免疫沉澱法搭配質譜技術對前列腺癌特異性抗原前體異構物定量分析以改善前列腺癌之偵測

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(1)國 立 臺 灣師 範 大學 化 學系研 究 所 碩士論文 Department of Chemistry, National Taiwan Normal University Master Thesis. 免疫沉澱法搭配質譜技術對前列腺癌特異性抗原前體異構物 定量分析以改善前列腺癌之偵測 Quantitative analysis of precursor prostate specific antigen isoforms to improve prostate cancer detection by immunoprecipitation and mass spectrometry 研究生:段立平. 撰. Graduate Student: Li-Ping Tuan 指導教授:陳頌方 博士 Advisor: Sung-Fang Chen, Ph.D. 中華民國一百零二年七月 July, 2013.

(2) 謝誌 時光飛逝,研究所兩年生涯看似不長,充實的研究生活終將結束,由衷感謝 陳頌方教授在這有限的時間中竭盡所能地教導我們,不僅在專業領域上,每當老 師您的學生一天,老師的學識淵博總是讓我們為之驚嘆,追求新知的態度是我們 永遠要學習的榜樣;在待人處事上老師也讓我們了解到一個人的原則及團隊團結 合作的重要性,在此感謝老師對學生的諄諄教誨,使我們成為更專業且更具競爭 力的人。另外在這裡要特別感謝長庚大學陳怡婷博士細心教導質譜 MRM 相關知 識及實驗分析等技巧。 此外還要感謝實驗室許多人的幫忙與照顧,謝謝芷葳學姊,妳總是耐心教導 我們實驗及質譜相關知識,細心地幫我們一起分析以及解決遇到的難題,有如我 們的定心丸;謝謝沛倫學長,有你專業的軟體教導真的收益良多,也謝謝你每次 出遊的帶領與陪伴;謝謝德蕙學姊、育廷、昀諭學長,因為你們開朗活潑沒有架 子的帶領,讓我們很快地加入這個快樂的大家庭,也謝謝你們實驗技巧的傳授, 讓我們能更快步上軌道;郡倫學姊,實驗室有妳就歡樂不斷,喜歡妳每次的揪團 與趣事分享;俞靜學姊,同為不會台語的人,每次聽到妳有趣的發音都覺得很有 趣,喜歡妳大方的個性及時尚的穿著;子瑋學長,雖然你常在實驗室破壞我的形 象,但你專業的手作咖啡實在令人懷念;珮琳,實驗室有妳這個好夥伴一起努力 從不覺得無聊,總是可以輕鬆與妳分享生活大小事;堯聰,有你一起在質譜室奮 鬥總是讓人安心不少;群皓,謝謝您這位 3C 小王子使我的實驗室生活更加智慧 及有趣;佳穎、羽薇、祖儀、昀昇,謝謝你們平常細心的幫忙以及為實驗室帶來 輕鬆歡樂的氣氛。 另外要感謝長庚大學陳筱葳學姐多次在實驗上協助及質譜操作的幫助。感謝 口試委員黃瑞雯博士及周民元博士百忙中參加學生我的口試審查,並不吝惜給予 寶貴的建議與指教,使論文更臻完善。最後我要感謝我親愛的家人,沒有他們的 支持與鼓勵就沒有今天的我,謝謝大家。 I.

(3) 目錄 目錄 ............................................................................................................ II 圖目錄 ........................................................................................................ V 表目錄 ..................................................................................................... VIII 縮寫 ........................................................................................................... IX 中文摘要 ................................................................................................... XI Abstract .................................................................................................... XII 第一章. 序論 ............................................................................................ 1. 1.1 前言 ............................................................................................ 1 1.2 前列腺癌概述 ............................................................................. 2 1.3 前列腺癌的診斷 .......................................................................... 3 1.4 前列腺特異性抗原 ...................................................................... 5 1.4.1 游離 PSA 與總 PSA 的比值 ..................................................... 7 1.4.2 前列腺特異性抗原前體 ............................................................ 7 1.5 質譜技術 ..................................................................................... 8 1.6 質譜多反應監測技術之原理與特點 (multiple reaction monitoring) ................................................................................................. 14 1.7 基於 MRM 質譜技術的研究技術 ............................................... 16 1.7.1. 預置 MRM 數據採集模式 (schedule MRM, sMRM) .............. 16. 1.7.2 穩定同位素稀釋法 (stable isotope dilution, SID) .................. 17 1.8 MRM 技術在蛋白質體學研究領域的應用 ................................. 18 1.8.1 MRM 技術在後轉譯修飾研究中的應用 .................................. 18 1.8.2 MRM 技術在疾病生物標誌物驗證中的應用 ........................... 18 II.

(4) 1.8.3 MRM 技術在定量蛋白質體學研究中的應用 ........................... 20 1.9 蛋白質純化策略 ........................................................................ 21 1.10 實驗動機 ................................................................................. 23 第二章. 實驗材料 .................................................................................... 25. 2.1 樣品 .......................................................................................... 25 2.2 藥品 .......................................................................................... 25 2.3 試劑 .......................................................................................... 27 2.4 耗材 .......................................................................................... 27 2.5 儀器設備 ................................................................................... 27 第三章. 實驗方法 .................................................................................... 29. 3.1 微透析 ...................................................................................... 29 3.2 使用免疫沉澱策略純化血清樣品............................................... 29 3.3 使用免疫親和去除策略純化血清樣品 ....................................... 32 3.4 胜肽樣品使用 Oasis® HLB 96-well µ–elution plate 去鹽濃縮 .. 33 3.5 蛋白質樣品使用 Amicon® Ultra 去鹽濃縮 ................................. 34 3.6 蛋白質濃度測定 ........................................................................ 34 3.7 蛋白質水解 ............................................................................... 35 3.8 一維膠體電泳 ........................................................................... 36 3.8.1 膠體銀染 ................................................................................ 37 3.9 奈米級液相層析電噴灑游離串聯式質譜 .................................... 38 3.9.1 奈米級液相層析 ..................................................................... 38 3.9.2 電噴灑游離串聯式質譜 .......................................................... 40 3.9.3 資料分析 ................................................................................ 41 第四章. 結果與討論 ................................................................................ 44. 4.1 免疫沉澱純化蛋白質策略實驗條件優化 .................................... 44 III.

(5) 4.1.1 實驗使用之 vial ...................................................................... 45 4.1.2 實驗使用之 washing buffer .................................................... 46 4.1.3 實驗使用之 elute buffer ......................................................... 46 4.2 PSA 胜肽選擇與 MRM 條件優化 .............................................. 47 4.3 使用免疫沉澱法搭配 LC-MRM-MS 偵測血清樣品中 proPSA ... 48 4.4 使用免疫親和去除策略搭配 LC-MRM-MS 偵測血清樣品中 proPSA ..................................................................................... 51 第五章. 結論與未來展望 ......................................................................... 53. 附圖 .......................................................................................................... 55 附表 .......................................................................................................... 99 參考文獻 ................................................................................................ 108. IV.

