植物生長調節劑及化學添加物對人蔘癒傷組織形態發生之影響

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(1)國立高雄大學生命科學系碩士班碩士論文. 植物生長調節劑及化學添加物對人蔘癒傷組織形態發生之影響 Effects of plant growth regulators and chemical additives on in vitro morphogenesis from callus of Panax ginseng. 研究生：江政杰撰指導教授：陳彥澄博士中華民國一百零三年七月.

(2) 謝誌 Acknowledgement 承蒙指導教授陳彥澄博士開明作風和耐心指導，在兩年碩士班過程中，給予獨立自主的訓練和自由空闊的思考空間，並提供完善的學習及研究環境，一個我能夠自由發揮的機會。陳老師在試驗過程中適時教導我所需試驗方法，引導學生更深入思考試驗設計與邏輯想法並給予寶貴的建議與指正，並且鼓勵我勇於嘗試自己的想法，不要畏懼失敗。此外，也謝謝老師在論文撰寫期間細心指導及不厭其煩的修改。很榮幸邀請張學偉老師和黃斌老師擔任口試委員，引導學生更深入思考試驗設計與邏輯想法並給予寶貴的建議與指正，衷心的感謝您們。謝謝高雄大學生命科學系和碩士班的老師們，感謝你們所教授的一切。也謝謝 501 實驗室芳儒同學、孟澤同學和芷婷學妹在試驗以及儀器應用方面的幫助，並時常一起討論試驗研究方向和需要改進部分，讓我受益良多。那段互相砥礪與鼓勵的日子由衷感謝和你們一起度過，讓我碩班的生活多彩多姿。謝謝我的家人感謝你們給我完全信任、支持及鼓勵，讓我能無憂無慮的完成學位。感謝父母提供我經濟上支助，讓我能夠全心全意專心研究，順利完成學業。以此獻給曾經幫助我完成此篇論文的所有貴人們，有你們的無私幫助才得以讓我順利取得碩士學位，謝謝你們。學生江政杰於高雄大學生命科學系碩士班中華民國一百零三年八月. I.

(3) 縮寫表 Abbreviations 2,4-D. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid. AA. Ascorabic acid. AC. Activated charcoal. BA. N6-benzyladenine. IBA. Indole-3-butyric acid. Kinetine N6-furfuryl-adenine MS. Murashige and Skoog medium. NAA. α-Naphthaleneacetic acid. PGRs. Plant growth regulators. PVP. Polyvinylpyrrolidone. TDZ. Thidiazuron. II.

(4) 目錄 Contents 頁次致謝.................................................................................................................. I 縮寫表..............................................................................................................II 目錄.................................................................................................................III 表目錄..............................................................................................................V 圖目錄...........................................................................................................VII 中文摘要...........................................................................................................1 英文摘要...........................................................................................................3 第一章前言.....................................................................................................5 1.1 人蔘的分布及植物學特性........................................................................5 1.2 人蔘的藥用價值........................................................................................6 1.3 人蔘的培養................................................................................................7 1.4 形態發生....................................................................................................8 1.5 植物生長調節劑........................................................................................8 1.6 癒傷組織褐化和化學添加物....................................................................9 1.7 形態發生研究文獻..................................................................................10 第二章材料與方法.......................................................................................14 2.1 植物材料..................................................................................................14 2.2 培養基、容器及環境................................................................................14 2.3 植物生長調節劑......................................................................................14 2.4 化學添加劑..............................................................................................14 2.5 人蔘癒傷組織增殖率..............................................................................15 III.

(5) 2.6 人蔘癒傷組織之試管內形態發生..........................................................15 2.7 統計分析...................................................................................................15 第三章結果...................................................................................................17 3.1 人蔘癒傷組織增殖率..............................................................................17 3.2 人蔘癒傷組織之試管內形態發生..........................................................18 第四章討論...................................................................................................47 4.1 人蔘癒傷組織增殖率..............................................................................47 4.2 人蔘癒傷組織之試管內形態發生..........................................................48 第五章參考文獻...........................................................................................50. IV.

(6) 表目錄頁次表 1.1 人蔘皂苷藥用效果.............................................................................11 表 1.2 人蔘組織培養研究之概況.................................................................12 表 2.1 人蔘癒傷組織代號.............................................................................16 表 3.1 第一組人蔘癒傷組織增殖率.............................................................20 表 3.2 第二組人蔘癒傷組織增殖率.............................................................21 表 3.3 第六組人蔘癒傷組織增殖率...............................................................22 表 3.4 Kinetin 與 NAA 對第一組癒傷組織形態發生之影響（二個月） ...................................................................................................................23 表 3.5 植物調節劑和 PVP 對第一組癒傷組織形態發生之影響（二個月） ...................................................................................................................24 表 3.6 植物調節劑對第一組癒傷組織形態發生之影響（二個月） ...................................................................................................................25 表 3.7Kinetin 與 NAA 第二組對癒傷組織形態發生之影響（二個月） ...................................................................................................................26 表 3.8 植物調節劑和 PVP 對第二組癒傷組織形態發生之影響（二個月） ...................................................................................................................27 表 3.9 植物調節劑對第二組癒傷組織形態發生之影響（二個月） ...................................................................................................................28 表 3.10 第六組 BA 與 IBA 對癒傷組織形態發生的影響（二個月） ...................................................................................................................29. V.

(7) 表 3.11 第六組 Kinetin 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響（五個月） ...................................................................................................................30. VI.

(8) 圖目錄頁次圖 1.1 人蔘皂苷 Rb1、Rg1 和 Re 結構式.......................................................13 圖 3.1 第一組人蔘癒傷組織增殖率...............................................................31 圖 3.2 第二組人蔘癒傷組織增殖率...............................................................32 圖 3.3 第六組人蔘癒傷組織增殖率...............................................................33 圖 3.4 第一組人蔘癒傷組織...........................................................................34 圖 3.5 第二組人蔘癒傷組織...........................................................................35 圖 3.6 第六組人蔘癒傷組織...........................................................................36 圖 3.7 第一組形態發生 kinetin 和 NAA 組別（二個月）..............................37 圖 3.8 第一組形態發生 kinetin 和 NAA 組別含 100 mg/L PVP（二個月） ...................................................................................................................38 圖 3.9 第一組形態發生 I（二個月）.............................................................39 圖 3.10 第一組形態發生 II（二個月）..........................................................40 圖 3.11 第二組形態發生 kinetin 和 NAA 組別（二個月）............................41 圖 3.12 第二組形態發生 kinetin 和 NAA 組別含 100 mg/L PVP （二個月）.................................................................................................42 圖 3.13 第二組形態發生 I（二個月）..........................................................43 圖 3.14 第二組形態發生 II（二個月）........................................................44 圖 3.15 第六組形態發生（二個月）............................................................45 圖 3.16 第六組形態發生（五個月）............................................................46. VII.

