國立成功大學「邁向頂尖大學計畫」
延攬優秀人才工作報告表
NCKU’s “Aim for the Top University Project”
Work Report Form for Distinguished Scholars
□續聘continuation of employment ■離職resignation
100 年 7 月 13 日更新 受聘者姓名
Name of the Employee 陳昭中 �男 ■女
Male Female
聘 期 Period of Employment
from 100 年(y) 08 月(m) 04 日(d) to 102 年(y) 07 月(m)31 日(d) 研究或教學或科技研發與
管理計畫名稱 The project title of research,
teaching, technology development and management
藍色螢光蛋白結構解析及其在 有氧及無氧環境中作為生體影 像標識蛋白之應用
計畫主持人
（申請單位主管）
Project Investigator (Head of Department/Center)
許桂森
補助延聘編號
Grant Number HUA - - -
一、 研究、教學、科技研發與管理工作全程經過概述。（由受聘人填寫）
Please summarize the entire research, teaching, or science and technology R&D and management work process (To be completed by the employee)
1. 工作主要內容：利用分子生物技術(易錯 PCR)來改進藍色螢光蛋白亮度，並研究藍色螢光蛋白 作為標識蛋白的應用，同時來開發藍色螢光蛋白在厭氧環境下的應用，並同時協助完成解析 藍色螢光蛋白發光原理。在改進螢光蛋白亮度方面，目前已有進展，同時也開發完成藍色螢 光蛋白在厭氧環境下的應用。先前的研究利用易錯 PCR 以獲得比野生株藍色螢光蛋白更亮 4 倍的突變株命名為 D7，以突變株 D7 為易錯 PCR 的模版進行隨機突變，並將易錯 PCR 獲得的產 物接到 pUC19 質體中轉型至E.coli 經過 24 小時培養後，利用 UV 照射先以肉眼觀察所產生藍 色螢光亮度是否比 D7 亮，若比 D7 還亮進一步進行螢光儀檢測，比較螢光強度是否有差異，
經過數次易錯 PCR 的實驗篩選過數千顆突變株後，得到數 10 顆突變株點以肉眼觀察螢光亮度 比起 D7 更亮，將質體進行 DNA 序列定序後發現在胺基酸中都有不同的突變點產生，如 I14V,R38S,T55A,S177N,K199R,A207T, K137P 等其中有一突變株命名為 D8 比起 D7 更亮，經過 定序分析後發現 D8 比起 D7 有 3 處胺基酸序列之改變（N58Y,A62T,K199R），而此結果也經過 螢光儀檢測證實 D8 比 D7 更亮，再利用 D8 為易錯 PCR 的模版進行隨機突變，獲得一突變株命 名為 D9 其亮度比起 D8 更亮，經過定序分析後發現 D8 比起 D7 有 1 處胺基酸序列之改變（S176Y）。 後續再以 D9 突變株質體作為易錯 PCR 的模版進行隨機突變，篩選了 2 萬顆左右的菌株，首先 以肉眼進行初步篩選出比 D9 突變株更亮或一般亮之突變株約 50 株突變株，但是經過螢光儀 測定後約 45 株之螢光強度都比 D9 突變株低，另外 5 株突變株其螢光強度與 D9 相仿，後經定 序分析這 5 株突變株主要變異是位於第 58、62、176 及 199 胺基酸殘基上，因此後續相關實 驗仍以 D8、D9 突變株為主進行相關之實驗。
2. 開發藍色螢光蛋白為標識蛋白之應用：我們嘗試將 D7 接至真核表現載體 p3Xflag 後送至真核 細胞中表現，其中發現表現效率不佳，考慮此藍色螢光蛋白 DNA 源自海洋弧菌(Vibrio
vulnificus)推測可能有 codon usage 的問題，因此我們進行密碼子的置換，置換成哺乳類細 胞所使用的密碼子再送入細胞觀察，經過密碼子轉換後發現更改密碼子適合在哺乳細胞中使 用的 D7（命名為 mD7）比為經過轉換 D7 在哺乳細胞中螢光強度來得亮，更進一步我們將 D8 突變株也經過密碼子轉換(mD8)，在哺乳細胞中的亮度也比 mD7 亮，因此初步證實藍色螢光蛋 白的確可以作為摽識蛋白。由於作為標識蛋白必須對於細胞是無害的，針對此點進行藍色螢 光蛋白對細胞毒性測試，首先測試藍色螢光蛋白對於細胞生長的影響，將藍色螢光蛋白與市 售綠色螢光蛋白及空質體分別轉染至細胞中，轉染後連續 3 天利用 MTT 分析存活率的差異，