(6) 圖目錄 圖 一、前列腺特異性抗原 (PSA) 在正常與癌症前列腺上皮細胞中生物合成 的模型。 ........................................................................................ 55 圖 二、PSA range 4~10 ng/mL 下,前列腺癌症患者血清中游離 PSA 不同 分子形式的平均百分比分佈圖。 .................................................. 56 圖 三、前列腺特異性抗原 (PSA) 不同分子形式形成流程圖。 ............... 57 圖 四、MRM 質譜操作模式示意圖 .......................................................... 58 圖 五、血漿中的 70 個蛋白質分析物含量的參考區間圖 .......................... 59 圖 六、免疫沉澱法原理示意圖 ................................................................ 60 圖 七、免疫親和去除法實驗流程示意圖 .................................................. 61 圖 八、電噴灑游離法 (ESI) 之原理示意圖 ............................................. 62 圖 九、QTRAP® 5500 質譜儀構造示意圖 ............................................... 63 圖 十、胜肽離子碎片命名 ....................................................................... 64 圖 十一、免疫親和去除策略層析圖 ......................................................... 65 圖 十二、免疫親和去除策略層析圖 ......................................................... 66 圖 十三、牛血清白蛋白之標準曲線圖 ..................................................... 68 圖 十四、加入前列腺特異性抗原前體標準品之血清樣品經免疫沉澱法的洗 脫收集液之一維膠體電泳銀染結果圖。 ................................... 69 圖 十五、加入前列腺特異性抗原前體標準品之血清樣品經免疫沉澱法的洗 脫收集液之一維膠體電泳銀染結果圖。 ................................... 70 圖 十六、加入前列腺特異性抗原前體標準品之血清樣品經免疫沉澱法的洗 脫收集液之一維膠體電泳銀染結果圖。 ................................... 71 圖 十七、加入前列腺特異性抗原前體標準品之血清樣品經免疫沉澱法的洗 脫收集液之一維膠體電泳銀染結果圖。 ................................... 72 V.

(7) 圖 十八、加入前列腺特異性抗原前體標準品之血清樣品經免疫沉澱法的洗 脫收集液之一維膠體電泳銀染結果圖。 ................................... 73 圖 十九、Mascot 搜尋結果 ...................................................................... 74 圖 二十、[-5] proPSA 代表胜肽 LILSR 的 MS/MS 圖譜 .......................... 75 圖 二十一、[-7] proPSA 代表胜肽 APLILSR 的 MS/MS 圖譜 .................. 76 圖 二十二、PSA 代表胜肽 LSEPAELTDAVK 的 MS/MS 圖譜 ................ 77 圖 二十三、實驗總流程圖 ....................................................................... 78 圖 二十四、MRM 分析結果圖 ................................................................. 79 圖 二十五、Extracted ion chromatograms of transition monitored for LILSR derived from PSA with immunoprecipitation of serum. ............................................................................................. 80 圖 二十六、Extracted ion chromatograms of transition monitored for APLILSR derived from PSA with immunoprecipitation of serum. .................................................................................. 81 圖 二十七、Extracted ion chromatograms of transition monitored for APLILSR derived from PSA with immunoprecipitation of serum. .................................................................................. 82 圖 二十八、Extracted ion chromatograms of transition monitored for LSEPAELTDAVK derived from PSA with immunoprecipitation of serum. .............................................................................. 83 圖 二十九、[-5] proPSA 之標準曲線圖 .................................................... 84 圖 三十、[-7] proPSA 之標準曲線圖 ....................................................... 85 圖 三十一、PSA 之標準曲線圖 ............................................................... 86 圖 三十二、PBS buffer 樣品未經免疫沉澱純化步驟之[-5] proPSA 標準曲線 圖 ......................................................................................... 87 VI.

(8) 圖 三十三、PBS buffer 樣品未經免疫沉澱純化步驟之[-7] proPSA 標準曲線 圖 ......................................................................................... 88 圖 三十四、PBS buffer 樣品未經免疫沉澱純化步驟之 PSA 標準曲線圖 . 89 圖 三十五、血清樣品未經免疫沉澱純化步驟之[-5] proPSA 標準曲線圖 . 90 圖 三十六、血清樣品未經免疫沉澱純化步驟之[-7] proPSA 標準曲線圖 . 91 圖 三十七、血清樣品未經免疫沉澱純化步驟之 PSA 標準曲線圖 ............ 92 圖 三十八、Extracted ion chromatograms of transition monitored for LILSR derived from PSA with IP and immunoaffinity depletion of serum. .............................................................. 93 圖 三十九、Extracted ion chromatograms of transition monitored for APLILSR derived from PSA with IP and immunoaffinity depletion of serum. .............................................................. 94 圖 四十、Extracted ion chromatograms of transition monitored for LSEPAELTDAVK derived from PSA with of serum. ................ 95 圖 四十一、比較免疫沉澱與免疫親和去除兩種純化蛋白質方法之[-5] proPSA 標準曲線圖 .............................................................. 96 圖 四十二、比較免疫沉澱與免疫親和去除兩種純化蛋白質方法之[-7] proPSA 標準曲線圖 .............................................................. 97 圖 四十三、比較免疫沉澱與免疫親和去除兩種純化蛋白質方法之 PSA 標準 曲線圖 .................................................................................. 98. VII.

(9) 表目錄 表 一、免疫親和去除法液相層析梯度表 .................................................. 99 表 二、優化 MRM transitions 及 MRM 掃描模式連結質譜液相層析梯度表 .................................................................................................. 100 表 三、MRM 質譜掃描模式設定之 transition 參數 ................................ 102 表 四、樣品與標準溶液之蛋白質吸收值、濃度與結合率表 ................... 104 表 五、優化之 MRM transitions 及參數設定.......................................... 106 表 六、使用免疫沉澱法搭配 LC-MRM-MS 定量結果參數表 .................. 107. VIII.

(10) 縮寫 2DE. Two-dimensional electrophoresis. A2M. α2-macroglobulin. ABC. Ammonium bicarbonate. ACN. Acetonitrile. ACT. α-1-antichymotrypsin. APS. Ammonium persulfate. BPH. Benign Prostatic Hyperplasia. BSA. Bovine serum albumin. CI. Chemical ionization. CID. Collisional induced dissociation. CV. Coefficient of variation. DTT. Dithiothreitol. EDTA. Ethylenediaminetetraacetic acid. EI. Electron impact ionization. ELISA. Enzyme linked immunosorbent assay. ESI. Electrospray ionization. FA. Formic acid. FAB. Fast atom bombardment mass spectrometry. iSRM. Intelligent single reaction monitoring. IAA. Iodoacetamide. kDa. kiloDalton. LC-MS/MS. Liquid chromatography tandem mass spectrometry. LOD. Limit of detection IX.