(9) 植物生長調節劑及化學添加物對人蔘癒傷組織形態發生之影響指導教授:陳彥澄博士國立高雄大學生命科學系學生:江政杰國立高雄大學生命科學系碩士班摘要本試驗以人蔘癒傷組織作為培植體，培養於含不同濃度的化學添加劑、包括 ascorabic acid（AA）、activated charcoal（AC）、polyvinylpyrrolidone（PVP）之改良式 MS 培養基（Murashige and Skoog 1962 medium），進行癒傷組織增殖及試管內形態發生試驗。在癒傷組織增殖試驗方面，培養四週後， 0.5 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid（2,4-D）+ 0.1 mg/L 1-fenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) ureum （TDZ）組別癒傷組織添加 100 mg/L AA 提升最多增殖率，平均達 9.14 倍；0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 組別癒傷組織則是 50mg/L AA 提升 117％；2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 組別添加 50mg/L PVP 增殖率上升至 7.1 倍。在試管內形態發生試驗方面，將濃度 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 、0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 和 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 的癒傷組織置入含不同濃度 cytokinins 和 auxins 之培養基，並於光照下培養。八週後，置於 PGRs free 的癒傷組織逐漸褐化。然而，2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 的癒傷組織置於 0.02 mg/L N6-furfuryladenine （kinetin） + 3 mg/Lα -naphthalene acetic acid（NAA）五個月後，有不定根形成，每個癒傷組織平均 6.34 條根，根長 5.11 公厘。此外，0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 和 0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 誘導之癒傷組織在不同濃度 kinetin + indole-3-butyric acid（IBA）或 kinetin + 2,4-D 之處理下雖無根部之發育，但癒傷組織已有轉綠現象。綜合而論，本試驗所 1.

(10) 採用之癒傷組織具有器官形成之能力，而根器官之形成至少需要五個月左右之培養期間。關鍵字:人蔘、生長調節劑、形態發生、癒傷組織、化學添加劑. 2.

(11) Effects of plant growth regulators and chemical additives on in vitro morphogenesis from callus of Panax ginseng Advisor: Dr. Jen-Tsung Chen Department of Life Sciences, National University of Kaohsiung Student: Jiang Jheng Jie Department of Life Sciences, National University of Kaohsiung ABSTRACT Calli of Panax ginseng were used as explants to study the effects of ascorabic acid (AA), activated charcoal (AC) and polyvinylpyrrolidone (PVP) on proliferation rate and in vitro morphogenesis. All the explants were cultured on a modified MS (Murashige and Skoog, 1962) medium in darkness. After four weeks of culture, 100 mg/L AA gave the highest proliferation rate with an average of 9.14 folds on the callus line which was originally induced at 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ. Callus cultured on MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L TDZ and 50 mg/L AA had highest proliferation rate with an average of 13.69 folds. Callus cultured on MS medium supplemented with 2 mg/L 2,4-D, 0.5 mg/L TDZ and 50 mg/L PVP had highest proliferation rate with an average of 7.1 folds. We selected the callus which induced by the concentration of 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ, 0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ and 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ with different ratio of cytokinins and auxins medium for in vitro morphogenesis. Under the condition of the callus which induced by the concentration of 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ after 5 months were cultured on MS medium with 0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA, 3.

(12) the treatment could promote root formation and had of 6.34 roots in average. In addition, the callus treated with 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ or 0.5 mg/L 2,4-D + 0.5mg/L TDZ were cultured on MS medium with all different ratio of kinetin + IBA or Kinetin + 2,4-D did not possess the ability of root formation, but callus turned green. The result showed that root induction is depends on the culture time while not the high ration of NAA/kinetin.. Keywords：Panax ginseng; plant growth regulator; morphogenesis; callus; chemical additives. 4.

(13) 第一章前言 1.1. 人蔘的分布及植物學特性蔘類屬於五加科（Araliaceae），多年生草本植物。全球大約有 12. 種蔘類植物。蔘類的主要產地包含中國、韓國、日本、美國與加拿大等地，其中以高麗蔘（ Panax ginseng C. A. Meyer ）、西洋蔘（ Panax quinquefolius L.）及三七蔘（Panax notoginseng C. A. Meyer）較為常見。傳統中醫所指的人蔘是韓國人蔘（呂, 2002），而人蔘在古代中國被稱為「神聖的藥草」、「藥草之王」或「返老還童的靈丹」，《神農本草經》稱之為人銜、鬼蓋，而《無普本草》則稱之為黃參。人蔘主要分佈於東亞地區海拔 500 至 1100 公尺地區，較喜好陰涼且濕潤的氣候環境，一般生長在晝夜溫差小的山坡地，其自然棲地常伴有針闊混合林或雜木林，（黃, 2008）。「人蔘」這個詞源自於廣東話，其意思為人形。人蔘的根部肥大，呈紡錘狀，包含主根（人蔘條）、枝根（人蔘條）和細根（人蔘鬚），整體形態近似人的姿態，故稱為人蔘（王, 1993; 田, 1995; Harris and Lieberman, 2001）。開花性狀方面，主要於夏季生長開花，秋初結果，漿果為鮮紅色，大約於每年 9 至 11 月之間採收。在高麗人蔘方面，因其生長非常緩慢，所以需耗時 4 至 6 年才能採收。人蔘的栽培條件嚴苛，欲栽培出優良的人蔘，在氣候、日照量及土壤等關鍵的環境條件都需審慎地選擇（楊, 1993; Li and Wardle, 2002）。人蔘在治療與預防特定疾病功效十分顯著，但其培養條件嚴苛，植株生長緩慢，成熟時間長。利用體外組織培養技術，理論上能在短時間取得大量品質優良、藥用成份多的人蔘植株。因此，本論文擬建立人蔘 5.