MTT 分析得知藍色螢光蛋白與市售之綠色螢光蛋白相類似對於細胞生長並無影響。由於藍色螢 光蛋白是藉由 NADPH 結合而產生螢光，NADPH 在生理上負責參與在 Pentose Phosphate Pathway 以及當作氧化還原反應中的還原劑，在生理上是相當重要，為了解送入藍色螢光蛋白對於細 胞有何影響進一步分析細胞中 NADPH 的濃度，藍色螢光蛋白與市售綠色螢光蛋白及空質體分 別轉染至細胞中，以空質體作為控制組，藍色螢光蛋白與市售綠色螢光蛋白作為實驗組比較，
利用 OD450去偵測 NADPH 的濃度，其結果可以看到不論是控制組或藍色螢光蛋白與市售綠色螢 光蛋白的 NADPH 濃度並沒有太大的差異，所以藉由 MTT assay 與 NADPH assay 的兩組分析方 法可以確定藍色對於細胞是沒有毒性的。
3. 藍色螢光蛋白在做為蛋白質標識作用之應用：評估藍色螢光蛋白是否與市售螢光蛋白一樣可 作為細胞影像或是作為一個 fusion protein 的使用，我將藍色螢光蛋白與不同蛋白進行 fusion 來評估藍色螢光蛋白在蛋白質標識上的應用，分別將藍色螢光蛋白接上 actin、tubulin 及 4E-BP3 蛋白後送入細胞中來觀察螢光表現，接上 Actin 與 Tubulin 的結果發現螢光表現較 弱，而接上 4E-BP3 後螢光表現較為正常，推測可能是結構上的問題，actin 與 tubulin 的分 子量較大而 4E-BP3 是屬於較小的蛋白質，藍色螢光蛋白是偏向形成雙體方式去結合 NADPH，
因此作為標記的蛋白如果分子量太大可能會干擾藍色蛋白螢光結合上 NADPH，要解決此問題有 兩種方法，一為增加藍色螢光蛋白與融合蛋白之間的距離，可以藉由增加 linker 長度來達到，
另一方法為改良藍色螢光蛋白藍色螢光蛋白變成單體的形式，根據過去的報導，紅色螢光蛋 白 DsRED 原本是四聚體的形式利用人工突變方式成功的改良成單體形式的紅色光蛋白，因此 將藍色螢光蛋白從雙體改變成單體可與蛋白質結構實驗室進行合作來達到改良藍色螢光蛋白 變成為單體的目的，也是後續計畫努力的目標。
4. 藍色螢光蛋白在厭氧環境下的應用評估：市售綠色螢光蛋白與其衍伸而成的螢光蛋白家族，
其發光機制是由發光基團經由一些化學反應與氧化作用形成一個成熟的結構，而氧氣濃度是 影響螢光蛋白成熟的重要因子，我們的藍色螢光蛋白的發光機制則是透過結合上 NADPH 去放 大內生性螢光，過程並不需要氧氣的參與，我們推測也許藍色螢光蛋白可以應用在厭氧的環
境，所以我們想要了解藍色螢光蛋白與其他市售螢光蛋白如綠色螢光蛋白、藍色螢光蛋白
（Azurite）與黃色螢光蛋白在厭氧環境下的螢光表現，我們首現在細菌中來分析這些蛋白在 厭氧環境下載細菌中表現後其螢光強度的變化，因此我將上述螢光蛋白接到 pET21B 質體上，
送到E.coli BL21(DE3)加入 IPTG 誘導蛋白產生，將細菌放置厭氧環境，等待 4-6 小時候蛋白 質被誘導產生，分別利用螢光營及螢光顯微鏡來觀察螢光蛋白之螢光表現，發現市售之綠色 螢光蛋白及其衍生之螢光蛋白（藍色螢光蛋白 azurite 及黃色螢光蛋白）螢光表現急遽下降 而我們的藍色螢光蛋白雖略有下降但還保有 85％螢光亮度.。另一方面也分析了此螢光蛋白在 哺乳細胞中厭氧環境下的應用，將藍色螢光蛋白與市售綠色營蛋白及其衍生之藍色螢光蛋白 Azurite 及黃色螢光蛋白轉染入細胞，把細胞並放入 Modular incubator chamber 並灌入 94 % N2混合 5 % CO2氣體以模擬厭氧環境，放入培養箱 24 小時之後以螢光顯微鏡拍攝，每一種螢 光蛋白的 Normoxia 與 Hypoxia 組別是以相同的曝光時間所拍攝，其結果可以看到藍色螢光蛋 白不論是在 Normoxia 或是 Hypoxia 的環境中可以表現藍色螢光，市售綠色營蛋白及其衍生之 藍色螢光蛋白 Azurite 及黃色螢光蛋白只有在 Normoxia 的情況下才能發出螢光，Hypoxia 的 環境下無法觀察到螢光，這個現象符合螢光蛋白發光機制需要氧氣的原理，然而 GFP 這一類 的螢光蛋白在厭氧下無法看到螢光是否有可能為蛋白質表現的問題，因此我們利用 SDS-PAGE 分析 dBP6 與其他螢光蛋白在有氧/無氧環境中蛋白質表現的情況，結果 dBP6 與其他螢光蛋白 Azurite、EGFP 與 YFP 不管在有氧/無氧環境下都有表現其蛋白質，但在厭氧環境下表現的蛋 白質量比正常環境來的少，推測可能是因為厭氧環境對細胞來說是生長不好的環境，在蛋白 質合成的量就會減少。
