 了 三 種 同 源 基 因 ， 分 別 是PTTG 1、 PTTG 2及 PTTG 33 8， 其 中PTTG 1就 是 securin。 Securin、 PTTG 2和 PTTG 3它 們 的 胺 基 酸 序 列 有 將 近80％ 的 相 似 度 ， PTTG 2不 論 是 在 癌 症 細 胞 株 或 是 正 常 的 細 胞 中 都 有 表 現，而PTTG 3則 是 只 能 在 癌 症 細 胞 株 中 發 現。到 目 前 為 止，PTTG 2及 PTTG 3的 功 能 依 舊 不 是 非 常 的 清 楚 。 (序 列 比 對 圖 見 附 錄 table 3)
1-3-5、 Securin 功 能
至 於securin又 稱 作 hu 認 定 為 抑 制sister-chromatid的 分 離 ， 而 這 個 功 能 與 出 芽 酵 母 菌 中 pds 1 及 裂 殖 酵 母 菌 的cut 2基 因 有 相 同 的 功 能2 4。Securin抑 制 分 離 的 功 能 是 係 透 過 與 一 種 叫 做separase的 蛋 白 脢 結 合 而 表 現2 4， 而separase蛋 白 脢 主 要 作 用是 在metaphase至 anaphase的 過 渡 期 中 ， 將 sister-chromatid當 中 相 互 連 結 的 蛋 白 質cohesin分 解 ， 促 使 sister-chromatid的 分 離2 4。 一 旦securin與 其 作 結 合 會 抑 制sepearase的 活 性 ， 使 其 無 法 作 用2 4。 換 句 話 說securin可 以 作 為 一 種 細 胞 週 期 的 調 控 因 子 ， 而 在 細 胞 週 期 未 進 入anaphase時 ， securin會 一 直 與separase結 合 以 抑 制 其 活 性 ， 當 細 胞 週 期 要 進 入 anaphase時 ， 會 由 所 謂 的 anaphase promoting complex開 啟 細 胞 進 入 anaphase的 序 曲3 9， 此 複 合 蛋 白 會 活 化 許 多 蛋 白 質 來 促 使 細 胞 進 入anaphase， 當 中 包 括 saparase2 4。 而 其 活 化separase的 方 式 是 透 過 分 解 securin來 達 到，因 securin在 其 蛋 白 質 的 N端 具 有destruction box的 序 列 ， 而 anaphse promoting complex會 活 化 這 個 序 列 而 造 成securin的 分 解 ， 一 旦 securin被 分 解 後 seperase的 活 性 就 會 出 現 ， 造 成 sister chromatid的 分 離 ， 而 細 胞 週 期 也 跟 著 進 入 了 anaphase3 9。 （ 圖1-3）
Securin除 了 參 與 調 控 細 胞 分 裂 的 功 能 外 ， 它 也 參 與 了 細 胞 週 期 的 進 行2 4、
除 了 與seperase結 合 而 調 節 細 胞 分 裂 週 期 的 功 能 外 ， securin亦 會 影 響
DNA的 修 復4 0及 維 持chromosome的 穩 定4 1。 在2000年 Yu等 人 的 研 究 中 發 現 到securin mRNA及 蛋 白 質 的 表 現 是 隨 著 細 胞 所 處 的 時 期 有 所 增 減 的 ， 在G1/S的 時 候 表 現 較 小 ， 而 在 S時 期 表 現 量 逐 漸 提 高 ， 在 G2/M的 時 期 有 大 量 的 表 現 ， 而 這 樣 的 變 化 對 於 細 胞 週 期 的 進 程 是 有 影 響 的 ， 這 也 是 說 它 亦 是 一 個 細 胞 週 期 的 調 控 因 子4 2。 正 因 為securin和 同 源 染 色 體 的 分 離 有 關 ， 當 其 過 量 表 現 時 會 造 成 細 胞 分 裂 時 期 之 染 色 體 分 離 不 完 全 ， 而 出 現 anueloidiy的 狀 況 (分 裂 的 細 胞 中 有 不 正 常 的 染 色 體 數 目 或 是 染 色 體 片 段)4 3。 Securin
到DNA的 修 復4 0。 其 機 制 主 要 是 透 過securin與 Ku結 合 蛋 白 質 進 行 作
用。Ku蛋 白 質 是 由 Ku-70、Ku-80所 構 成 的，再 加 上 另 一 個 蛋 白 質 DNA-PKC 就 會 形 成DNA-PK4 4 , 4 5， 而 這 個 酵 素 與DNA雙 股 斷 裂 的 修 復 有 關 4 6 , 4 7 , 4 8。 而securin在 此 所 扮 演 的 角 色 則 是 穩 定 Ku， 使 其 並 不 具 有 活 性 ， 一 旦 DNA有 雙 股 斷 裂 的 情 況 產 生 時 ，securin就 會 離 開 Ku， 而 讓 Ku的 活 性 產 生 ， 而 進 行 DNA的 修 復4 6。 (圖 1-4)
1-3-6、 Securin 與 tumar suppressor p53 之 間 的 關 係
(1)細 胞 凋 亡 除 了 細 胞 週 期 調 控 與 癌 症 的 發 生 有 關 外 ， 另 外 如 果 還 有 一 種 細 胞 生 理 機 制 失 調 的 時 候 ， 同 樣 會 造 成 癌 症 的 發 生 ， 而 此 機 制 為 細 胞 凋 亡 (Apoptosis）1 6。Apoptosis是 一 種 正 常 的 細 胞 生 理 作 用，用 以 除 去 一 些 不 再 需 要 的 細 胞1 6， 此 一 作 用 指 的 是 程 序 性 細 胞 死 亡 。 基 本 上 就 是 一 種 細 胞 執 行 自 我 凋 亡 的 方 法 ， 主 要 是 藉 由 活 化 細 胞 自 身 的 酵 素 來 達 到 分 解 其DNA和 細 胞 質 內 蛋 白 質 的 作 用 ， 最 後 再 利 用macrophage行 使 吞 噬 的 功 能 ， 以 便 將 此 變 性 的 細 胞 加 以 消 化 分 解 。 因 此 在 許 多 組 織 的 生 理 過 程 中 細 胞 分 裂 或 細 胞 增 生 是 十 分 普 遍 發 生 的 。 