(14) 癒傷組織之增殖系統，並探討癒傷組織再分化及試管內形態發生的培養條件。. 1.2 人蔘的藥用價值 Panax 由希臘語‘Panacea’一詞衍生而得，其原本的意思為治療所有疾病。人蔘作為滋補品的歷史悠久，具有多方面的效用，包括傷癒之恢復、增強免疫力、提升體力、調節荷爾蒙平衡、調控血壓達到控制高血壓、調節肝指數及肝功能等（方, 2003; 牛, 2011; 久保, 2007）。人蔘作為中草藥之歷史超過四千餘年，最早出現在春秋戰國，范蠡所著《計然》載有：「人蔘出上黨，狀類人形者善」之敘述。《神農本草經》記載：「人蔘補五臟、安精神、安魂魄、止驚悸、除邪氣、明目開心，久服輕身延年」。由此可知，在西漢以前，人蔘的藥用價值已被人們所瞭解並廣為應用了。自漢之後，人蔘在各醫書被列為珍貴藥材，並廣泛用來防治各種疾病直至現代（孫, 2006; 歐, 2001）。野生人蔘因需求生長環境嚴苛，且生長緩慢，所以取得不易，韓國於 18 世紀初開始發展人蔘栽培。人蔘根部所含有效藥用成分為皂苷，人蔘皂苷由其糖苷配基對應主要分成三個族群，（1）protopanaxadiol（Rb1、 Rb2、Rc、Rd）；（2）protopanaxatriol（Re、Rf、Rg1）；（3）oleanolic acid（Tanaka and Kasai, 1983）。Rb1、Rg1 和 Re（見圖 1.1）具有刺激或抑制神經系統作用，且有調節神經傳遞之作用，Rg1 和 Rb1 能提升中樞神經系統活動，但 Rb1 效用較弱。Rb2 具抗糖尿病之功效；Rd 和 Rh2 可抑制癌症細胞生長；Rh2 和 Rg1 可降低血壓（參考文獻?）。目前已分. 6.

(15) 離出三十多種人蔘皂苷與十多種人蔘多醣，其結構十分複雜，莫耳質量為 801.01 g/mol，這些成份具有耐缺氧、心肌保護、抗休克、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、促進蛋白質合成、抗利尿、抗疲勞、促進腦部代謝、強心、擴張心血管、抗心肌缺血、增強造血功能、抑制血小板聚集、刺激腎上腺皮質功能、增強免疫機能、增強人體適應性、抗突變、抗腫瘤等多種藥理作用（Shu et al., 2003）；更可清除自由基與抑制脂質的過氧化，達到抗老之功效（Aburjai et al., 2003）（見表 1.1）。此外還含有有機酸、甾醇、木質素、酶類、黃酮類、人蔘炔醇、人蔘環氧炔醇、 α –人蔘烯和銅、鋅、錳等微量元素（徐, 2001）。近年來由於化學合成藥物普遍使用，產生諸多問題，故引起科學家研究天然草藥之興趣。某些歐洲國家如德國、英國，允許醫生開草藥處方用於治病，醫學大學亦有教授天然草藥的課程，並在醫藥法規訂定草藥療效與安全標準，其中最常用為人蔘（江, 2008; 顏等, 2005）。臺灣現今面臨環境污染及人口老年化等問題，需要更多更有效保健食品以維持健康，人蔘為保健醫療市場上不可或缺原料之一，其中含成分非常多樣，譬如人蔘皂苷、人蔘多醣等是主要藥用成份（Hasegawa, 2004; Park et al., 2003; Shin et al., 2000）。利用植物組織培養是能夠大量生產且縮短生長時間，亦是一種可以維持優良基因有效方法。. 1.3 人蔘的培養野生人蔘主要生長在原生森林，無人為因素干預，在市場上具有最高的價值，但因生產地有限和人蔘生長緩慢，產量非常低（泰勒, 2007）。. 7.

(16) 人蔘無法快速大量生產主因是其生長緩慢，利用體外培養技術可以有效縮短植株所需生長時間。蔘類體外組織培養研究從 1960 年開始出現較多報導，其中以細胞（Wang 1990; Mathur et al., 1994; Zhong et al., 1996; Feeney and Punja 2003）、組織或器官（Jhang et al., 1974; Proctor et al., 1996; Kevers et al., 1999; Hovius et al., 2007）作為材料，以誘導出胚狀體或再生小植株。然而，試管內培養技術也面臨一些技術上問題，例如：如何使胚狀體成熟、如何誘導胚狀體長根和芽等，以及胚狀體繼代太多次後，繁殖率和再生能力都明顯下降（Shoyama et al., 1995）。. 1.4 形態發生形態發生（morphogenesis）是指植物在再生或發育過程中，細胞開始分裂，隨之產生功能及形態的變化，而使其器官或個體結構形成的過程（Ramage and Williams, 2002）。器官發生（organogenesis）是形態發生的一種，是指由組織或細胞團（癒傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程（韓, 2003）。器官發生又分直接器官發生與間接器官發生兩種：直接器官發生是由培植體表面直接生成器官，而間接器官發生則是指先生成癒傷組織，再由癒傷組織形成完整植物體的過程（王和高, 2006; 冉, 2004; Ramage and Williams, 2002）。. 1.5 植物生長調節劑植物生長調節劑具有調節植物生長發育之功能，離體培養下之器官分化，大多需要透過添加植物生長調節劑而達成。植物生長調節劑只需低濃度即可對植物生長造成明顯地促進或抑制作用。在植物生長不同時 8.

(17) 期所合適濃度常有所差異，若濃度太高或時機不合適則會抑制植物生長（謝和柳, 2006）。植物生長調節劑是植物組織培養中影響形態發生的重要因素之ㄧ，在人蔘的形態發生研究中，植物生長素（如 NAA 與 IBA）能夠有利於根及不定根的生成（Tang, 2000）。而細胞分裂素（如 BA）則有利於人蔘試管內芽體的誘導（Lim et al., 1997）。. 1.6 癒傷組織褐化和化學添加物離體培養中最常見問題為癒傷組織褐化，褐化可能發生在繼代培養階段或是分化植株過程中（Das and Pal, 2005; Laukkanen et al. 2000）。褐化是多酚氧化酶（polyphenol oxidase）被活化，使酚類物質氧化成褐色醌類物質，褐化物向外擴散使培養基變成褐色，也會抑制其他酶的活性，影響培植體的脫分化或器官分化，甚至會使大量細胞死亡或整個培植體。褐化除了與品種基死亡（Beruto et al., 1996; Gould and Murashige, 1985）因型、培植體來源、繼代次數有關外，培養基和培養條件都會對褐化有相當影響力。植物材料含高含量的單寧類或多種酚類，易導致培植體嚴重褐化（Espın ́ et al., 1998;）。幼齡部位產生褐化較輕，隨著年齡增長醌類物質增加而褐化程度增加。培養基中添加較高篩選或抑菌抗生素，則易造成培植體褐化（Suzuki and Nakano, 2003）。在黑暗條件下進行培養可減少褐化，主要是無光照或低光環境可抑制酚類物質氧化（He et al., 2009）。添加抗氧化劑或吸附劑可適度控制培植體褐化程度。在培養基中添加活性碳（activated charcoal）可預防或降低化學抑制物對培植體的傷害，進而促進其生長（Pan and van Staden 1998; Thomas 2008）。先前研究 9.