5. 藍色螢光蛋白在 FRET 上的應用：利用螢光儀的分析已知藍色螢光蛋白的放射波長約為 435 nm，而綠色螢光蛋白（pEGFP）的激發波長為 488 nm，兩者的波長很接近，也許藍色螢光蛋白 的放射波長可以激發 EGFP，因此在 FRET 的應用上想要測試 藍色螢光蛋白是否可以作 EGFP 的配對，首先我們將藍色螢光蛋白與 EGFP 以 10 個胺基酸( GSGSGDEVDG )組成的 linker 相連 並在之中設計 caspase-3 辨認切位，將 2 個螢光蛋白以此 linker 連接在一起並且命名為 mBcg，在成功建立此 construct 之後，接下來就要確定此 construct 是否可以在細胞中表現，
我們把綠色螢光蛋白（pEGFP）、藍色螢光蛋白與 mBcg 等不同質體送入到不同的哺乳類細胞 H1299、MCF7 與 A549 中表現，利用螢光顯微鏡拍攝，以藍光激發 pEGFP-N1，可以看到在不同 的細胞都可以看到綠光，接下來以 UV 激發，可以看到藍色螢光蛋白可以在不同的哺乳類細胞 中表現並產生藍色的螢光，另外，以 UV 激發 mBcg 可以看到綠光，表示激發藍色螢光蛋白產 生藍色螢光可以把能量傳給 EGFP，代表有 FRET 的現象產生。在先前的設計圖中有提到在 linker 中有 caspase-3 的辨認切位，所以接下來我們在蛋白質的部分先測試 mBcg 是否可以 被 caspase-3 所切割，利用 Quick Coupled Transcription/Translation Systems 直接做出 蛋白質，從一開始的 DNA 轉錄開始，合成出 mRNA 之後，再透過轉譯作用把蛋白質合成出來，
其實驗結果在未加入 caspase-3 這一組可以看到約在 55 kDa 附近有偵測到蛋白質的訊號，而 加入 caspase-3 後會得要 26Kda 大小蛋白，確定了 mBcg 的體外合成是沒有問題。mBcg 的確 可以被 caspase-3 所切割，接下來我們要去驗證這個結果是否也可以在細胞中被看到，在此實 驗中所加入的藥物是 Staurosporine，Staurosporine 是一種 antibiotic ，透過抑制 ATP 的結合 而抑制 protein kinase 的活性，在過去的研究中已知 Staurosporine 所造成的細胞凋亡主要是透 過活化 caspase-3 這條訊號傳遞路線，所以我們也利用加入 Staurosporine 誘導 caspase-3 的活 化。首先將綠色螢光蛋白（pEGFP）、藍色螢光蛋白與 mBcg 等不同質體送入細胞中表現，在 flag-mBcg 這兩組中，加入 DMSO 當作控制組，而實驗組則加入1 μM Staurosporine 作用 6 小 時後，利用螢光顯微鏡拍攝，先以藍光、UV 激發 mBcg 控制組的結果可以看到在 UV 的激發 下可以看到 GFP 的訊號，表示有 FRET 的現象產生，而在實驗組因加入 Staurosporine 而活化 caspase-3，細胞內活化的 caspase-3 切割了 mBcg 中的 linker，在 UV 激發下觀察到大部分的藍 色螢光但仍有少量的綠光，被切割之後 dBP6 與 GFP 兩個螢光蛋白分開，兩者之間的距離變 遠，藍色螢光無法把能量傳遞給 EGFP 導致 FRET 的現象消失，此實驗證實藍色螢光蛋白應 用在 FRET 上可作為綠色螢光蛋白能量的供應者。
6. 開發並改良可與藍色螢光蛋白作為配對蛋白之螢光蛋白:LOV (Light Oxygen and Voltage domains)螢光蛋白改良而來，追朔到 LOV 螢光蛋白，最早是發現於植物 Phototropins 當中的 高度保留的序列，含有 LOV1、LOV2 及激酶結構域(kinase domain)，在植物(plants)、真菌 (fungi)、藻類(algea)及細菌(bacterium)中都可以發現。當中的 LOV 結構域，屬於一種藍光受器，