通 常 細 胞 增 殖 和 細 胞 凋 亡 會 達 到 平 衡 ， 而 且 受 到 嚴 謹 地 調 控 以 保 證 器 官 和 組 織 的 完 整 性 。 然 而 當 這 樣 的 一 個 平 衡 被 打 破 的 時 候 ， 不 受 管 制 而 迅 速 增 殖 的 細 胞 就 有 可 能 會 轉 變 成 腫 瘤 。 就 如 一 開 始 所 提 到 的 ， 癌 症 的 成 因 非 常 複 雜 不 易 全 盤 瞭 解 與 調 控 的 ， 其 中 細 胞 凋 亡 相 關 基 因 的 改 變 亦 參 與 了 這 一 過 程。包 括 誘 導 凋 亡 基 因 如p53的 失 活 , 以 及 抑 制 凋 亡 基 因 如bcl 2等 的 過 度 表 達 ,是 癌 症 發 生 的 一 個 重 要 原 因1 6。以 下 就 針 對apotosis作 一 介 紹 ， 並 討 論 p53與 apotosis間 的 調 控 。 )4 9。 5 ( 2 ) A p o p t o s i s 的 作 用 機 制 目 前 已 知 道Apoptosis的 作 用 過 程 可 分 為 兩 個 階 段 ， 分 別 為 initiation phase及 execution phase， 其 中 initiation phase是 使 caspases等 酵 素 活 化 的 階 段 ， 而execution phase是 指 因 酵 素 的 作 用 以 致 細 胞 死 亡 的 階 段 (圖 1-5 在initiation phase中 ， 又 區 分 為 兩 種 路 徑 ， 分 別 是 extrinsic pathway and intrinsic Pathway：Extrinsic Pathway又 叫 做 Death Receptor-Initiated pathway ， 因 為 此 路 徑 主 要 是 將 細 胞 膜 表 面 所 存 在 的apoptotic signals的 受 器 (receptor) 活 化 ， 以 開 啟apatosis的 一 個 過 程 ， 而 這 些 受 器 又 分 為 數 種 ， 像 是 CD95/Fas 及TNF-related apoptosis inducing ligand ( TRAIL ) 等 0 , 5 1。當 這 些 受 器 接 受 某 些 特 殊 訊 息 時 ， 便 可 誘 使 其 位 於 細 胞 膜 內 的 特 殊 蛋 白 質 區 域 (稱 為 death domain) 活 化 ， 並 引 發 一 連 串 caspases的 活 化 反 應 ， 即 可 引 發 apoptosis。 而 這 些 受 器 包 括CD95/Fas5 0的 受 體，當Fas的 受 體 因 FasL的 關 係 形 成 是 三 聚 體
之 後， 細 胞 內 的Fas-associated death domain (FADD) 的 蛋 白 質 會 與 Fas上 的 death domains作 結 合 ， 此 時 FADD上 一 個 名 叫 death effector domain (DED) 的 部 分 ， 會 去 和pro-caspase 8 結 合 ， 當 其 與 pro-caspase 8 聚 集 在 一 起 後 ， 它 們 便 會 自 行 水 解 ， 形 成 活 化 態5 3。 活 化 後 的caspase 8 可 以 藉 由 一 連 串 的 水 解 來 促 進 其 他 的caspases活 化 (如 caspase 9)5 3， 從 而 執 行apoptosis的 指 令 。 另 外 一 個 受 體 為TNF-related apoptosis inducing ligand ( TRAIL )
receptor5 1，TRAIL 的 訊 息 傳 遞 路 徑 路 徑 和 FasL也 大 致 相 同，不 過 它 是 透 過 DR5 (death domain containing receptor) 這 個 受 器 來 取 代 ， 且 在 TRAIL 路 徑 中 也 沒 有FADD的 存 在 ， 簡 單 來 說 caspase可 以 直 接 與 DR 5 位 在 細 胞 膜 內 的 蛋 白 質 區 域 作 結 合 ， 進 而 促 使 細 胞apoptosis。
而Intrinsic Pathway又 叫 做 Mitochondrial pathway： 這 路 徑 是 主 要 是 經 由 粒 線 體 (mitochondria) 來 作 用 的 ， 透 過 增 加 粒 線 體 細 胞 膜 的 通 透 性 ， 使 得 存 在 於mitotchondria細 胞 質 中 的 apoptosis前 驅 物 質 被 釋 放 出 來 ， 而 這 一 個 過 程 不 需 要 透 過Extrinsic Pathway中 的 那 些 受 器 (receptor)。 其 主 要 的 作 用 機 制 在 於mitochondria的 膜 表 面 受 到 Bcl-2 蛋 白 質 的 活 化 之 後 ， 使 內 部 的 cytocrome C和 其 他 的 pro-apoptotic proteins被 釋 放 到 細 胞 質 中 ， 進 而 引 發 caspases的 活 化 或 apoptosome的 形 成5 4。而Bcl-2 family可 以 區 分 為 三 個 種 類 的 蛋 白 質4 9， 其 中 的bcl2 及 bcl-XL為 pro-survival蛋 白 質 ， 為 一 種 可 以 對 抗 apoptosis的 蛋 白 質 ， 而 另 外 的 蛋 白 質 為 pro-apoptotic蛋 白 質 如 Bad或 Bax則 是 促 進apoptosis， 因 其 結 構 上 與 bcl2 和 bcl-XL相 似 ， 故 可 以 影 響 其 原 本 抑 制apoptosis的 功 能5 5。最 後 是pro-apoptotic ‘BH3-only’ protein5 5。而