(11) LOQ. Limit of quantitation. milli-Q H2O. Milli-Q systems dispense the water. mTRAQ. MRM tags for relative and absolute quantitation. MALDI. Matrix-assisted laser desorption ionization. MIDAS. MRM-initiated detection and sequencing. MRM. Multiple reaction monitoring. MS. Mass spectrometry. MS/MS. Tandem mass spectrometry. OD595. Optical density at 595 nm. proPSA. Precursor of prostate specific antigen. PCa. Prostate cancer. PFF. Peptide fragment fingerprinting. PMF. Peptide mass fingerprinting. PSA. Prostate specific antigen. PTM. Post-translational modification. rpm. Rotation per minute. sMRM. Scheduled multiple reaction monitoring. SDS-PAGE. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. SID. Stable isotope dilution. SRM. Single reaction monitoring. TEMED. N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine. TFA. Trifluoroacetic acid. X.

(12) 中文摘要 前列腺特異性抗原 (PSA) 是目前最成功且廣泛使用的前列腺癌 (PCa) 血清標誌物。但在重要診斷指標 PSA 濃度 4~10 ng/mL 的範圍內,它具有有限 的能力在區分早期的前列腺癌與良性前列腺增生症 (BPH),缺乏癌症特異性。 近年來研究發現前列腺特異性抗原前體 (proPSA) 與前列腺癌更具相關性。 ProPSA 是血清游離 PSA 的特殊形式,由天然 proPSA 及其各種截斷的亞型組 成,[-2] proPSA、[-5] proPSA 及[-7] proPSA,而其各種截斷的亞型分子已被 發現比天然 proPSA 與癌症有更好的相關性。(不是說不要分段嗎?)多反應監測 質譜技術 (MRM-MS) 近年來頻繁地被應用於測量低含量的組織和生物體液中 的生物標誌物,由於其高靈敏度和高特異性,實驗設計簡單和高度重複性。本 研究建立一套利用免疫沉澱法搭配質譜多反應監測掃描技術之優化方法,檢測 定量血清樣品中 mature PSA、proPSA 及 truncated proPSA ([-5] proPSA), 藉此改善 PSA 對前列腺癌偵測之特異性。由於血清和血漿是目前最複雜的生物 樣品,針對此,我們特別對免疫沉澱步驟當中所使用之實驗用管柱及緩衝溶液 進行優化測試,以達到較高之純化效率,並且使用不同純化策略-免疫親和去除 法比較純化目標蛋白質之效率。實驗結果證明此研究策略可有效純化血清中 proPSA 且定量檢測結果呈現良好之線性關係,proPSA 及 mature PSA 的 R2 >0.99,[-5] proPSA 的 R2 >0.99,偵測極限 (LOD) 和定量極限 (LOQ) 皆可達 到 proPSA 濃度 ng/mL 的範圍內,對應血清中含量最高蛋白質的濃度,濃度低 於 6 個數量級。此外,本研究策略在一次 LC-MRM-MS 實驗分析中可以檢測多 個生物標誌物,包括成熟和前體形式的 PSA。本研究開發此方法提供一個具吸 引力的替代方案,藉由檢測定量血清樣品中 proPSA 及 truncated proPSA 以改 善 PSA 對前列腺癌偵測之特異性。. 關鍵字:前列腺特異性抗原、前列腺特異性抗原前體、截斷前列腺特異性抗原 前體、免疫沉澱法、多反應監測技術、質譜、前列腺癌 XI.

(13) Abstract Prostate specific antigen (PSA) is a widely used serum marker for prostate cancer (PCa). In the critical diagnostic range of 4~10 ng/mL it has limited specificity for distinguishing early PCa from benign prostatic hyperplasia (BPH). More recently, promising data is emerging regarding one precursor form of free PSA, proPSA is associated with PCa. ProPSA is comprised of native proPSA as well as truncated proPSA forms, [-2] proPSA, [-5] proPSA, and [-7] proPSA, which have been shown to be more cancer-associated than native proPSA. Lately, multiple reaction monitoring mass spectrometry (MRM-MS) has been more frequently applied to measure low abundance biomarkers in tissues and biofluids, owing to its high sensitivity and specificity, simplicity of assay configuration, and exceptional multiplexing. In this study,. we. developed. and. optimized. a. method. for. an. immunoprecipitation-based platform and MRM-MS assay capable of sensitive and accurate quantification of proPSA in serum. Since serum and plasma are by far the most complex biological fluids, we also optimized the vials and buffers used in the immunoprecipitation workflow to achieve such a level of sensitivity and compared the efficiency of protein purification with immunoaffinity depletion. The strategy we demonstrated the target proteins can be purified effectively; both limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of proPSA are able to reach nanogram/milliliter range, corresponding to a concentration that is 6-order lower than the concentration of the most abundant proteins in serum with good linearilty. Furthermore, the simultaneous measurement of multiple biomarkers, including the mature and precursor forms of PSA, can be performed in a single multiplexed analysis using LC-MRM-MS.. XII.

(14) We demonstrate that the strategy here provide an attractive alternative for reliably measuring proPSA to improve the detection of PCa.. Keywords: PSA, proPSA, truncated proPSA, immunoprecipitation, multiple reaction monitoring, mass spectrometry, PCa. XIII.

(15) 第一章 1.1. 序論. 前言 人類基因體計劃 (Human Genome Project, HGP) 被譽為人類歷史. 上 的 三 大 科 技 工 程 之 一 , 隨 著 DNA 解 碼 完 成 , 後 基 因 體 時 代 (post-genomic era) 來臨,科學家卻發現人類的基因數目遠低於原先所預 估,只有 20,000~25,000 個基因,約莫與黑猩猩的基因數相當,且基因序 列之相似度居然高達百分之九十九。研究指出,相近物種間的演化差異、 同物種間個體的表現變異、抑或是個人本身不同種細胞生長及分化的不同, 其決定關鍵並不全然掌控於 DNA 序列,而在於基因如何表現,正是由於 基因體裡的 2 萬個基因,在發育的不同階段、不同的組織進行選擇性表達, 從而導致了蛋白質體的千變萬化,進而使其能夠揭示生命是由什麼組成的、 怎樣組成的。簡單的說,基因體學研究可以預測人可能得什麼病,蛋白質 體學研究目的是可以進一步瞭解人為什麼得病,如何治療。因此,研究蛋 白質體學能為重大疾病早期診斷提供標記分子,為藥物研究提供標靶。蛋 白質體學的研究對象是一個在時間和空間上動態變化的整體,具有極端的 複雜性遠超過基因體,人類 30,000 個基因所能表現的蛋白質即可能超過 100,000 個,再加上後轉譯修飾作用 (post-translational modification, PTM),其複雜性難以估計,隨著蛋白質體學研究的深入和發展,尤其是差 異蛋白質體學研究的進展,大量功能蛋白質和潛在疾病蛋白質標誌物被發 現並被鑑定,如何進一步檢測這些蛋白質的含量,以闡明其功能和在疾病 研究中的意義,已變得越來越重要。僅僅依賴蛋白質大規模地分離、鑑定 的技術路徑(二維膠體電泳技術分離蛋白質,質譜技術散彈槍法鑑定蛋白 質)已經不能滿足這些研究的需求,且生物樣品的高度複雜性,具有臨床 1.