LOV1 結構域在光照後會使整個光受器形成雙聚體(dimer)，而 LOV2 結構域扮演的角色則較 清楚，在植物當中原始功能為藉由光來啟動或是關閉特定系統，如植物氣孔的開關、向光性 等，來調節植物的生理，以達到恆定(homeostasis)的狀態。
LOV 是一個由 148 個胺基酸所組成的螢光蛋白，其在 UV 及藍光激發下，能夠產生綠色的螢 光 (~510 nm) ， 由 先 前 文 獻 指 出 ， LOV 螢 光 蛋 白 的 發 光 需 要 藉 由 輔 因 子 FMN(Flavin monomeucleotide)的結合，在 E. coli 系統中表現後，可以在無氧環境下產生螢光。而截至目前，
LOV 還未運用於哺乳類細胞，有報導指出植物中的 LOV 在經過 DNA 重排(DNA shuffling)改 良後，找到了螢光強度較強且為 LOV 的單體(monomer)螢光蛋白，命名為 iLOV，並且可以做 為在植物當中 GFP 的替代螢光蛋白。iLOV 單體螢光蛋白在應用上則更加的有利，可避免產 生非專一性結合(non-specific binding)和凝聚現象(aggregation)，及在結果判讀上更加精確，是 一有潛力在哺乳類細胞當中在無氧環境下應用的螢光蛋白。因此主要工作是來改良並測試 iLOV 螢光蛋白是否可在哺乳類細胞中產生螢光。目前以完成 iLOV 密碼子轉換成哺乳類動物密 碼子工作，證實可在 H1299 細胞中表現，同時也證實此 iLOV 可在厭氧下產生螢光。
7. iLOV 螢光蛋白基本色性分析: iLOV 發光機制是利用 FMN 做為結合輔因子24，而研究也有指 出 FMN 為細胞中許多氧化還原酵素不可或缺的一個氧化還原因子，若大量表現 iLOV 螢光蛋 白可能會因為結合 FMN，造成細胞氧化壓力，產生毒性。由先前文獻指出乳酸脫氫酵素 (lactate dehydrogenase, LDH)可以做為細胞毒性的一個指標，LDH 是一個穩定的存在細胞質中的酵 素，分布在整顆細胞中，當細胞膜產生受損、毒性傷害時，便會釋出細胞到胞外，藉由測量 培養液中 LDH 含量可以知道細胞損傷情形，即利用將培養液中存在的 LDH 氧化成丙酮酸 (pyruvic acid)，而染劑會由黃色的四唑氮鹽(Tetrazolium)變成紅色的 Formazan，測量吸光值判 定 LDH 多寡。我將 p3x-Flag、Flag-GFP、Flag-dBP6、Flag-iLOV 四個質體，利用細胞轉染方 式送入 H1299 細胞，以 p3x-Flag 為 vector only 的 negative control，並以加入 2% Triton X-100 的培養液做為 positive control，經過適當時間培養過後，取培養液離心後加入染劑測量，以 O.D.490測量其吸光值，由結果顯示轉染 p3x-Flag、Flag-GFP、Flag-dBP6、Flag-iLOV 四個質 體的細胞結果都類似，證實 iLOV 確實無細胞毒性。
8. iLOV 螢光蛋白在做為蛋白質標識作用之應用：自螢光表現系統法展以來，螢光蛋白最常被用 來做為標定細胞中蛋白作用的位置，此一蛋白標定技術也成為螢光蛋白必須具備的能力之 一。為了要了解 iLOV 做為一個螢光蛋白是否具有融合蛋白的能力，及是否能夠正確表現在 細胞當中的正確位置，以 p3x-Flag 為載體，我將 iLOV 分別以 linker 接上 Actin、Tubulin、eIF4e 及核蛋白 H2B，利用兩次 PCR 的方式得到完整片段接上載體，並將 Actin、Tubulin 及 eIF4e 設計接在 iLOV 的 N 端，H2B 接在 iLOV 的 C 端，此一方式也可以確定 iLOV 是否能夠像 GFP 一樣，能夠在 N 端及 C 端皆能夠成功表現。成功建立了 Flag- Actin-iLOV、Flag-Tubulin-iLOV、
Flag-eIF4e-iLOV 及 Flag -iLOV-H2B 四個質體，以轉染方式分別送入 H1299 細胞表現，在顯 微鏡下以藍光激發，觀察其發光位置是否正確，結果顯示 iLOV 確實能夠做為一個融合蛋白，
並且也萃取細胞中的蛋白以西方墨點法確定蛋白表現量及大小，Flag-iLOV-Actin 大小約 60 kDa，Flag-iLOV-Tubulin 大小約 68 kDa，Flag-iLOV-eIF4e 大小約 42 kDa，Flag-H2B-iLOV 大 小約 27 kDa，結果顯示無論是分子量較大的蛋白、核蛋白或是融合蛋白接在 iLOV 的 N 端或 C 端，iLOV 皆能夠表現，並且蛋白表現大小正確無誤。