於apoptosis的 敏 感 度 取 決 於 pro- apoptotic及 pro-survival 蛋 白 質 之 間 的 平 衡 ， 如 果 細 胞 內 的pro-apoptotic proteins比 較 多 的 話 ， 這 個 細 胞 對 於 apoptosis就 會 有 比 較 高 的 敏 感 度 ， 反 之 亦 然 細 胞 對 e 4 9。 一 般 來 說 ，pro-appptoic蛋 白 質 存 在 於 細 胞 質 中 ， 用 以 感 知 細 胞 傷 害 或 壓 力 的 信 號 ， 一 旦 這 些 蛋 白 質 和 訊 號 分 子 結 合 後 ， 它 就 會 移 到 粒 腺 體 的 表 面 ， 和 原 本 就 存 在 於
mitotchindria表 面 的 pro-apoptotic proteins結 合，進 而 在 mitochondria的 表 面 穿 孔 (因 其 結 構 類 似 穿 孔 蛋 白 )，使 原 本 存 在 於 mitochondrial intermambran space的 cytocrome C和 其 他 的 pro-apoptotic proteins被 釋 放 到 細 胞 質 中 。 當 cytocrome C從 mitochondria中 滲 出 來 之 後 ， 便 會 和 細 胞 質 中 的 Apaf-1 (Apoptosis activating factor-1) 的 蛋 白 質 結 合，這 過 程 會 使 得 Apaf-1 的 結 構 發 生 改 變 ， 相 互 形 成 聚 合 體 ， 而 這 個 聚 合 體 便 是 所 謂 的apoptosome4 9。
apoptosome可 以 讓 procaspases 9 聚 集 在 一 起 並 活 化 之 ， 而 活 化 的 caspase 9 會 繼 續 活 化 下 游 的caspase 3、 caspase 6 及 caspase 7， 最 後 造 成 細 胞
apoptosis。
圖 1- 5、 apoptosis 示 意 圖 。 （ 3） p53 參 與 apoptosis
在extrinsic pathway中 ， p53會 去 影 響 Fas受 器 ， 主 要 的 方 式 是 透 過 誘 導 基 因 的 大 量 表 現 ， 也 因 為Fas基 因 的 大 量 表 現 ， 使 得 Fas相 對 來 說 亦 會 大 量 的 出 現 ， 對 於apoptotic的 過 程 會 是 一 個 促 進 的 效 果5 6。 而p53促 進 Fas基 因 的 表 現 是 利 用 其 蛋 白 質 上 的DNA結 合 區 域 和 Fas基 因 上 的 promoter作 結 合 ， 而 來 促 進 整 個 基 因 的 表 現5 7。 此 外 ，p53還 會 加 強 Fas蛋 白 質 從 高 基 氏 體 (Golgi) 中 傳 送 到 細 胞 膜 上 ， 提 高 Fas在 細 胞 膜 上 的 含 量5 7。 此 外 ， 同 樣 情 況 也 出 現 在DR5另 一 個 受 器 上，p53一 樣 會 去 影 響 DR5的 表 現5 1。 (圖 1-5)
的Bax表 現 量 提 高 ， 而 造 成 apoptosis5 8。 另 外 ， 還 有PUMA， 它 是 屬 於 pro-apoptotic ‘BH3-only’的 蛋 白 質 ， 他 同 樣 會 受 到 p53 的 影 響 而 大 量 表 現 5 9 。從 整 體 來 看，因 為 細 胞 受 到 外 在 因 子 的 影 響 而 有 所 損 傷 的 時 候 (如 DNA damage)， 會 造 成 p53 的 大 量 表 現 。 然 後 大 量 表 現 的 p53 亦 會 去 誘 導 一 些 apoptosis相 關 分 子 的 基 因 表 現 ， 讓 細 胞 趨 向 於 apoptosis的 路 徑 而 造 成 細 胞 的 凋 亡 。 ( 4 ) Se c u r i n 與 p 5 3 之 間 的 關 係 而 在2000年 Yu et al 等 人 也 發 現 當 securin大 量 表 現 的 時 後 會 抑 制 細 胞 凋 亡 的 情 況 發 生6 0， 而 這 樣 的 情 況 他 們 推 測 可 能 是 透 過 兩 種 方 式 ， 一 種 是 與p53直 接 有 關 的 調 控 ， 而 另 一 種 則 不 直 接 透 過 p53的 方 式6 0。 而securin與 p53之 間 的 作 用 關 係 到 目 前 為 止 仍 然 不 清 楚 。 早 在 2002年 Bernal6 1等 人 與 2003年 Zhou等 人 的 研 究 中 他 們 發 現 securin可 能 會 與 p53有 關 聯 ， 而 影 響 到 p53促 進 基 因 表 現 的 活 性6 2。 目 前 僅 瞭 解 大 量 表 現 的securin會 透 過 調 控 c-myc蛋 白 質 的 表 現 來 間 接 影 響 p53基 因 promoter的 活 性，進 而 影 響 p53的 表 現6 3 , 6 4。 而securin與 p53之 間 的 關 係，則 是 需 加 以 探 討，包 括 了 securin是 否 與p53之 間 有 直 接 的 相 互 結 合 ？ 而 這 樣 的 結 合 是 否 造 成 p53的 功 能 喪 失 ？ 等 問 題 尚 待 探 討6 5。
1-3-7、 Securin 結 構
雖 然 現 在 對 於securin的 作 用 的 分 子 機 制 、 其 他 功 能 、 結 構 及 它 造 成 許 多 癌 症 的 原 因 依 舊 不 清 楚 。 現 階 段 只 知 道 它 的 蛋 白 質 序 列 上 有 一 些 區 域 是 與 它 的 被 分 解 及 抑 制separase有 關2 4。 基 本 上securin可 以 將 其 分 成 N-terminal及 C-terminal的 兩 個 功 能 區 域 。 在 其N端 最 重 要 的 功 能 是 與 securin的 分 解 有 關6 6 , 6 7， 之 前 有 提 到 securin在 細 胞 分 裂 的 M-phase會 被 anaphase promoting complex (APC) 辨 識 ， 並 促 使securin被 分 解 。 而 在 securin N端 上 的 D box (destruction box)或 稱 作KEN box重 複 序 列 ， 因 它 是 由 三 個 胺 基 酸 所 組 成 ， 這 個 序 列 就 是 APC 所 辨 認 的 位 置，在 一 些 研 究 中 發 現 到 如 果 將 此 一box作 突 變 時，就 會 影 響 到 其 分 解 的 效 率，若 是 將 其 全 部 突 變，則securin幾 乎 不 會 被 分 解 6 8。在securin 的C端 有 兩 個 PXXP重 複 序 列 ， 一 旦 發 生 突 變 會 使 得 securin失 去 其transforming及 transactivating的 活 性6 9 , 7 0， 此 外C端 也 是 securin與 separase