(18) 指出添加抗壞血酸（ascorbic acid）促進生長或是刺激胚狀體形成（Habibi et al., 2009）。添加聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone, PVP）可減緩培植體褐化情況（Raghuvanshi and Srivastava, 1995）。. 1.7 形態發生研究文獻在人蔘的器官發生研究中，以葉柄（Lim et al., 1997）、子葉（Tang, 2000）、葉（Punja et al., 2004）、根（Chang and Hsing, 1980; Choi et al., 2000; Huang et al., 2010）作為培植體，以不同條件培養基誘導癒傷組織形成，再搭配不同植物生長調節劑進行形態發生。以葉柄誘導的癒傷組織，置於 1/2 MS 培養基含 BA 及 GA 3 中，可促使不定芽生成（Lim et al., 1997）；以子葉為培植體促使癒傷組織形成，置於 BA 搭配 NAA 的 SH 培養基中，形成不定芽（Tang, 2000）。此外，將不定根切成薄片，置於含 BSAA 和 kinetin 的 SH 培養基中可誘導出不定根（Langhansova et al., 2012）（見表 1.2）。. 10.

(19) 表 1.1 人蔘皂苷藥用效果（Cho et al., 2006; Hart et al., 2006; Lee et al., 2001; Lee et al., 2013; Shu et al., 2003）人蔘皂苷種類. 藥用效果. Rb1. 促進蛋白質合成、助眠、促進周圍神經細胞再生. Rb2. 降血糖、抗血高脂. Rc. 鎮靜、抑制乳癌細胞、增強精子活力. Rd. 改善心血管疾病、抑制癌細胞、抗衰老. Re. 鎮靜、抗氧化、抗高血脂. Rf. 鎮痛、抑制鈣離子通道、抗過敏. Rg1. 調節血壓、保護缺氧腦組織免受損傷、增強記憶力. Rg2. 抗細胞凋亡、促進記憶力. Rg3. 抑制癌細胞、提高免疫功能. Rh2. 抑制癌細胞、促進白血球增生、調節血壓. 11.

(20) 表 1.2 人蔘組織培養研究之概況 Explant types. Basal. PGRs. In vitro. media Petiole. MS. References. morphogenesis 1 mg/L 2,4-D +. Callus. Lim et al., 1997. 0.1 mg/L kinetin 1/2 MS 1 mg/L BA +. Shoots. 1 mg/L GA 3 Cotyledons. MS. 10 mg/L GA 3. Shoots and roots. Choi et al., 1998. Cotyledons. MS. 2 mg/L BA +. Adventitious buds Choi et al., 1999. 0.1 mg/L IBA Callus. MS. 0.5 mg/L NAA. Adventitious buds Tang, 2000. 0.1 mg/L BA Callus. SH. 0.5 mg/L NAA+ Adventitious buds 0.1 mg/L BA. Root. MS. 1 mg/L 2,4-D +. Callus. Choi et al., 2000. 0.1 mg/L kinetin Root. SH. 5 mg/L IBA. Adventitious roots. Root. MS. 3 mg/L IBA. Adventitious roots Han et al., 2006. Adventitious. SH. 3 mg/L NAA+. Adventitious roots Langhansova et al.,. roots. 0.02 mg/L kinetin SH. 3 mg/L BSAA+. 2012 Adventitious roots. 0.02 mg/L kinetin. 12.

(21) OH HO O OH. H. OH OH. HO. OH. O. O OH. H. H. H. H. HO. H. H. H. O. OH. O HO. HO. OH. OH. H. O. OH. O. OH. O OH. OH. OH Re. Rg1. OH HO. OH HO HO H OH H. HO HO. HO. HO O. HO. O. H. O. OH O. O O H. H. O O. OH. OH OH Rb1. 圖 1.1 人蔘皂苷 Rb1、Rg1 和 Re 結構式（鄭竣亦老師繪製）. 13. OH. O. H. HO O. OH. OH.

(22) 第二章材料與方法 2.1 植物材料本論文試驗所採用之人蔘癒傷組織誘導自新鮮人蔘根部切塊（黃， 2012）。這些癒傷組織共有六組，第五及第六組癒傷組織呈白色些微透明，質地鬆軟的狀況，其餘組別癒傷組織大多呈現淡黃色，質地較為結實（圖 2.1）。. 2.2 培養基、容器及環境基礎培養基為全量 MS（Murashige and Skoog, 1962）培養基，含有 30 g/L 蔗糖（sucrose）、1 g/L 蛋白腖（peptone）及 3 g/L 水晶洋菜（Gelrite），並搭配不同濃度植物生長調節劑及化學添加劑。培養基 pH 以 1 N NaOH 或 1 N HCl 調整至 5.7。培養容器為 150×20 mm 玻璃試管，裝約 10 ml 培養基，再以單層鋁箔紙封口，經高溫（121℃）與高壓（15 psi）殺菌 20 分鐘，取出後斜置。. 2.3 植物生長調節劑植物生長素（auxin）：2,4-dichlorophenoxyacetic acid（2,4-D）、 α-naphthaleneacetic acid（NAA）、indole-3-butyric acid（IBA）；細胞分裂素（ cytokinin ）： thidiazuron （ TDZ ）、 N6-benzyladenine （ BA ）、 N6-furfuryl-adenine（kinetin）。. 2.4 化學添加劑本實驗使用 polyvinylpyrrolidone（PVP）、activated charcoal（AC）、 14.