(16) 疾病指標意義之生物標誌物往往含量很低,為了尋找微量生物標記,不僅 需要樣品的純化,更高靈敏度和更高選擇性的研究方法更是不可或缺。而 如何有效在生物樣品(血漿或血清等)中快速且靈敏地分析蛋白質或檢測 疾病的生物標誌物的含量,以利於癌症的早期診斷(例如:肝癌,前列腺 癌)或疾病的即時診斷(例如:心肌梗塞因子肌鈣蛋白,流感標誌物等), 逐漸受到更多的關注。. 1.2. 前列腺癌概述 前列腺 (Prostate gland) 又名為攝護腺,目前僅有台灣地區仍普遍使. 用「攝護腺」一詞;中國大陸與日本均已翻譯成「前立腺」。前列腺於西 元 1646 年正式記載於文獻中,因此器官位於膀胱之前,故將之定名 為 pro-state。前列腺癌是男性泌尿系统常見的惡性腫瘤之一。據統計數據 顯示,在美國 2011 年其發病率居第一位,死亡率居第二位。我國前列腺 癌發病率雖明顯低於歐美國家,但近年來隨著我國人們生活水平提高、飲 食習慣改變、診斷技術提高及國人平均壽命延長,前列腺癌發病率在我國 逐年上升,在男性泌尿生殖系统惡性腫瘤中,2003 年其發病率已躍居第 三位。在過去的 20 年中,一半以上患者就診時已是前列腺癌晚期或者已 發生骨轉移而錯過最佳治療時期,導致長期預後不佳。現在這種現象獲得 極大改善,這可能要歸功於前列腺特異性抗原 (prostate specific antigen, PSA)被廣泛用於前列腺癌篩檢,使前列腺癌的早期診斷率有了較大提高, 從而能夠及時進行治療,降低前列腺癌的死亡率。前列腺癌可能是唯一因 生物標誌物而改變腫瘤病程和預後的惡性腫瘤。因此,前列腺癌生物標誌 物的研究引起了眾多學者們的關注。. 2.

(17) 1.3. 前列腺癌的診斷 近年來國人壽命顯著地延長,人口老化後才看到的疾病顯得增加許多。. 其中發生於男性的疾病除良性前列腺增生 (benign prostatic hyperplasia, BPH) 以外,就以前列腺癌較常見,這兩種疾病隨病人年紀增加而明顯地 提高。由於前列腺癌早期症狀與病人發生年齡層皆和良性前列腺增生患者 類似,但兩者治療方式卻完全不同,因此對於年紀在 50 歲以上的男性病 患懷疑有良性前列腺增生合併下泌尿道阻塞現象時,首先應排除前列腺癌 的可能性。前列腺癌發生原因,目前仍不清楚。但發現下列一些因素可能 與之有關,包括有:經濟狀況,家族遺傳,種族差異,抽煙, 飲食習慣, 居住環境,職業,宗教習俗,性行為頻率,輸精管結紮,男性荷爾蒙多寡 與否等。 根據 McNeal 對前列腺的研究 1-3,發現前列腺可分下列幾個重要部份: 1、移形區:為良性前列腺增生好發之部位,2、周邊區:為前列腺癌最好 發之部位,3、中央區:為圍繞射精管部位,但良性前列腺增生與前列腺 癌兩種疾病均較少發生於此區。前列腺癌百分之七十五左右是長在周邊區, 只有百分之三至五長於中央區,另外約百分之十五左右則長於移形區,移 形區正是發生良性前列腺增生之主要部位,這部位靠前方中央所以肛診較 難觸摸,因此臨床上前列腺肥大之病人在接受前列腺切除手術後,其病理 結果顯示為癌症的比率約有百分之十五左右。這類病人大部份屬較早期癌, 治療後預後較好。而長於周邊區的前列腺癌較容易由觸診發現,一般都是 摸到堅硬如石之硬塊,易由病理切片証實。 前列腺癌診斷,並不困難,但在泌尿科門診所發現之前列腺癌病人, 約百分之七十是已擴散他處的晚期病例,使得治療結果大打折扣。造成這 種延誤診斷的原因可能是 (1) 病人早期無症狀,所以沒被注意 (2) 檢查方 法不靈敏,所以較難早期診斷 (3) 第一線非泌尿專科醫師對此疾病,缺乏 3.

(18) 警覺性,未對高危險群病患進行必要之前列腺定期檢查。目前結合血清前 列 腺 特 異 性 抗 原 (PSA) 、 肛 診 (DRE) 與 經 直 腸 前 列 腺 超 音 波 檢 查 (TRUS) 合併超音波定位活體病理切片,已經大大提高早期前列腺癌之檢 測率。 一、 肛診 簡單且不需借助儀器,因此耗費少,但是較不客觀且與檢查者經驗有 很大的關係。. 二、 血清前列腺特異性抗原 (PSA) 這是一種由前列腺腺體上皮細胞所分泌的醣蛋白質,血中正常值濃度 低於 4 ng/mL,前列腺癌或前列腺炎與良性前列腺肥大均能造成 PSA 升高, 臨床上常須配合肛診與經直腸超音波檢查加病理切片作鑑別診斷。臨床上 比較困擾的是 PSA 輕度上升,如 PSA 值介於 4~10 ng/mL 時,常需鑑別 診斷其是良性前列腺肥大或是早期前列腺癌。. 三、 經直腸超音波檢查 利用超音波探頭由肛門置入直腸中靠近前列腺之後方,近距離掃瞄整 個前列腺,兩側儲精曩與膀胱頸之構造,藉此診斷病灶。這樣可以克服肛 檢時最常遇到的缺點─檢查者的主觀性與無法早期偵測顯微或位置靠前、 靠中央之病灶。近年來由於科技進步使得超音波解像力大為提高,更適合 運用於臨床上各種不同部位不同疾病之診斷。 前列腺的分化和預後有很大的關係。早期的前列腺癌如果分化的愈好 (GradeⅠ),經過 15 年後發生骨頭轉移的機會只有 40%,若分化較差 (GradeⅡ或 GradeⅢ),未來發生轉移的機會達到 70~80%,故早期診斷對. 4.