圖 1- 6 、 securin 序 列 圖 。 圖 中 灰 底 部 分 為 D box； 黑 底 則 為 PXXP 序 列 。
1-3-8 無 特 定 構 形 蛋 白 質 (Disordered protein)
因 為 securin 蛋 白 質 在 功 能 的 發 現 上 日 趨 亦 多，而 許 多 研 究 學 者 將 其 認 定 為 多 功 能 性 的 蛋 白 質 (mltiplefunction protein)， 但 是 這 與 傳 統 的 觀 念 有 所 出 入 。 因 為 在 傳 統 的 觀 念 上 是 一 種 功 能 具 有 其 特 定 的 結 構 ， 若 是 如 此 多 功 能 性 的 蛋 白 質 其 結 構 上 又 是 如 何 呢 ？ 而 在 近 年 中 開 啟 了 所 謂 無 特 定 構 形 蛋 白 質 的 研 究 ， 因 為 這 類 蛋 白 質 被 發 現 在 獨 立 存 在 時 不 具 有 特 定 構 形 ， 且 這 類 蛋 白 質 大 部 分 都 具 有 多 功 能 性 ， 這 樣 的 發 現 在 結 構 與 功 能 彼 此 之 間 是 不 可 缺 的 傳 統 觀 念 中 掀 起 一 陣 震 撼 。 ( 1 ) 無 特 定 構 形 蛋 白 質 討 論在 1959 的 時 候 於 分 子 生 物 學 （ Journal Molecular Biology） 的 期 刊 上 ， 發 表 了 第 一 個 蛋 白 質 的 三 維 架 構 ， 而 那 個 蛋 白 質 為myoglobin， 是 由 Kendrew等 人 所 解 出 來 的7 3。 隨 著 後 基 因 體 時 代 的 來 臨 ， 人 類 對 於 基 因 的 研 究 焦 點 ， 已 由 解 碼 定 序 轉 移 到 由 基 因 表 現 的 最 終 產 物 蛋 白 質 的 身 上 。 換 言 之 ， 儘 管 科 學 家 已 知 一 基 因 的 序 列 內 容 ， 但 還 必 須 進 一 步 了 解 此 基 因 的 生 理 功 能 ， 而 基 因 的 功 能 又 是 以 蛋 白 質 的 形 式 表 現 。 蛋 白 質 的 功 能 又 與 其 三 度 空 間 結 構 有 很 大 的 關 聯 性 ， 因 此 ， 蛋 白 質 的 功 能 與 結 構 預 測 方 面 的 研 究 漸 形 重 要 。 然 而 在 後 基 因 時 代 ， 對 於 從 轉 譯 蛋 白 質 的 序 列 來 決 定 其 功 能 來 說 ， 是 一 項 極 大 的 挑 戰 。 而 目 前 一 般 的 認 知 都 認 為 蛋 白 質 的 功 能 與 其 三 級 結 構 有 著 密 切 的 關 連4， 而 我 們 最 常 用 鎖 與 鑰 來 形 容 蛋 白 質 與 其 受 質 的 關 係 ， 也 就 是 架 構 在 這 樣 的 觀 念 下 ， 以 致 運 用 預 測 及 實 驗 的 方 式 ， 來 瞭 解 資 料 庫 中 大 量 蛋 白 質 序 列 的 結 構 ， 變 成 重 要 的 事 情 了 。 然 而 在 近 代 的 許 多 實 驗 與 研 究 中 ， 逐 漸 發 現 許 多 基 因 於 水 溶 液 中 並 無 法 摺 疊 出 良 好 的 球 形 蛋 白 質 ， 取
而 代 之 的 是 結 構 鬆 散 ， 無 特 定 結 構 的 蛋 白 質 。 雖 然 對 於 許 多 蛋 白 質 結 構 與 功 能 是 有 高 度 相 關 性 的 ， 但 是 也 有 不 少 的 蛋 白 質 在 生 理 環 境 下 是 缺 少 固 定 的 結 構 ， 而 且 這 些 沒 有 特 定 結 構 的 蛋 白 質 ， 在 一 些 細 胞 重 要 的 調 控 環 節 中 扮 演 極 重 要 的 角 色 ， 也 因 為 其 結 構 並 不 固 定 ， 使 得 這 些 蛋 白 質 在 與 其 受 質 結 合 的 時 候 有 極 大 的 包 容 性 ， 意 即 可 以 與 數 種 不 同 的 受 質 作 結 合 。 目 前 已 知 道 許 多 無 特 定 結 構 的 蛋 白 質 與 細 胞 週 期 、 轉 錄 與 轉 譯 的 調 控 有 關7 4。 。 而 最 早 無 特 定 結 構 蛋 白 質 的 例 子 為glucagon， 為 一 個 很 小 的 多 胺 基 酸 鏈 賀 爾 蒙 ， 在 水 溶 中 為 一random colis的 結 構7 5。 陸 陸 續 續 發 現 許 多 蛋 白 質 部 分 區 域 或 是 整 個 蛋 白 質 是 沒 有 特 定 結 構7 4。 透 過 分 析 許 多 蛋 白 質 的 胺 基 酸 序 列 ， 發 現 到 有 許 多 的 蛋 白 質 具 有 部 分 鬆 散 結 構 ， 而 這 些 結 構 的 胺 基 酸 序 列 複 雜 度 並 不 高 。 而 這 樣 的 發 現 ， 在 以 結 構 與 功 能 關 聯 為 主 的 研 究 中 掀 起 了 波 瀾 ， 並 激 起 了 對 於 結 構 無 序 蛋 白 質 在 生 物 中 所 扮 演 的 角 色 的 研 究 。 簡 單 來 說 ， 結 構 生 物 學 的 中 心 教 條 是 完 整 的 結 構 與 其 功 能 是 息 息 相 關 的 ， 但 隨 著 無 特 定 結 構 蛋 白 質 的 發 現 ， 將 這 樣 的 定 則 打 破 了 。 雖 然 蛋 白 質 的 功 能 與 其 結 構 是 相 互 關 連 的 ， 但 並 不 是 所 有 的 有 功 能 的 蛋 白 質 其 結 構 都 是 穩 定 存 在 的 。 就 之 前 所 敘 的 ， 蛋 白 質 結 構 不 穩 定 可 以 分 成 部 分 或 是 整 個 蛋 白 質 的 架 構 ， 而 部 分 的 蛋 白 質 結 構 不 穩 定 可 以 在 很 多 的X-ray及 NMR的 結 果 中 發 現 ， 而 在 一 些 蛋 白 質 中 ， 部 分 未 摺 疊 的 區 域 常 常 與 生 理 活 性 有 關 係 。 以 下 就 針 對 一 些 無 特 定 構 形 與 生 理 活 性 之 間 的 關 係 作 介 紹 ： ( 2 ) 無 特 定 構 形 蛋 白 質 與 R N A 之 間 的 辨 認
