人類同源箱基因TSX1 之功能性探討
Functional Characterization of Human TSX1 Homeobox Gene
中文摘要
同源箱基因(homeobox gene)是一群能夠主導動物胚胎發育的基因，在越複 雜的生物體中，同源箱基因的種類就越具多元性。這些基因的產物皆為基因調控 蛋白，在生物發育過程中扮演著轉錄調節因子(transcription factor)的角色，
來調節發育的過程;它們皆包含一段演化上相當保守的同源區
(homeodomain)，是一段由 60 個氨基酸所組成並可以與 DNA 相結合的功能 區。同源區立體結構上形成helix-turn-helix motif 功能區，此結構在人類以及 原核生物抑制因子 (repressor)上的 DNA 結合區 (DNA binding domain) 幾 乎相同。同源箱基因已被證明在胚胎的發育上扮演極重要的角色，但相較之下，
在幼年或成人器官上的研究較少。我們的研究著注於睪丸的發育與功能，至目前 為止，文獻上探討睪丸與同源箱基因的關係，只知確實有一些同源箱基因表現 在睪丸中，但對於這些基因在睪丸中的功能則是所知有限。我們過去曾利用同源 區中高保留氨基酸序列設計退化引子(degenerate primer)，利用 PCR 的方法，
從人類睪丸cDNA library 中進行分子選殖，找到一個在睪丸專一表現的人類 的同源箱基因-TSX1 (testis-specific homeobox gene)，長度為 1244 bp，
可轉譯出287 個氨基酸的序列，其中包括一個類似 paired-type 的同源區序列。
我們實驗室過去也曾利用反轉錄PCR (RT-PCR)及北方轉漬分析(Northern blot analysis)幾項分析，發現 TSX1 在睪丸具有高度的專一性。在比對基因庫 的基因組序列時，我們發現TSX1 位在染色體 Xq23.1 之位置。基因剔除鼷鼠 ( knockout mice )是目前探討基因在動物體內功能之最直接方法。但我們幾次 篩選鼷鼠基因庫並沒有找到鼷鼠Tsx1 同源基因，再經由 Zoo blot 實驗探討十
二個物種的基因後，我們發現TSX1 只存在人類基因組中，這樣的結果使
TSX1 基因剔除鼷鼠無法進行，因此我們另外建立了 TSX1 轉殖基因鼷鼠以進
一步確認TSX1 大量表現時，在動物體內可能造成之影響。目前以西方轉漬分析
結果發現，在轉殖公鼠睪丸及TG29 第二代轉殖母鼠之輸卵管看到有 TSX1 的 表現，此外也在幾個不同的轉殖母鼠中看到一些有趣的表型(phenotype)，目
前TSX1 基因對轉殖鼷鼠所造成有關生殖方面的影響還無法確定。蛋白質方面的
分析，我們已完成TSX1 蛋白質體構築，將進一步產生抗體並計畫進行免疫組
織化學染色、DNA 結合位置確認試驗及免疫沈澱分析，藉由 in vivo 及 in vitro
的實驗做進一步分析以了解TSX1 在精子成熟過程中可能扮演之角色。
英文摘要
Several lines of evidence suggest that homeobox genes encode transcription factors to regulate developmental events in philologically diverse organisms. To identify novel homeobox genes involved in testis development, we employed a PCR strategy using
homeodomain degenerate primers to screen human testis cDNA libraries. We have isolated a human testis specific homeobox gene, TSX1 (testis-specific homeobox gene). In situ hybridization analysis revealed that TSX1 gene is expressed in
spermatocytes and spermatids during spermatogenesis. Analysis of the phenotypes of TSX1 knockout mice is a straight-forward approach to understand the in vivo function of a gene. We have not been able to isolate mouse Tsx1 ortholog after several times screening of mouse testis cDNA libraries with human TSX1 cDNA as probes. We employed Southern blot analysis by using a 12-species-DNA Zoo blot membrane, and found TSX1 is only present in human genome. Since there is no mouse TSX1 gene for making knockout construct, we therefore generated transgenic mice to further study the effect of TSX1 overexpression in the animal. TSX1 expressions were identified in testis, oviduct and uterus in some of the transgenic lines by Western analysis. We have also found some interesting phenotypes in some of the transgenic mice. Whether these phenotypes are correlated to the TSX1 expression or phenotypes related to reproduction are induced by TSX1 overexpression will need further
analysis. In the study of protein level, we constructed expression plasmids to generate TSX1-fusion protein from the bacteria. TSX1-fusion protein will be used to raise antibody, identify the target-binding site and immunoprecipitate the TSX1-interacting proteins. Results from both in vitro and in vivo studies will further imply the function of TSX1 during spermatogenesis