(19) 前列腺癌存活率影響甚大。. 1.4. 前列腺特異性抗原 前列腺特異性抗原 (Prostate Specific Antigen, PSA ),是目前臨床上. 應用最廣泛及最成熟的前列腺癌血清標誌物 4。PSA 是一個分子量大約 33~34 KDa,含有 237 個胺基酸之單鏈醣蛋白,由前列腺上皮細胞分泌產 生,具有絲氨酸蛋白酶活性,屬於激態釋放酶家族蛋白,半衰期大約是 3.15 天。1970 年 Ablin 首先在前列腺組織中發現 PSA 的存在,1971 年 Hara 等人首先發現 PSA 存在於精液中,1979 年 Wang 等人 5 在前列腺組織中 純化 PSA 成功,並證明其具有前列腺組織特異性,因此命名為 PSA。人 類體中少量 PSA 可通過上皮基底膜和前列腺間質擴散進入血清,當罹患 前列腺癌時,PSA 的合成並未增加,但由於上皮基底膜被破壞,屏障消失, 使釋放至血清中 PSA 增加,另外,癌症病變時細胞極性會消失,胞吐作 用可直接將 PSA 分泌至前列腺間質中造成血清中 PSA 增加,如圖一。 PSA 在血清中以不同的分子形式存在,主要以游離形式 (free PSA, fPSA) 和與 protease inhibitor 形成穩定 complex 的結合形式 (complexed PSA, cPSA) 存在,其中 3~35%以游離形式存在,65~95%主要與 α 1 抗 糜 蛋 白 酶. (α-1-antichymotrypsin, ACT) 和 α 2 - 巨 球 蛋 白. (α2-macroglobulin, A2M) 結合 6-9,如圖二。游離型 PSA 主要包括三種形 式:第一種形式為前體形式 PSA (precursor of prostate specific antigen, proPSA),PSA 由前列腺上皮细胞分泌後,除含有成熟 PSA 的 237 個胺 基酸序列外,還包括由 7 個胺基酸组成的 N 端前體多肽段(詳細介紹見 1.4.1 節) ;血清 fPSA 的第二種形式為與良性前列腺增生相關 PSA (benign prostatic hyperplasia-associated PSA, BPSA),BPSA 是一種非活性形式, 為 PSA 的胺基酸序列在 Lys145-146 和 Lys182-183 處切斷後形成的降解 5.

(20) 形式的多肽。BPSA 由含有增生結構的前列腺移行帶產生,與 BPH 所發 生的生化改變相關。因此,BPSA 在前列腺癌组織中不升高,可以作為鑑 别 BPH 和前列腺癌的特異性抗原標誌物. 10. ;第三種型式為一些較小的. PSA 變異體,類似天然有活性的成熟 PSA,但其結構發生改變而失去了 酶的活性。 PSA 於 1986 年開始進行臨床研究,並於隔年獲得美國食品與藥物管 制局之允許,將 PSA 定義為觀察前列腺癌變化之指標。1994 年 PSA 指 數成為臨床上觀察大於 50 歲男性前列腺病理之例行性檢查。一般認為 PSA 的正常值範圍為 0.4~4.0 ng/mL,根據文獻報導,PSA 4.0 ng/mL 作 為臨界值,在臨床診斷上前列腺癌有著最佳的靈敏度和特異性 11,但是各 種研究結果之間存在較大差異。Bunting 等人之研究結果得出:若以 PSA 4.0 ng/mL 為臨界值診斷前列腺癌的靈敏度為 71%,特異性為 75%,陽性 預測值為 37%,陰性預測值為 91%;而以 PSA 10.0 ng/mL 為臨界值,診 斷的靈敏度為 56%,特異性為 77%,陽性預測值為 47%,陰性預測值為 88%,即以 PSA 10.0 ng/ mL 為臨界值能提高前列腺癌診斷的特異性,但 靈敏度大大降低,因此 PSA 10.0 ng/mL 不適合作為臨界值,但 PSA>10 ng/mL 能提示潛在罹患前列腺癌的可能性高 12。雖然 PSA 為 4 ng/mL 是 多年來人們公認介於正常和異常之間的臨界值,但大量的臨床病例證明, 大約 25%前列腺癌患者的 PSA<4 ng/mL。Djavan 等人報導 PSA<4 ng/mL 的前列腺癌檢出率為 24.0~26.3%,平均為 20.5%13。 在 PSA 應用中存在著一項更值得大家注意的問題:在良性前列腺增 生和前列腺癌患者中都有血清 PSA 濃度的升高,兩者之間 PSA 升高有較 大的重疊,當 PSA 濃度位於 4~10 ng/mL 時,鑑別良性前列腺增生和前列 腺癌是有困難的。由此可見 PSA 對前列腺癌缺乏特異性,僅對前列腺組 織有特異性,其升高僅能提示前列腺癌的可能性 14。為了解決特異性的問 6.

(21) 題,許多與 PSA 相關的指標:fPSA/tPSA、proPSA 等逐漸被研究於 PCa 的早期診斷應用上 15-17。. 1.4.1. 游離 PSA 與總 PSA 的比值. fPSA/tPSA 即游離 PSA 與總 PSA 的比值,前列腺癌血液中 fPSA/tPSA 的比值明顯低於良性前列腺增生患者,因此可以用 fPSA/tPSA 鑑別前列腺 癌和良性前列腺增生。Christensson 等人首先報導 fPSA/tPSA 比值在前列 腺癌和良性前列腺增生診斷中的應用,他們觀察了 144 例良性前列腺增生 和 121 例前列腺癌患者,發現良性前列腺增生患者的 fPSA/tPSA 比值平 均為 0.28;而前列腺癌組平均為 0.18,兩組相比有統計學意義;在 tPSA <10.0 ng/mL,若以 fPSA/tPSA 比值等於 0.18 為臨界值和單純應用 tPSA 相比,可使特異性由 55%提高到 73%,而靈敏度不變(兩者均為 90%) 18. 。Djavan 等人研究 PSA 在 2.5~4.0 ng/mL 的前列腺癌患者中,與其他. 指標相比較,fPSA/tPSA 以 0.41 為臨界值,診斷前列腺癌的靈敏度可達 95%,使不必要的活檢降到最低,但特異性僅有 29.3%13。近年來還有文 獻報導,用 fPSA/cPSA(游離 PSA 與結合 PSA 的比值)替代 fPSA/tPSA 診斷前列腺癌時可提高診斷的準確率,與 fPSA/tPSA 相比 fPSA/cPSA 有 相似的靈敏度但特異性卻從 41%提高到 45%,而且也可以減少 PSA 灰區 診斷中不必要的活檢,因此建議當 PSA 在 4.0~10.0 ng/mL 時,使用 fPSA/cPSA 替代 fPSA/tPSA 進行診斷 19。但是相關文獻較少,fPSA/cPSA 價值是否比 fPSA/cPSA 大還需要進一步研究。. 1.4.2. 前列腺特異性抗原前體. PSA 前體 (precursor of prostate specific antigen, proPSA) 是近年 來研究較多的一種 PSA 分子形式,對 PCa 有較高之特異性 20-22。proPSA 7.