目 前 已 知 道 的 像 是 在HIV-1 Rev及 BIV Tat兩 個 蛋 白 質 中 的 RNA辨 認 區 域 是 一 鬆 散 的 結 構，但 當 其 與 目 標 基 因 作 結 合 (RRE及 TAE) 的 時 候，會 變 成α-helical及 β-hairpin的 結 構7 6 - 7 9。 此 外 ， 透 過NMR分 析 的 方 式 也 發 現 在 噬 菌 體 中 的protein N這 個 蛋 白 質 在 水 溶 液 中 亦 是 一 個 無 次 序 的 蛋 白 質8 0。 而 在 一 些 特 定 的 核 糖 體 蛋 白 質 ， 亦 是 透 過 與RNA結 合 的 方 式 來 穩 定 其 結 構 8 1. 例 如 在 核 糖 體 蛋 白 質 L11- C7原 本 具 有 一 個 15胺 基 酸 所 形 成 的 沒 有 結 構 及 具 有 高 度 彈 性 的 環 形 架 構 ， 當 其 與RNA結 合 的 時 候 就 會 形 成 一 個 特 定 結 構 的 蛋 白 質8 2。 而 這 樣 具 有 彈 性 的 蛋 白 質 ， 可 能 在 核 糖 體 蛋 白 質 形 成 上 扮 演 一 個 即 為 關 鍵 的 角 色 ( 3 ) 無 特 定 構 形 蛋 白 質 與 轉 譯 過 程 mRNA轉 譯 成 蛋 白 質 讚 真 核 生 物 質 中 是 一 個 受 到 高 度 調 控 的 過 程 。 而 在 其 中 有 一 蛋 白 質 叫 做eIF4G。 而 eIF4G 扮 演 的 角 色 扮 是 加 速 核 糖 體 的 次
單 元 結 合 在mRNA的 5’端 ， 而 它 亦 是 eIF4E (m7GpppN cap binding protein， 它 是 一 個 在mRNA的 前 端 加 cap 的 蛋 白 質 ) 與 the RNA helicase eIF4A 之 間 的 橋 樑 。 而 在NMR的 檢 測 中 發 現 eIF4G內 有 一 98 個 胺 基 酸 的 區 域 在 eIF4E 不 存 在 的 時 候 是 沒 有 摺 疊 的8 3。同 樣 透 過 與eIF4E的 結 合 來 讓 此 區 域 摺 疊 起 來。在 哺 乳 動 物 的 細 胞 裡，是 由 三 個eIF4E-binding proteins (termed 4EB 來 調 控eIF4G與 eIF4E 的 連 結 ， 同 樣 透 過 NMR的 研 究 發 現 ， 4E-BP1 同 樣 是 具 有 一 個 未 摺 疊 的 區 域
Ps)
8 4。 而 這 些 未 摺 疊 區 域 同 樣 透 過 與eIF4E 結 合 的 方
式 ， 最 後 形 成 一 個 兩 端 為 一L形 的 延 展 區 域 而 內 部 具 有 一 個 短 α-helix的 結 構 (圖 1-6)。
圖 1- 7、 4EBPs與 eIF4E結 合 誘 導 α-helix形 成 示 意 圖8 3。 圖 中 框 框 處 為 結 合 及 α-helix 形 成 之 處 。 ( 4 ) 細 胞 週 期 調 控 ( C e l l c y c l e r e g ul a t i o n ) 除 了 一 開 始 所 提 到 的 無 特 定 結 構 的 蛋 白 質 在 基 因 的 轉 錄 、 轉 譯 調 控 上 具 有 一 定 的 影 響 力 ， 這 些 無 特 定 結 構 的 蛋 白 質 在 細 胞 週 期 的 調 控 上 亦 扮 演 重 要 的 角 色 。 尤 其 ， 因 為 它 們 無 特 定 結 構 ， 當 其 需 要 與 其 受 質 結 合 時 可 以 迅 速 地 翻 轉 其 結 構 ， 此 外 當 受 質 離 開 時 ， 又 可 以 迅 速 地 打 開 其 結 構 。 而 這 樣 的 特 性 可 以 讓 細 胞 在 細 胞 週 期 的 過 程 中 ， 對 於 環 境 及 其 內 部 的 變 化 具 有 很 高 的 敏 感 度 。 而p21W a f 1 / C i p 1 / S d i 1就 是 一 個 很 好 的 例 子 ， 它 是 在 細 胞 週 期 中 扮 演CDK的 抑 制 者 。 雖 然 p21已 被 證 實 了 具 有 功 能 性 ， 但 是 在 一 開 始 的 時 候，卻 沒 有 相 關 文 獻 研 究 出 其 有 特 定 的 結 構。而 在1996年 Peter E. Wright 等 人 利 用NMR (nuclear magnetic resonance) 及 CD (circular dichroism)技 術 ， 證 實 了 蛋 白 質p21沒 有 特 定 的 二 級 結 構 與 三 級 結 構8 5，而 在 本 實 驗 室 之 前 的
研 究 中，透 過 蛋 白 質 重 新 摺 疊 的 方 式 及 熱 穩 定 的 分 析，亦 證 實 了p21並 無 一 個 穩 定 的 三 級 結 構8 6。 而 這 是 一 個 相 當 驚 人 的 發 現 ， 因 為 對 於 大 部 分 的 球 形 蛋 白 質 來 說 ， 在 水 溶 液 中 若 是 沒 有 一 個 特 定 的 結 構 ， 其 會 形 成 堆 積 的 狀 態 且 失 去 功 能 。 此 外 在Kriwacki等 人 發 現 Cdk2蛋 白 質 可 以 造 成 p21的 摺 疊 8 5 , 8 7 ，而 這 樣 的 情 況 讓 研 究 者 提 出 了 一 個 想 法，就 是p21本 身 所 具 備 的 有 彈 性 及 無 特 定 構 形 的 結 構 ， 在 其 功 能 上 具 有 很 重 要 的 地 位 。 因 為 結 構 不 穩 定 性 讓 其 可 以 和 其 他 不 同 的 成 分 作 結 合8 8。 ( 5 ) 誘 導 摺 疊 在 分 子 辨 識 及 訊 息 傳 導 上 的 生 物 特 性 某 些 生 物 機 能，例 如 酵 素 的 催 化，免 疫 上 的 辨 識 或 者 細 胞receptor的 分 子 區 別 ， 在 蛋 白 質 的 結 構 要 求 上 是 絕 對 地 要 求 精 準 的8 9。 相 對 的 在 訊 息 傳 導 上 ， 只 要 簡 單 的 一 段 序 列 或 是 二 級 結 構 就 可 以 很 輕 易 達 到 傳 遞 的 效 果 。 然 而 無 特 定 結 構 的 蛋 白 質 可 以 透 過 誘 導 摺 疊 的 方 式 提 供 生 物 許 多 重 要 的 優 勢 在 訊 息 傳 導 及 調 控 上 。 如 前 所 述 ， 因 為 天 生 無 特 定 結 構 的 蛋 白 質 ， 在 結 構 上 就 是 具 有 彈 性 ， 容 易 因 應 環 境 來 改 變 其 構 形 ， 如 此 一 來 就 可 以 讓 一 個 蛋 白 質 辨 識 許 多 其 他 的 生 物 目 標 。 如 同p21W a f 1 / C i p 1 / S d i 1 可 以 抑 制 多 數 cyclin-Cdk的 複 合 體8 5。如 此 一 來，無 特 定 結 構 的 蛋 白 質 好 像 在 辨 識 的 專 一 性 上 並 不 是 非 常 的 高，但 在1994年 Spolar & Record9 0的 研 究 中 提 到 了 這 樣 的 情 形 ， 即 無 特 定 結 構 蛋 白 質 與 其 受 質 結 合 是 透 過 摺 疊 過 渡 的 狀 態 來 達 到 分 子 的 辨 識 機 制 ， 因 為 無 特 定 結 構 的 蛋 白 質 在 和 受 質 結 合 後 一 樣 要 從 無 特 定 結 構 的 狀 態 形 成 特 定 的 結 構 ， 所 以 在 形 成 特 定 結 構 的 過 渡 狀 態 時 ， 一 些 比 較 特 定 的 小 區 域 結 構 就 會 形 成 ， 而 這 些 結 構 即 可 達 到 辨 識 的 效 果 。 ( 6 ) 未 摺 疊 蛋 白 質 與 s e c u r i n 之 間 的 關 係 而 在Nuria9 1等 人 在2005所 發 表 的 論 文 中 他 們 也 提 到 了 的 structure-fuction paradigm的 概 念9 2， 這 個 概 念 就 是 由 無 特 定 結 構 蛋 白 質 而 來 的 ， 就 是 說 一 般 在 生 物 化 學 的 領 域 中 都 認 為 結 構 與 功 能 彼 此 之 間 是 不 可 缺 的 ， 換 句 話 說 結 構 與 其 功 能 有 很 大 的 關 聯 性 ， 但 是 在 近 年 來 的 研 究 中 發 現 到 有 許 多 的 蛋 白 質 在 它 有 功 能 的 狀 態 下 的 時 候 ， 其 並 不 具 有 特 定 的 結 構 ， 而 這 樣 的 特 性 對 蛋 白 質 來 說 有 不 少 的 好 處 ， 像 是 可 與 很 多 種 的target 作 結 合 ， 因 為 他 的 結 構 具 有 很 大 彈 性 。 此 外 還 可 以 降 低 蛋 白 質 結 合 時 候 的 立 體 障 礙9 3。而 它 們 認 為securin亦 是 屬 於 unfolded的 蛋 白 質，因 為 在 之 前 的 研 究 發 現securin具 有 很 多 不 同 的 功 能 ， 而 這 對 一 個 結 構 穩 定 的 蛋 白 質 來 說 似 乎 是 個 不 太 可 能 發 生 的 事 ， 除 了 是 很 多 蛋 白 質 形 成 的 復 合 體 ， 才 能 具 有
很 多 的 功 能。他 們 透 過one-step摺 疊 方 式，來 研 究 securin的 結 構，而 所 得 到 的 結 果 是 它 們 認 為securin是 一 個 native unfolded protein9 1。
然 而 在 one-step 直 接 稀 釋 法 中 ， 其 摺 疊 效 率 皆 會 隨 著 蛋 白 質 的 濃 度 增 加 而 大 幅 降 低 此 外，由 於 是 直 接 稀 釋，最 後 得 到 的 蛋 白 質 濃 度 會 非 常 的 低， 這 樣 對 後 續 的 實 驗 有 著 一 定 程 度 的 影 響 。 且 在 許 多 的 蛋 白 質 摺 疊 研 究 中 也 發 現 蛋 白 質 的 摺 疊 需 要 一 定 的 時 間 ， 就 以 one-step 的 摺 疊 方 式 來 說 ， 可 能 無 法 給 予 蛋 白 質 足 夠 的 摺 疊 時 間 。 因 為 本 實 驗 室 於 之 前 的 蛋 白 質 摺 疊 的 研 究 中 ， 已 經 成 功 的 建 立 一 套 蛋 白 質 重 新 摺 疊 的 系 統 ， 於 此 我 們 想 利 用 這 套 成 功 的 摺 疊 系 統 來 重 新 摺 疊 securin 這 個 蛋 白 質，以 期 能 夠 瞭 解 它 在 重 新 摺 疊 的 過 程 中 一 些 結 構 的 變 化 ， 以 及 securin 在 native state 的 狀 態 下 是 否 真 的 為 一 disorded 蛋 白 質 。 此 外 因 securin 與 許 多 的 癌 症 形 成 有 關 ， 加 上 有 研 究 發 現 它 和 p53 這 個 抑 癌 蛋 白 質 之 間 有 關 聯 所 以 我 們 也 利 用 far western 的 技 術 來 分 析 它 和 p53 之 間 是 否 存 在 一 個 直 接 的 連 結 ， 而 這 樣 的 連 結 可 能 會 影 響 到 p53 的 功 能 。
第 二 章 、 實 驗 原 理