9. 藍色螢光蛋白與 iLOV 在 FRET 上的應用評估：從螢光光譜結果可知藍色螢光蛋白散射波長與 iLOV 螢光蛋白激發波長具有重疊特性，可知 2 者有作為 FRET 配對蛋白之潛力，因此將利用 10 個胺基酸( GSGSGDEVDG )組成的 linker 相連並在之中設計 caspase-3 辨認切位，將 2 個螢 光蛋白以此 linker 連接在一起來評估是否能夠作為 FRET 配對蛋白，目前已將此質體建構完 成，並送入細胞中進行觀察，但是 iLOV 螢光蛋白螢光之強度與穩定度還不足以利用螢光顯微 鏡拍攝到螢光，因此改利用螢光測定儀來監測當給予藍色螢光蛋白之激發波長時是否能夠偵
測到 LOV 之散射波長，因此我將 BFP-iLOV pair DNA 接到 pET21b 質體中，送入 E.coli BL21 中利用 IPTG 將蛋白誘導產生後，利用螢光測定儀給予 BFP 之激發波長來測定是否產生 iLOV 散射波長，測定結果的確測到了 iLOV 之散射波長，證明 BFP/iLOV 可以作為 FRET 之配對蛋白。
10.利用分子生物技術(易錯 PCR)來改進 iLOV 螢光蛋白亮度：iLOV 螢光蛋白之強度及蛋白穩定度 都偏低，在應用上實用性就更低了，為了改進此問題因此利用易錯 PCR 方式來改進其螢光強 度，但目前並未篩選到更亮之 iLOV 突變株。
二、研究或教學或科技研發與管理成效評估（由計畫主持人或單位主管填寫）
Please evaluate the performance of research, teaching or science and technology R&D and management Work: (To be completed by Project Investigator or Head of Department/Center)
(1)是否達到延攬預期目標？
Has the expected goal of recruitment been achieved?
是。
(2)研究或教學或科技研發與管理的方法、專業知識及進度如何？
What are the methods, professional knowledge, and progress of the research, teaching, or R&D and management work?
專業知識佳，工作態度良好，實驗進度佳。
(3)受延攬人之研究或教學或科技研發與管理成果對該計畫(或貴單位)助益如何？
How have the research, teaching, or R&D and management results of the employed person given benefit to the project (or your unit)?
有所助益。
(4)受延攬人於補助期間對貴單位或國內相關學術科技領域助益如何？
How has the employed person, during his or her term of employment, benefited your unit or the relevant domestic academic field?
有所助益。
(5)具體工作績效或研究或教學或科技研發與管理成果：
Please describe the specific work performance, or the results of research, teaching, or R&D and management work:
成效良好。
(6)是否續聘受聘人? Will you continue hiring the employed person? □續聘Yes ■不續聘No
※ 此報告表篇幅以三～四頁為原則。This report form should be limited to 3-4 pages in principle.
※ 此表格可上延攬優秀人才成果報告繳交說明網頁下載。
This report form can be downloaded in http://scholar.lib.ncku.edu.tw/explain/