(22) 是血清游離 PSA 的特殊形式,由天然 proPSA 及其各種截斷的亞型組成, PSA 基 因 經 轉 錄 及 轉 譯 , 首 先 形 成 含 有 261 個 胺 基 酸 且 無 活 性 的 pre-proPSA,N 端攜有一段 17 個胺基酸的信號序列 (leader-sequence)。 在 PSA 分泌過程中,pre-proPSA 發生裂解,除去此信號序列後形成由 244 個胺基酸组成的 PSA 酶原 (proenzyme) 或稱 proPSA。ProPSA 由 N 端 7 個胺基酸 (APLILSR) 的 pro 前導肽段 (pro-leader peptide) 和 237 個 胺基酸的成熟 PSA 组成,proPSA 在人類激肽釋放酶 2 (human kallikrein 2, hK2) 的作用下,在第七個精胺酸和第八位異亮胺酸之間發生裂解形成 有活性的成熟 PSA,異亮胺酸成為成熟 PSA 的 N 端 23,形成示意圖如圖 三。血清和組織中的 proPSA 包含的截斷分子亞型,分别稱為[-2] proPSA、 [-4] proPSA、[-5] proPSA、[-7] proPSA 亞型。一般男性健康情况下,體 內 proPSA 易轉化為 PSA,因此精液中不存在 proPSA24。而在前列腺癌 患者的 血清 中發 現數 種 proPSA,其 中 包括含 7 個 前體 胺基 酸序列 (APLILSR) 的[-7] proPSA,含 4 個前體胺基酸序列 (ILSR) 的[-4] proPSA, 含 5 個前體胺基酸序列 (LILSR) 的[-5] proPSA 和含兩個前體胺基酸序列 (SR) 的[-2] proPSA 亞型等 25-27。近年來研究指出 proPSA 截斷亞型為前 列腺癌特異性 PSA,可以用於前列腺癌和良性前列腺增生的早期鑑別診斷, 其靈敏度和特異性皆優於游離 PSA 和總 PSA28,29。. 1.5. 質譜技術 質譜技術 (mass spectrometry, MS) 是測帶電離子 (ion) 的方法,使. 分析物進行游離化 (ionization) 以轉換為氣相的帶電離子,進入質量分析 器後,在電場、磁場等物理力量的作用下,依據質荷比 (mass-to-charge ratio, m/z) 之測量,來決定分子質量的技術。質量是分子的一種特質,因 此可以用於分子的鑑定或確認。1912 年湯姆遜 (J. J Thomason) 用以發 8.

(23) 現質量數為 22 氖的同位素之陽極射線管乃質譜儀之前身。1919 年阿斯頓 (Aston) 與丹麥斯特 (Dempster) 分別發展曲形軌道質譜儀成功。1943 年 美國加州統一工程中心製成第一部商業質譜儀售予大西洋煉油公司以作 分析石油成分之用。隨著電子技術發展,質譜儀製造日益精進完備,不但 成為化學分析之必備工具,而且廣泛應用於核子物理,生物醫藥,以及地 質冶金,環境科學等如能降低製造成本,簡化操作技術,其發展將更不可 限量。利用質譜儀分析時,樣品必須先進行離子化,依照樣品其物理、化 學性質不同,而有各種不同離子化方式,一般易揮發性樣品則用電子撞擊 游 離 法 (electron impact ionization, EI) 或 化 學 游 離 法. (chemical. ionization, CI)。非揮發性樣品,則用快速原子撞擊 (FAB) 或電噴灑游離 法 (electron spray ionization, ESI) 等。因此各種樣品選擇適當的離子化 方法,再經質譜分析,即可進行樣品之結構性分析及定量分析測定。 以質譜法分析蛋白質體是一種新興的分析技術,在 1990 年代以前, 質譜儀在離子源設計上兩種技術的突破,對蛋白質的分析產生了革命性的 影 響 。 首 先 是 新 的 游 離 法 出 現, 1980 年 代 末 期 , Fenn 及 Tanaka, Hillenkamp 分別以電噴灑游離法 (ESI). 63. 和基質輔助雷射脫附游離法. (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 64 成功地偵測到蛋白 質分子,開啟了質譜技術在蛋白質分析的新紀元,同時,質譜儀器不斷地 改良研發,解析度 (resolution)、精確性 (accuracy)、質量範圍 (mass range) 及分析通量 (throughput) 等各方面日進千里,以因應蛋白質量少 複雜的分析需求。另一個重要關鍵則是胜肽質量指紋 (peptide mass fingerprinting, PMF) 以及 peptide fragment fingerprinting 作為蛋白質身 份鑑定的技術,這個概念首先由 Cleveland 等人提出 65。以下就本研究使 用之質譜儀及其方法、游離源作較詳細之介紹:. 9.