在 蛋 白 質 的 結 構 與 功 能 分 析 上 ， 最 重 要 的 部 分 就 是 蛋 白 質 樣 品 的 取 得 ， 而 因 為 生 物 科 技 的 進 步 ， 利 用 基 因 重 組 的 方 式 來 生 產 蛋 白 質 已 經 是 非 常 普 遍 的 方 式 ， 而 本 實 驗 中 就 是 利 用 這 樣 的 方 式 來 生 產 大 量 的 蛋 白 質 。 並 透 過 本 實 驗 室 的 準 靜 態 熱 平 衡 透 析 法 (quasi-static thermal equilibrium dialysis) 將 蛋 白 質 進 行 重 新 摺 疊 1 , 5 , 6 , 7 , 8。 並 透 過 圓 二 色 旋 光 光 譜 儀 (CD) 的 分 析 來 瞭 解 摺 疊 過 程 中 蛋 白 質 的 結 構 變 化 ， 及 二 級 結 構 的 比 例 ， 並 加 上 動 態 光 散 射 儀 (DLS) 的 分 析 來 瞭 解 蛋 白 質 在 摺 疊 過 程 中 ， 分 子 大 小 的 變 化 。 並 且 為 了 更 進 一 步 瞭 解 重 新 摺 疊 的 蛋 白 質 在 結 構 上 的 熱 穩 定 性 ， 我 們 還 採 用 了 微 溫 差 掃 描 熱 卡 路 里 計 (DSC) 來 測 量 蛋 白 質 的 相 變 溫 度 與 能 量 。 最 後 透 過far western的 技 術 ， 我 們 可 以 去 偵 測 蛋 白 質 之 間 的 是 否 存 在 著 直 接 的 交 互 作 用 。 以 下 分 別 介 紹 各 個 實 驗 方 法 的 原 理 ：
2-1 蛋 白 質 securin 的 製 備
近 年 來 生 物 科 技 和 基 因 重 組 技 術 的 進 步 ， 使 我 們 能 將 重 組 之 基 因 送 進 微 生 物 細 胞 內 ， 利 用 微 生 物 來 大 量 製 造 ， 再 加 以 純 化 分 離 出 我 們 所 需 要 的 基 因 重 組 蛋 白 質 3。 而 由 於 我 們 將 基 因 重 組 蛋 白 質 在 細 胞 內 大 量 的 表 現 ， 容 易 造 成 此 一 蛋 白 質 在 細 胞 內 形 成 不 具 活 性 的 內 涵 體 (inclusion body)9 4。本 實 驗 是 將securin基 因 構 築 到 大 腸 桿 菌 (E. coli) 的 表 現 系 統
BL21(DE3)中，由 大 腸 桿 菌 大 量 表 現 securin蛋 白 質。利 用 BL21(DE3)菌 株 大 量 複 製 帶 有securin基 因 片 段 的 pET200質 體，並 在 37℃ 環 境 下 以 IPTG引 發 大 腸 桿 菌 大 量 表 現securin蛋 白 質 ，最 後 形 成 內 涵 體 (inclusion body)。待 細 菌 培 養 適 當 時 間 之 後 再 用 物 理 性 破 壞 方 式 來 把 細 胞 打 碎 以 得 到 所 需 要 的 蛋 白 質。利 用 誘 導 大 腸 桿 菌 產 生 蛋 白 質 內 涵 體 的 的 優 點 有：(1) 細 菌 生 長 快 速 。 (2) 蛋 白 質 產 量 極 高 。 (3) 蛋 白 的 純 度 也 相 對 較 高 。
2-2 蛋 白 質 摺 疊
因 由 細 菌 內 涵 體 所 得 到 的 蛋 白 質 為 不 具 有 功 能 的 結 構 ， 因 蛋 白 質 是 形 成 錯 誤 的 摺 疊 (misfolding)， 且 分 子 間 是 相 互 堆 疊 的1。 而 一 般 而 言 蛋 白 質 的 結 構 決 定 了 其 生 理 上 的 活 性 表 現9 5， 這 些 內 涵 體 內 的 蛋 白 質 純 度 雖 高 但 並 不 具 有 功 能 性 ， 因 此 還 是 需 要 利 用 摺 疊 的 方 法 讓 這 些 蛋 白 質 能 在 實 驗 室 中 摺 疊 至 正 常 的 結 構 。 首 先 為 了 要 讓 蛋 白 質 摺 疊 恢 復 活 性 ， 要 將 沒 有 活 性的 內 涵 體 以 變 性 劑 溶 解 。 而 這 個 過 程 我 們 稱 為 「 變 性 」(denaturation)， 這 類 變 性 劑 主 要 是 破 壞 維 持 蛋 白 質 三 級 結 構 的 疏 水 作 用 力 及 穩 定 二 級 結 構 的 氫 鍵 作 用 力 等9 6。 透 過 變 性 劑 的 作 用 ， 蛋 白 質 回 到 只 有 一 級 結 構 胜 肽 鏈 ， 在 此 狀 態 下 蛋 白 質 並 無 生 物 活 性 及 特 定 的 三 級 結 構 。
在 經 過 蛋 白 質 變 性 這 個 步 驟 之 後 ， 我 們 要 將 蛋 白 質 從 未 摺 疊 的 狀 態 (unfolding) 摺 疊 到 自 然 態 (native state)， 透 過 將 變 性 劑 的 濃 度 逐 漸 降 低 ， 到 最 後 甚 至 移 除 ， 讓 原 本 破 壞 蛋 白 質 分 子 間 作 用 力 漸 漸 消 失 ， 使 蛋 白 質 重 新 自 我 排 列 、 組 織 ， 而 這 樣 的 一 個 過 程 就 稱 之 為 蛋 白 質 的 「 再 摺 疊 」 (refolding)。 而 將 蛋 白 質 重 新 摺 疊 的 方 式 有 分 成 很 多 種 ， 包 括 直 接 稀 釋 法 (direct dilution)、 透 析 法 (dialysis）、 分 子 大 小 排 阻 層 析 (size-exclusion chromatograph)等。一 般 來 說 在 摺 疊 的 過 程 中，蛋 白 質 的 濃 度 對 其 重 新 摺 疊 過 程 來 說 有 一 定 的 影 響 ， 當 蛋 白 質 濃 度 過 高 時 ， 會 使 原 本 在 胜 肽 鏈 間 的 疏 水 性 殘 基 區 域 容 易 互 相 作 用 形 成 錯 誤 的 摺 疊 ， 且 聚 集 在 一 起 形 成 聚 集 體 (aggresome)2。 因 此 通 常 在 摺 疊 蛋 白 質 時 最 直 接 的 方 式 就 是 降 低 蛋 白 質 濃 度 ， 但 蛋 白 質 濃 度 的 降 低 ， 對 我 們 之 後 進 行 一 些 分 析 的 實 驗 上 來 說 ， 並 不 是 非 常 有 利 。 為 了 避 免 此 問 題 ， 本 實 驗 採 用 準 靜 態 熱 平 衡 透 析 法