(23) ascorabic acid（AA），測試濃度分別為 0、50、100 mg/L。. 2.5 人蔘癒傷組織增殖率將繼代所得的癒傷組織取下約 0.1 g（2 × 2 × 2 mm3），置入含原植物生長調節劑組合，並搭配不同濃度化學添加劑的培養基的試管（150 × 20 mm）進行繼代培養，每處理十重複。培養一個月後將癒傷組織取出秤重，紀錄其重量變化。癒傷組織增殖率之計算以最終鮮重扣最初鮮重後，除以初始鮮重。. Proliferation rate =. Final fresh weight - initial fresh weight Initial fresh weight. 2.6 人蔘癒傷組織之試管內形態發生試驗癒傷組織添加不同比例細胞分裂素與植物生長素對其形態發生的影響。以植物生長素（2,4-D、NAA、IBA）和細胞分裂素（TDZ、BA、 kinetin）搭配，以測試植物生長素與細胞分裂素之比例對其形態發生之影響。本試驗選用第一、二、六組的癒傷組織，將癒傷組織取下約 0.2g 做為培植體，分別置入含有不同濃度植物生長素與細胞分裂素之培養基的試管，培養於植物生長箱（22±1℃）光照週期（16 h）培養，每種處理五重複。. 2.7 生物統計分析試驗結果以 Costat 統計軟體分析，處理差異以變方分析（ANOVA），多重比較以鄧肯氏多變域分析（Duncan’s Multiple Range Test, p＜0.05）計算顯著差異性。 15.

(24) 表 2.1 人蔘癒傷組織品系 Callus lines. PGRs (mg/L) 2,4-D. TDZ. 第一組. 0.5. 0.1. 第二組. 0.5. 0.5. 第三組. 1. 0.1. 第四組. 1. 0.5. 第五組. 2. 0.1. 第六組. 2. 0.5. 16.

(25) 第三章結果 3.1 人蔘癒傷組織增殖率第一組（0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ）癒傷組織，對照組平均增殖率 5.78 倍，癒傷組織狀態鮮黃色結實。添加 100mg/L AA 增殖率提高最多 9.17 倍，提高 58％，癒傷組織狀態潮濕金黃色結實。50 mg/L PVP 次之，增殖率提高至 7.71 倍，提高 33％癒傷組織狀態金黃色結實，但處理濃度至 100 mg/L 增殖率為 6.91 倍上升 21％，但無顯著差異（表 3.1、圖 3.1），癒傷組織狀態金黃色結實（圖 3.4）。第二組（0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ）癒傷組織，對照組平均 6.3 倍，癒傷組織狀態金黃色米粒狀。添加 50mg/L AA 增殖率上升最多 13.69 倍，提升 117％，癒傷組織狀態金黃色結實粒狀，但處理濃度至 100 mg/L 增殖率卻下降至 8.67 倍，癒傷組織狀態淡黃色結實粒狀。50 mg/L PVP 次之，增殖率 12.06 倍上升 91％，癒傷組織狀態金黃色結實粒狀，但處理濃度至 100 mg/L 時和 AA 處理情況相同增殖率有明顯下降至 10.06 倍（表 3.2、圖 3.2），癒傷組織狀態淡黃色米粒狀（圖 3.5）。第六組（2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ）癒傷組織：對照組平均 2.27 倍，癒傷組織狀態白色鬆軟；添加 50mg/L PVP 增殖率上升最多增殖率 7.1 倍，上升 213％，癒傷組織狀態白色結實；50 mg/L AC 次之，增殖率 6.17 上升 171％，癒傷組織形態白色結實塊狀；100 mg/L（表 3.3、圖 3.3），癒傷組織形態白色結實塊狀（圖 3.6）。. 17.

(26) 3.2 人蔘癒傷組織之試管內形態發生第一組（0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ）PGR-free 對照組中，癒傷組織逐漸褐化。1 mg/L kinetin + 1 mg/L NAA、1 mg/L kinetin + 3 mg/L NAA 和高濃度 NAA 組別處理二個月後癒傷組織逐漸從金黃色轉成淡綠色（表 3.4、圖 3.7）；置於 kinetin + IBA 組別二個月後，癒傷組織轉綠且成塊狀（表 3.6、圖 3.9）；kinetin + 2,4-D 組別癒傷組織轉綠且成鬆軟狀（表 3.6、圖 3.10）；BA + IBA 組別癒傷組織轉綠且成塊狀（表 3.6、圖 3.10）。添加 100 mg/L PVP 在 PGR-free 對照組二個月後癒傷組織褐化（表 3.5、圖 3.8）；1 mg/L kinetin + 3 mg/L NAA、1 mg/L kinetin + 1 mg/L、0.02 mg/L kinetin + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L kinetin + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L kinetin + 10 mg/L NAA 組別癒傷組織有轉綠情形且為塊狀（表 3.5、圖 3.8）；kinetin + IBA 處理癒傷組織也為綠色塊狀（表 3.5、圖 3.9）。第二組（0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ）PGR-free 對照組中，癒傷組織逐漸褐化（表 3.9、圖 3.12）。1 mg/L kinetin + 3 mg/L NAA 和高濃度 NAA 處理二個月後癒傷組織逐漸從淡黃色轉成淡綠色（表 3.7、圖 3.11）；置於 kinetin + IBA 組別二個月後，癒傷組織為綠色結實狀（表 3.9、圖 3.13）；kinetin + 2,4-D 組別癒傷組織轉綠且成鬆軟狀（表 3.9、圖 3.14）；0.02 mg/L BA + 1 mg/L IBA 組別癒傷組織轉綠且成塊狀（表 3.9、圖 3.14）。添加 100 mg/L PVP 在 PGR-free 對照組二個月後癒傷組織褐化（表 3.8、圖 3.12）；1 mg/L kinetin + 3 mg/L NAA、1 mg/L kinetin + 1 mg/L、0.02 mg/L kinetin + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L kinetin + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L kinetin + 10 mg/L NAA 組別癒傷組織有轉綠情形且為塊 18.

(27) 狀（表 3.8、圖 3.12）；kinetin + IBA 處理癒傷組織也為綠色塊狀（表 3.8、圖 3.13）。第六組（2 mg/L 2,4-D + 0.5）癒傷組織 PGR-free 對照組中，癒傷組織皆逐漸褐化（表 3.10、圖 3.15）。BA + IBA 組別癒傷組織轉綠且成塊狀。以 0.02 mg/L kinetin + 3 mg/L NAA 處理之組別，五個月後平均每個培植體生成 6.34 條根，根長 5.11 公厘（表 3.11、圖 3.16）。. 19.