(24) 一、 電噴灑游離法 (electrospray ionization, ESI) 電噴灑游離現象的研究起源在 1917 年由 Zeleny 等人最先提出,目的 是將此技術應用在工業上,例如高壓電噴漆、燃油物化點火系統等。到了 1970 年初期,Dole 等人. 66. 以電噴灑游離的方式將玉米胚芽 (zein, M.W.. 50,000 Da)、聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinypyrrolidone, M.W. 1300,000 Da) 等 高質量大分子進行游離,並推測這些大分子以電噴灑游離之後可能以帶有 多價電荷的形式存在。直到 1984 年 Fenn 等人首度成功的將電噴灑游離 裝置與質譜儀結合,並發表了由 ethylene glycol (PEG) 所產生帶多價電荷 的質譜訊號圖,這也證實了分析物分子經由電噴灑游離之後,會以帶多價 電荷離子的形式存在 67。在電噴灑游離法連結質譜儀的技術被發表出來後, 這項游離技術漸漸受到科學家們的重視。 電噴灑機制示意圖如圖八,在電噴灑游離法的游離過程中,其離子形 成 的 機 制 可 分 成 三 個 部 分 , 分 別 是 : 霧 化 (nebulization) 、 去 溶 劑 (desolvation)、游離 (ionization)。分別也可解釋為帶電液滴的生成、帶電 液滴上溶劑的揮發與液滴的爆裂、氣相多價電荷離子的生成。電噴灑游離 法主要目的是提供一個能和液相層析結合的一種介面,這方法在蛋白質分 析及液相層析/質譜領域皆非常重要。由於許多高極性的分子,尤其是蛋白 質分子,在加熱時會造成性質的改變而無法被偵測,利用電噴灑游離質譜 法則可以克服這個問題。ESI 可以產生多電荷離子,每一個都有準確的 m/z 值。正因分子可能攜帶許多不同的電荷,因接上了許多不同數目的質子, 故會得到一系列的離子訊號。雖然這個現象使得電噴灑圖譜變得相對複雜, 但此技術可適用於較多的質量分析器,分析時 mass range 的限制較小。 帶電荷液滴形成氣相離子過程的理論,目前有兩種說法:一為竇爾 (M. Dole) 於 1968 年提出的電荷殘留理論,另一為禕瑞苯 (J.V. Iribrane)與湯 姆森 (B.A. Thamson) 於 1976 年提出的離子揮發理論。這兩種理論都是 10.

(25) 結合溶劑揮發和庫倫斥力兩種現象的結果,但多數的研究者認為電荷殘留 理論的解釋較合理,因為當溶劑揮發後,電荷仍會留在液滴上,因此最後 可形成帶多價電荷的離子。芬恩把離子揮發理論加以改良,用來解釋大分 子會帶多價電荷的現象,其原因在於一開始液滴中帶有多個電荷,而且這 些電荷也同時被帶有異性電荷的離子包圍;由於大分子在液滴中的布朗運 動而移到液滴表面,此時大分子便會取代數個液滴的表面電荷,再藉由熱 能的驅動使大分子的一部分帶電區域自液滴表面突出,一旦突破能障後, 大分子便與液滴脫離而形成帶多價電荷的離子。. 二、 串聯四極桿線性加速離子阱質譜儀 ®. 本研究使用 QTRAP 5500 是具有優異的定性功能與定量功能於一體的. 液相層析-串聯質譜儀,由三段四極桿組成,特殊性在 Q3,Q3 既可以作 為四極桿使用也可以作為線性離子阱使用,它把四極桿-線性離子阱質譜技 術首次結合在一起,結構圖如圖九。四極桿質量分析器是由四根電極組成, 兩組相對的 X 軸及 Y 軸的電極則分別通入相位一樣的正、負直流電,並 同時通入交流電壓,在固定的直流電以及交流電壓下,只有具備特定質荷 比的離子可以通過四極桿中心孔道而到達偵測器,其餘的離子則因軌道振 幅越來越大碰撞到電極棒,失去電荷後被真空系統排出;在一定直流電與 交流電壓比值下,不斷加大直流電壓與交流電壓,可掃描不同的質荷比, 即可得到完整質譜圖。其掃描範圍可達約 6,000 m/z,大部分的蛋白質經 電噴灑游離法游離後而帶多價電荷,質荷比大約落至 400~6,000 之間,因 此分析器有利於進行蛋白質、胜肽等生物樣品分析,且掃描速度快可選特 定離子使之通過可進行 MRM 分析。 一般線性離子阱質量分析器由一個中央電極 (center section) 以及兩 個前後區域電極 (front section, back section) 所構成。離子阱質量分析器 11.

(26) 跟四極棒分析器不同之處在於:離子阱只使用交流電壓來進行不同質量離 子的掃描,離子在四極棒分析器中,只會受到來自 X、Y 軸的電場,在離 子阱分析器中則是加入了 Z 方向的電場,離子會因為受到三個軸向的電場 影響而被捕捉 (trap),繞著電場中心以穩定軌道運動,反之,當我們改變 交流電壓的大小,會造成與此頻率共振的離子不穩定,因此被排出離子阱 而進入偵測器,持續改變此交流電壓,即可掃描不同質荷比離子。此種分 析器最大的優點在於它可以使有興趣的離子留在分析器中,經由在軌道運 行中與氣體碰撞產生碎片,可進行多次誘導碰撞解離 (collisional-induced dissociation, CID) 實驗。線性離子阱和以往的三維離子阱的區別在於對稱 性不同,線型離子阱具有兩個垂直的對稱面,在形式上更接近於“四極桿” 的對稱性,線型離子阱垂直於 z 軸剖面具有雙曲線結構。線型離子阱的優 勢在於離子容量大、靈敏度高於三維離子阱 10 倍(理論上是 200 倍)。 當 QTRAP® 的 Q3 第三段四極桿作為線性離子阱使用時,即在 Q3 兩端加 上兩個電壓,在四極桿上加上一個軸向電壓,當離子進入後,不進行掃描, 而在其中進行捕獲,由此作為功能上改進。QTRAP® 保留了串聯四極桿質 譜儀(空間串聯式質譜)的優點,如:前驅離子掃描 (PS)、中性丟失掃 描 (NL)、product ion scan, MRM 定量功能;以及線性離子阱 (時間串聯 式質譜) 的所有優點,如子離子掃描靈敏度高,MSn,高分辨掃描等等, 又克服了傳統 3D 離子阱質譜儀的缺點,如低質量截止點(1/3 效應)、空 間電荷效應、碰撞效率低、定量差等,為分析複雜生物樣品中蛋白質提供 了很大的幫助。. 三、 質譜應用於蛋白質序列鑑定. 傳統上,蛋白質的身份鑑定主要仰賴 Edman sequencing 進行 N 端胺 基酸序列分析,然而利用這種方式所花費的時間較長,從目標物組成的分 12.