(quasi-static thermal equilibrium dialysis) 來 將 蛋 白 質 摺 疊5。 這 是 一 種 能 將 高 濃 度 的 蛋 白 質 摺 疊 的 方 法 ， 以 此 可 獲 得 高 活 性 、 高 濃 度 、 和 高 回 收 率 的 蛋 白 質 5。 本 實 驗 的 目 的 是 想 要 瞭 解 蛋 白 質 在 摺 疊 過 程 中 的 結 構 變 化 ， 故 我 們 把 各 階 段 的 摺 疊 中 間 體 (intermediates)9 7取 出 來 來 比 較 其 間 之 差 異 ， 這 也 是 本 實 驗 利 用 階 段 性 溶 液 控 制 透 析 法 進 行 蛋 白 質 摺 疊 的 主 因 。 基 本 上 蛋 白 質 摺 疊 至 具 有 生 物 活 性 的 自 然 結 構 (native state)， 從 熱 力 學 的 角 度 來 看 ， 蛋 白 質 摺 疊 是 從 高 構 形 轉 變 能 量 趨 向 低 構 形 能 量 的 過 程 ， 當 蛋 白 質 摺 疊 至 其 自 然 結 構 時 ， 其 蛋 白 質 構 形 能 量 是 處 於 相 對 最 低 的 狀 態 。 故 不 論 是 直 接 稀 釋 6 6和 階 段 性 熱 平 衡 透 析 法9 8， 其 目 的 都 是 要 將 變 性 劑 移 除 ， 讓 破 壞 蛋 白 質 結 構 的 因 素 逐 漸 消 除 ， 使 其 能 逐 漸 摺 疊 至 其 最 低 構 形 能 量 態 。 在 此 介 紹 本 實 驗 主 要 使 用 到 的 摺 疊 方 式 ， 準 靜 態 熱 平 衡 透 析 法 (quasi-static thermal equilibrium dialysis)： 此 方 法 顧 名 思 義 主 要 是 利 用 逐 步 透 析 的 方 式 來 降 低 變 性 劑 的 濃 度 到 完 全 移 除 。 其 中 為 了 避 免 蛋 白 質 因 周 圍 環 境 劇 烈 的 改 變 而 造 成 摺 疊 上 的 錯 誤 或 是 聚 集 沉 澱 ， 所 以 採 用 逐 步 的 透 析 方 式 ， 來 降 低 緩 衝 溶 液 中 的 變 性 劑 濃
度 或 離 子 濃 度 。 因 為 當 環 境 的 改 變 相 當 微 小 的 時 候 ， 可 以 說 摺 疊 過 程 中 每 一 個 階 段 都 是 符 合 準 靜 熱 力 學 平 衡 。 故 最 後 當 變 性 劑 漸 漸 的 移 除 後 ， 蛋 白 質 因 其 自 組 織 的 能 力 ， 而 自 發 性 (spontaneous) 的 摺 疊 形 成 其 自 然 結 構5。 如 前 面 所 言 的 ， 在 本 方 法 的 透 析 過 程 中 ， 每 一 個 階 段 都 是 遵 守 準 靜 熱 力 學 平 衡 原 理 ， 蛋 白 質 的 構 形 能 量 會 很 快 達 到 能 量 最 低 態 (local minima)， 所 以 在 階 段 性 熱 平 衡 透 析 法 的 過 程 中 ， 能 量 改 變 是 連 續 性 的 ， 持 續 的 改 變 反 應 位 能 ， 最 後 達 到 自 然 結 構 的 能 量 ， 不 會 因 環 境 劇 烈 的 變 化 造 成 結 構 急 速 的 改 變 而 形 成 錯 誤 的 摺 疊5。
2-3 圓 二 色 旋 光 光 譜 儀 (Circular Dichroism: CD)
如 前 面 所 提 到 的 ， 本 實 驗 主 要 的 目 的 是 要 瞭 解 蛋 白 質 在 摺 疊 過 程 中 其 結 構 的 變 化，而 圓 二 色 旋 光 光 譜 儀 (Circular Dichroism spectrometer) 就 是 一 個 很 重 要 的 實 驗 工 具9 9。 因 為 圓 二 色 旋 光 光 譜 儀 主 要 是 用 以 測 量 蛋 白 質 的 二 級 結 構 ， 透 過 瞭 解 二 級 結 構 的 分 佈 比 例 就 可 探 討 蛋 白 質 二 級 結 構 在 摺 疊 過 程 中 的 改 變 。 因 為 組 成 蛋 白 質 的 胺 基 酸 分 子 大 部 分 都 具 有 光 學 活 性 。 從 胺 基 酸 的 結 構 來 看 ， 其 是 一 個 四 面 體 的 形 狀 ， 其 四 個 角 都 帶 有 不 同 的 基 團 ， 因 各 個 基 團 的 排 列 在 空 間 中 有 所 不 同 會 形 成 兩 種 不 同 的 構 形 的 胺 基 酸 ， 一 般 來 說 我 們 都 稱 這 樣 不 同 的 構 形 為 鏡 像 異 構 物 (enantiomer)， 或 是 生 物 分 子 的 手 性 (chirality)1 0 0。 而 這 類 分 子 光 學 活 性 的 來 源 是 由 於 能 產 生 左 旋 或 右 旋 偏 極 光 ， 一 般 能 將 產 生 左 旋 偏 極 光 稱 為 左 旋 異 構 物 (levorotatory isomer， L-form)； 而 能 產 生 右 旋 偏 極 光 的 則 為 右 旋 異 構 物 (dextrorotatory isomer， D-form)1 0 1。 也 因 胺 基 酸 擁 有 光 學 活 性 ， 所 以 胺 基 酸 組 成 之 蛋 白 質 之 立 體 結 構 同 樣 也 具 有 光 學 活 性 ， 其 中 又 以 當 中 二 級 結 構 的 光 學 活 性 更 具 特 徵 性 。 一 圓 形 入 射 光 可 想 像 為 左 右 旋 光 向 量 之 合 ， 當 通 過 蛋 白 質 時 ， 將 會 吸 收 與 電 子 雲 方 向 相 同 之 電 場，而 使 入 射 光 產 生 偏 向，最 後 變 為 橢 圓 偏 極 光。 透 過 所 產 生 連 續 的 左 旋 與 右 旋 光 ， 當 其 穿 過 蛋 白 質 樣 本 時 ， 其 原 本 的 右 旋 或 左 旋 光 被 吸 收 後 ， 其 吸 收 值 經 由 訊 號 接 收 器 讀 出 ， 而 圓 二 色 旋 光 光 譜 儀 就 是 透 過 計 算 左 旋 偏 極 光 (LCPL) 與 右 旋 偏 極 光 之 差 異 (RCPL) 吸 收 來 得 到 一 個 特 徵 吸 收 圖 形 。以 α-helix 與 β-sheet 之 多 胜 鏈 為 例，以 往 的 研 究 中 發 現，典 型 的 α-helix 在 222nm、208nm 擁 有 兩 個 負 的 譜 帶，而 在 192nm 左 右 會 產 生 一 正 的 譜 帶；
至 於 β-sheet 在 210nm、 222nm 也 會 有 兩 個 負 的 譜 帶 ， 此 外 在 195nm 有 一 正 的 譜 帶；其 他 像 是 turn 的 結 構 是 在 190nm 有 一 負 譜 帶，208nm 左 右 產 生 一 正 的 譜 帶 2 2。