(28) 表 3.1 第一組人蔘癒傷組織增殖率（AA：ascorabic acid、AC：activated charcoal、 PVP： polyvinylpyrrolidone；Data represent means±SE of three experiments. Means with the same letter are not significantly different (P<0.05)）. Chemical Treatments Explant Proliferation additives. (mg/L). numbers. rate. Control. 0. 10. 5.78±0.22 c*. AA. 50. 10. 5.63±0.19 c. AA. 100. 10. 9.14±0.38 a. AC. 50. 10. 5.6±0.48 c. AC. 100. 10. 4.9±0.44 c. PVP. 50. 10. 7.71±0.59 b. PVP. 100. 10. 6.97±0.14 b. 20.

(29) 表 3.2 第二組人蔘癒傷組織增殖率（AA：ascorabic acid、AC：activated charcoal、 PVP： polyvinylpyrrolidone；Data represent means±SE of three experiments. Means with the same letter are not significantly different (P<0.05)）. Chemical Treatments Explant Proliferation additives. (mg/L). numbers. rate. Control. 0. 10. 6.3±0.19 c. AA. 50. 10. 13.69±0.34 a. AA. 100. 10. 8.67±0.44 b. AC. 50. 10. 6.18±0.22 c. AC. 100. 10. 6.68±0.48 c. PVP. 50. 10. 12.06±1.46 a. PVP. 100. 10. 10.06±0.07 b. 21.

(30) 表 3.3 第六組人蔘癒傷組織增殖率（AA：ascorabic acid、AC：activated charcoal、 PVP： polyvinylpyrrolidone；Data represent means±SE of three experiments. Means with the same letter are not significantly different (P<0.05)）. Chemical Treatments Explant Proliferation additives. (mg/L). numbers. rate. Control. 0. 10. 2.27±0.22 b. AA. 50. 10. 2.25±0.19 b. AA. 100. 10. 2.77±0.02b. AC. 50. 10. 6.17±0.22 a. AC. 100. 10. 2.93±0.57 b. PVP. 50. 10. 7.1±0.48 a. PVP. 100. 10. 3.7±0.85 b. 22.

(31) 表 3.4 Kinetin 與 NAA 對第一組癒傷組織形態發生之影響（二個月） Treatments (mg/L). Explant. Color of. Kinetin. NAA. numbers. callus. 0.02. 1. 5. Brown. 0.02. 3. 5. Brown. 0.02. 10. 5. Green. 0.1. 10. 5. Green. 1. 1. 5. Green. 1. 3. 5. Green. 1. 10. 5. Green. 23.

(32) 表 3.5 植物調節劑和 PVP 對第一組癒傷組織形態發生之影響（二個月） Treatments. Kinetin+NAA. Kinetin+IBA. Cytokinin. Auxin. PVP. Explant. Color of. (mg/L). (mg/L). (mg/L). numbers. callus. 0. 0. 100. 5. Brown. 0.02. 1. 100. 5. Brown. 0.02. 3. 100. 5. Brown. 0.02. 10. 100. 5. Green. 0.1. 10. 100. 5. Green. 1. 1. 100. 5. Green. 1. 3. 100. 5. Green. 1. 10. 100. 5. Green. 0.02. 3. 100. 5. Green. 0.1. 1. 100. 5. Green. 0.1. 3. 100. 5. Green. 24.

(33) 表 3.6 植物調節劑對第一組癒傷組織形態發生之影響（二個月） Treatments. Kinetin+IBA. Kinetin+2,4-D. BA+IBA. Cytokinin. Auxin. Explant. Color of. (mg/L). (mg/L). numbers. callus. 0. 0. 5. Brown. 0.02. 3. 5. Green. 0.1. 1. 5. Green. 0.1. 3. 5. Green. 0.02. 1. 5. Green. 0.02. 3. 5. Green. 1. 1. 5. Green. 1. 3. 5. Green. 0.02. 1. 5. Green. 0.02. 2. 5. Green. 0.1. 1. 5. Green. 0.1. 2. 5. Green. 25.

(34) 表 3.7 Kinetin 與 NAA 第二組對癒傷組織形態發生之影響（二個月） Treatments (mg/L). Explant. Color of. Kinetin. NAA. numbers. callus. 0.02. 1. 5. Brown. 0.02. 3. 5. Brown. 0.02. 10. 5. Green. 0.1. 10. 5. Green. 1. 1. 5. Brown. 1. 3. 5. Green. 1. 10. 5. Green. 26.

(35) 表 3.8 植物調節劑和 PVP 對第二組癒傷組織形態發生之影響（二個月） Treatments. Kinetin+NAA. Kinetin+IBA. Cytokinin. Auxin. PVP. Explant. Color of. (mg/L). (mg/L). (mg/L). numbers. callus. 0. 0. 100. 5. Brown. 0.02. 1. 100. 5. Green. 0.02. 3. 100. 5. Green. 0.02. 10. 100. 5. Green. 0.1. 10. 100. 5. Green. 1. 1. 100. 5. Green. 1. 3. 100. 5. Green. 1. 10. 100. 5. Green. 0.02. 3. 100. 5. Green. 0.1. 1. 100. 5. Green. 0.1. 3. 100. 5. Green. 27.

(36) 表 3.9 植物調節劑對第二組癒傷組織形態發生之影響（二個月） Treatments. Kinetin+IBA. Kinetin+2,4-D. BA+IBA. Cytokinin. Auxin. Explant. Color of. (mg/L). (mg/L). numbers. callus. 0. 0. 5. Brown. 0.02. 3. 5. Green. 0.1. 1. 5. Green. 0.1. 3. 5. Green. 0.02. 1. 5. Green. 0.02. 3. 5. Green. 1. 1. 5. Green. 1. 3. 5. Green. 0.02. 1. 5. Green. 0.02. 2. 5. Brown. 0.1. 1. 5. Brown. 0.1. 2. 5. Brown. 28.

(37) 表 3.10 第六組 BA 與 IBA 對癒傷組織形態發生的影響（二個月） Treatments (mg/L). Explant. Color of. BA. IBA. numbers. callus. 0. 0. 5. Brown. 0.02. 1. 5. Brown. 0.02. 2. 5. Green. 1. 1. 5. Brown. 1. 2. 5. Green. 29.

(38) 表 3.11 第六組 Kinetin 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響（五個月） Treatments (mg/L). Explant. Root. Length. Kinetin. NAA. numbers. number. （mm）. 0.02. 3. 5. 6.34±1.41. 5.11±0.48. 0.02. 10. 5. 0. 0. 0.1. 10. 5. 0. 0. 1. 10. 5. 0. 0. 2.5. 1. 5. 0. 0. 30.

(39) 200. c a. Proliferation rate (%). 150. b c. c. c. 100. b. 50. P m g/ L. PV. PV. P. C. 10. 0. m g/ L 50. m g/ L. A 10. 0. m g/ L 50. m g/ L. A. C. A A. A A 0 10. m g/ L 50. co n. tr ol. 0. 圖 3.1 第一組人蔘癒傷組織增殖率（AA：ascorabic acid、AC：activated charcoal、 PVP： polyvinylpyrrolidone；Data represent means±SEM of three experiments. Means with the same letter are not significantly different (P<0.05)）. 31.

(40) 300. Proliferation rate (%). a. b. 200. a c c. 100. b. c. P m g/ L. PV. PV. P. C. 10. 0. m g/ L 50. m g/ L. A 10. 0. m g/ L 50. m g/ L. A. C. A A. A A 0 10. m g/ L 50. co n. tr ol. 0. 圖 3.2 第二組人蔘癒傷組織增殖率（AA：ascorabic acid、AC：activated charcoal、 PVP： polyvinylpyrrolidone；Data represent means±SEM of three experiments. Means with the same letter are not significantly different (P<0.05)）. 32.

(41) Proliferation rate (%). 400. 300. 200. 100. P m g/ L. PV. PV. P. C. 10. 0. m g/ L 50. 0 10. 50. m g/ L. m g/ L. A. A. C. A A. A. m g/ L. A 0 10. m g/ L 50. co n. tr ol. 0. 圖 3.3 第六組人蔘癒傷組織增殖率（AA：ascorabic acid、AC：activated charcoal、 PVP： polyvinylpyrrolidone；Data represent means±SEM of three experiments. Means with the same letter are not significantly different (P<0.05)）. 33.

(42) a. b. c. d. e. f. g. 圖 3.4 第一組人蔘癒傷組織（bar = 5.0 mm）人蔘根培植體於 a：control；b：50 mg/L AA；c：50 mg/L AC；d：50 mg/L PVP；e：100 mg/L AA；f：100 mg/L AC；g：100 mg/L PVP。. 34.

(43) a. b. c. d. e. f. g. 圖 3.5 第二組人蔘癒傷組織（bar = 5.0 mm）人蔘根培植體於 a：control；b：50 mg/L AA；c：50 mg/L AC；d：50 mg/L PVP；e：100 mg/L AA；f：100 mg/L AC；g：100 mg/L PVP。. 35.

(44) a. b. c. d. e. f. g. 圖 3.6 第六組人蔘癒傷組織（bar = 5.0 mm）人蔘根培植體於 a：control；b：50 mg/L AA；c：50 mg/L AC；d：50 mg/L PVP；e：100 mg/L AA；f：100 mg/L AC；g：100 mg/L PVP。. 36.

(45) a. b. c. d. e. f. g. 圖 3.7 第一組形態發生 kinetin 和 NAA 組別（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：0.02 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA；b：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA；c：0.02 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；d：0.1 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；e：1 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA；f：1 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA；g：1 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA。. 37.

(46) a. b. c. d. e. f. g. 圖 3.8 第一組形態發生 kinetin 和 NAA 組別含 100 mg/L PVP（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：PGRs free；b： 0.02 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA；c：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA；d： 0.02 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；e：0.1 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA； f：1 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA；g：1 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA。. 38.

(47) b. a. c. d. e. f. g. h. 圖 3.9 第一組形態發生 I（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：PGRs free；b： 0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L IBA；c：0.1 mg/L Kinetin + 1 mg/L IBA；d： 0.1 mg/L Kinetin + 3 mg/L IBA；e：PGRs free + 100 mg/L PVP；f：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L IBA + 100 mg/L PVP；g：0.1 mg/L Kinetin + 1 mg/L IBA + 100 mg/L PVP；h：0.1 mg/L Kinetin + 3 mg/L IBA + 100 mg/L PVP。. 39.

(48) b. a. c. d. e. f. g. h. 圖 3.10 第一組形態發生 II（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：0.02 mg/L Kinetin + 1 mg/L 2,4-D；b：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L 2,4-D；c：1 mg/L Kinetin + 1 mg/L 2,4-D；d：1 mg/L Kinetin + 3 mg/L 2,4-D；e：0.2 mg/L BA + 1 mg/L IBA；f：0.2 mg/L BA + 2 mg/L IBA；g：1 mg/L BA + 1 mg/L IBA； h：1 mg/L BA + 2 mg/L IBA。. 40.

(49) 第四章討論 a. b. c. d. e. f. g. 圖 3.11 第二組形態發生 kinetin 和 NAA 組別（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：0.02 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA；b：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA；c：0.02 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；d：0.1 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；e：1 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA；f：1 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA；g：1 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA。. 41.

(50) a. b. c. d. e. f. g. 圖 3.12 第二組形態發生 kinetin 和 NAA 組別含 100 mg/L PVP（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：PGRs free；b： 0.02 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA；c：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA；d： 0.02 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；e：0.1 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA； f：1 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA；g：1 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA。. 42.

(51) a. b. c. d. e. f. g. h. 圖 3.13 第二組形態發生 I（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：PGRs free；b： 0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L IBA；c：0.1 mg/L Kinetin + 1 mg/L IBA；d： 0.1 mg/L Kinetin + 3 mg/L IBA；e：PGRs free + 100 mg/L PVP；f：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L IBA + 100 mg/L PVP；g：0.1 mg/L Kinetin + 1 mg/L IBA + 100 mg/L PVP；h：0.1 mg/L Kinetin + 3 mg/L IBA + 100 mg/L PVP。. 43.

(52) a. b. c. d. e. f. g. h. 圖 3.14 第二組形態發生 II（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：0.02 mg/L Kinetin + 1 mg/L 2,4-D；b：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L 2,4-D；c：1 mg/L Kinetin + 1 mg/L 2,4-D；d：1 mg/L Kinetin + 3 mg/L 2,4-D；e：0.2 mg/L BA + 1 mg/L IBA；f：0.2 mg/L BA + 2 mg/L IBA；g：1 mg/L BA + 1 mg/L IBA； h：1 mg/L BA + 2 mg/L IBA。. 44.

(53) a. c. b. e. d. 圖 3.15 第六組形態發生（二個月）（bar = 5.0 mm）組別 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：PGR-free；b： 0.2 mg/L BA + 1 mg/L IBA；c：0.2 mg/L BA + 2 mg/L IBA；d：1 mg/L BA + 1 mg/L IBA；e：1 mg/L BA + 2 mg/L IBA。. 45.

(54) a. c. b. e. d. 圖 3.16 第六組形態發生（五個月）（bar = 5.0 mm）組別 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：0.02 mg/L Kinetin + 3 mg/L NAA；b：0.02 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；c：0.1 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；d：1 mg/L Kinetin + 10 mg/L NAA；e：2.5 mg/L Kinetin + 1 mg/L NAA。. 46.

(55) 第四章討論 4.1 人蔘癒傷組織增殖率抗壞血酸（ascorbic acid，AA）可被氧氣、過氧化氫或超氧化物氧化成 monodehydroascorbate (MDHA) radicals，而其中的抗壞血酸氧化酶和細胞的生長有關（Gonzalez-Reyes et al., 1995）。試驗結果顯示，第一組（0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ）和第二組（0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ）加入 AA 後，其癒傷組織之增殖率都有明顯提高。固態或液態組織培養添加活性碳（activated charcoal，AC）以用吸附培植體代謝出的有毒物質，但高濃度活性碳可能也吸附植物生長調節劑 BA、IAA、IBA、NAA 和 kinetin（Constantin et al., 1977; Nissen and Sutter, 1990; Weatherhead et al., 1978）。活性碳藉吸附酚類物質防止培養基變色，並使分類氧化酵素和過氧化酶失活，進而提高培植體生存率和器官發生能力（Tisserat, 1979）。第六組（2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ）組別添加 50 mg/L AC，其癒傷組織增殖率提高 171％，但 100 mg/L AC 則使增殖率明顯下降。 2006 年 Nisha Rani 和 Nair 學者指出癒傷組織增殖實驗中無 PVP 處理相較 PVP（polyvinylpyrrolidone）處理褐化情形嚴重。PVP 影響癒傷組織再生主要是因 PVP 會和酚類或一些有毒物質結合，防止培植體褐化（Chang and Yang, 1996）。第一、二、六組別添加 PVP 增殖率都有明顯上升。各種條件誘導癒傷組織適合培養條件有所差異，第一組添加 50 mg/L AA 有最佳增殖率；第二組為添加 50 mg/L AA 或 PVP 可有效提升增殖率；第六組添加 50 mg/L AC 或 PVP 可顯著提升增殖率，為了得到更良 47.

(56) 好生長更快速的癒傷組織，化學添加劑選用是很重要的因素。. 4.2 人蔘癒傷組織之試管內形態發生 2002 年 Visarada 等學者指出癒傷組織若為黃色緊密狀，有再生之能力，而癒傷組織若為白色鬆軟或霜狀，則較不具有再生之能力。本實驗使用三種組別之癒傷組織來進行形態發生，分別是第一組（0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ）、第二組（0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ）和第六組（2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ），第一、二組別生成的癒傷組織呈現淡黃色緊密狀，而第六組別生成的癒傷組織則呈現白色鬆軟狀。在培植體形態發生處理 kinetin 與 NAA 二個月後，高比例誘導不定根形成（Langhansova et al., 2012），而本試驗中第一、二組處理高濃度（10 mg/L）NAA 癒傷組織有綠化發生且為塊狀，卻未觀察到發根情形。可能是癒傷組織誘導條件不同，導致形態發生的情況不盡相同。第六組處理 0.02 mg/L kinetin + 3 mg/L NAA 五個月後，癒傷組織無轉綠，但有不定根生成，每個平均 6.34 條，根長 5.11 公厘。 Langhansova 等學者將培植體處理 0.02 mg/L kinetin + 3 mg/L IBA 兩個月後，平均形成 4.87 條不定根；0.2 mg/L BA + 3 mg/L IBA 形成 1.84 條不定根；，本實驗第一組處理 kinetin + IBA 或 BA + IBA 組別，癒傷組織都有轉綠情形發生，無不定根或是芽生成；第二組處理 kinetin+IBA 組別有轉綠情形，但 BA+IBA 組別只有 0.02 mg/L BA + 3 mg/L IBA 癒傷組織有轉綠。研究指出培養基含有 2,4-D 會抑制不定根形成，但促使癒傷組織生長，因 2,4-D 促進細胞分裂，抑制細胞分化使培植體無法器官發生， 48.

(57) （Bonfill et al., 2002）。本實驗第一、二組 Kinetin+2,4-D 組癒傷組織皆有綠化情形，且為鬆軟狀。 PVP 可吸附培植體分泌的酚類物質，預防培植體和培養基被褐化，提升癒傷組織形態發生機會。先前研究指出添加 PVP 的培養基較無添加 PVP 組別癒傷組織可生成較多不定芽（Jung et al., 2007）。第一、二組 kinetin + NAA 和 kinetin + IBA 有無添加 PVP 對於癒傷組織影響無差異，除了第二組 1 mg/L kinetin + 1 mg/L NAA 處理添加 PVP 後，癒傷組織有綠化情形。植物調節劑對於癒傷組織形態發生比化學添加劑更具影響力。綠色塊狀癒傷組織會形成深綠色斑點，這些斑點生成節點而長成不定根。鬆軟綠色癒傷組織為普遍細胞型態，搭配特定生長調節劑種類和濃度可生成不定根（Omwenga and Isanda, 2004）。本試驗大部分處理條件皆有綠色塊狀癒傷組織形成，kinetin +2,4-D 組別則是鬆軟綠色癒傷組織。本試驗測試了許多植物調節劑和搭配了化學添加劑，但癒傷組織都只有轉綠情形，推測其原因，可能是因培養時間不夠長或是繼代過程某些因素造成癒傷組織的再生能力下降。唯有第六組處理 0.02 mg/L kinetin + 3 mg/L NAA 五個月有不定根生成。理論上，癒傷組織所含人蔘皂苷較根部器官低，故在試管中誘導癒傷組織形成不定根可讓人蔘皂苷累積。本論文誘導第六組癒傷組織形成不定根，成功建立了人蔘癒傷組織之根器官形成系統。. 49.

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