(27) 析與分離到酵素水解與 Edman sequencing,一星期大概只能解讀出三、 四個胜肽片段的胺基酸序列。因此,這些傳統的鑑定方法是無法應用現今 如此龐大而複雜的蛋白質體研究。隨著時間演進,之後發展出利用胜肽質 量指紋 (PMF) 來辨別不同蛋白質的身份。蛋白質是由二十種胺基酸分子 所組成,每個蛋白質都具有特定的胺基酸數目與排列順序。蛋白質經過水 解酶(如 trypsin)進行消化反應 (digestion) 後,由於這些水解酶會針對 蛋白質分子中特定胺基酸,如 trypsin 會切在 arginine (R)及 lysine (K)的 C 端,將蛋白質切割成不同的胜肽片段,因其胺基酸組合不同而具有不同質 量,這些質量分佈將隨著蛋白質不同而具特異性,因此我們可將質譜圖中 的胜肽質量分佈,以搜尋引擎和蛋白質資料庫中已知序列的蛋白質所對應 的胜肽質量作比對,以統計的方式找出最有可能產生該胜肽質量分佈圖的 蛋白質序列,即可鑑定出蛋白質的身份,於 1984 年 Biemann 等人就提出 利用此方法成功鑑定蛋白質 68。隨著各物種的基因資料庫越來越完備的情 況下,每一個基因所轉譯的蛋白質胺基酸序列,及其經由各種蛋白脢切割 後所形成胜肽片段的質量數組合,皆可以利用生物資訊學加以分析與預測, 並且建立成共享的蛋白質資料庫,讓所有的蛋白質體研究者得以快速地從 網路上獲得最新與最完整的相關資訊並有效地快速鑑定蛋白質身份。 近年來隨質譜儀發展日新月異,利用串聯式質譜法 (tandem mass spectrometry, MS/MS) 進 行 胜 肽 碎 片 指 紋 比 對 (peptide fragment fingerprinting, PFF) 完成蛋白質鑑定廣泛被研究學者所使用 69,70。在此技 術中,蛋白質先經過水解酶消化成胜肽,進入質譜儀分析後,在串聯式質 譜儀中的第一段質量分析器先選取某一特定胜肽的質荷比為離子,送入氣 體碰撞室後,離子和惰性氣體產生碰撞,其動能會轉變成內能,造成胜肽 離子的碎裂,產生的產物離子則進入第二段質量分析器以得到碎片圖譜。 胜肽在質譜的氣相環境中特別容易在胜肽鍵斷裂,其離子片段的命名見圖 13.

(28) 十;a、b、c 系列離子同為斷裂在不同位置氨端碎片 (N-terminal fragment), x、y、z 則為羧端碎片 (C-terminal fragment),數字則代表胺基酸的排列 順序,由同一系列的碎片(如 y1、y2、y3⋯)間的質量差距可計算出該胜 肽離子的部分甚至全部序列,以此序列同樣可和蛋白質資料庫中的已知蛋 白質比對,此時,它所根據的除了原來的胺基酸排列組合後的胜肽質量, 還多了由胜肽碎片得到特定的一段或多段胜肽序列,故比對結果的專一性 及正確率遠高於胜肽質量指紋鑑定得到的結果,因胜肽質量指紋鑑定的概 念是將蛋白質以酵素消化後所產生胜肽質量的“獨特性”作為資料庫比 對的依據,適用於一至數個蛋白質的簡單樣品,遇到混合物或當此技術無 法百分之百確認時,常用於蛋白質身份的確認或後修飾結構鑑定。. 1.6. 質譜多反應監測技術之原理與特點 (multiple reaction monitoring) SRM 技術起始於 20 世纪 70 年代末,在 Yost 和 Enk 把 SRM 技術應. 用於三段四級桿質譜儀後才成為常用的質譜技術 為分析小分子化合物的定量參考 量分析. 30. 。在之後 30 年裡常作. 31,32. ,廣泛應用在臨床上藥物代謝物之定. 33-35. 。這種分析模式稱為單反應監測 (single reaction monitoring,. SRM) 或多反應監測 (multiple reaction monitoring, MRM),單反應監測為 只偵測一個前驅離子-產物離子對 (transition),多反應監測指連續的監測 一系列前驅離子-產物離子對。在蛋白質體學研究中,散彈槍法曾是主要的 策略,然而因其選擇的隨機性和較低的靈敏度,導致此方法不適合對蛋白 質進行系统性的定量,而 MRM 技術的出現彌補了散彈法的不足,在定量 蛋白質體學中的應用越來越廣泛。 MRM 技術是基於已知信息或假定信息設定質譜偵測規則,對符合設 定值的離子進行訊號記錄,去除大量不符合設定值之離子訊號的干擾,從 而得到質譜訊息的一種數據採集方式。具體來說,即是根據胜肽前驅離子 14.

(29) 質量數和碎片子離子質量數,選擇前驅離子-產物離子對,允許符合設定值 的前驅離子進入碰撞室,經過與惰性氣體碰撞碎裂後,只記錄設定之產物 離子訊號,掃描機制示意圖如圖四。通過前驅離子和產物離子的兩次選擇, 去除干擾離子,降低化學背景,提高靈敏度及特異性 36-38。在分析化學領 域,這種質譜掃描模式已成熟地用於複雜體系中小分子化合物的分析,如 環境分析、毒物分析、藥物代谢物分析等。而近年來 MRM 技術與多質譜 掃 描 模 式 的 靈 活 結 合 , 例 如 MIDAS (MRM-initiated detection and sequencing),是基於 MRM 獲取的訊號结果,對達到設定訊號 threshold 的胜肽再進行 MS/MS 產物離子掃描,從而對目標胜肽片段進行高靈敏度 鑑定的方法,使複雜目標物的定性結果更為可信,拓寬了其在蛋白質體學 領域的應用。MRM 技術具有高選擇性、高靈敏度、高重複性、高通量和 動態範圍寬等特點,在蛋白質絕對定量領域中一直受到學者們關注。 一、 高選擇性 MRM 技術在第一段四級桿特異性地選擇特定前驅離子通過, 經碰撞 室碎裂後第三段四級桿再次選擇特定的產物離子通過,這樣可排除質荷比 不同的干擾前驅離子和產物離子。兩次的質量選擇模式使得 MRM 有較高 選擇性,過濾共沖堤背景效果明顯,對於測定複雜樣品中含量較低的蛋白 質有很好的效果。. 二、 高靈敏度 MRM 技術通過兩次離子選擇,排除了大量干擾離子,使質譜的化學 背景大大降低。目標檢測物的 S/N ratio 顯著提高,基於質譜的蛋白質體學 技術在分析複雜生物樣品時會有明顯的離子抑制效應 39,而 MRM 技術為 特異性地偵測目標離子,減少了其他離子的干擾,與傳統技術 (SIM) 相比 靈敏度可提高一個數量級 40。 15.

(30) 三、 高重複性 質譜訊號重複性低在一定程度上是因為複雜生物樣品和共沖堤成份 對待測分子離子化、質譜訊號的抑制及碎裂過程的影響導致。而在 MRM 技術質譜訊號採集中,可將後兩者的影響大幅降低,因此重複性也相應提 高。. 四、 高通量 利用 MRM 技術在一次實驗當中就能偵測多達 300 對前驅離子-產物離 子對 (transitions),這種特點為研究多種蛋白質的不同修飾、含量變化和 生物標誌物提供了機會,更能滿足蛋白質體學的研究需求。在預置 MRM 方式下,因只在目標胜肽片段出現的滯留時間窗口内對其進行靶向掃描, 可提高質譜掃描時間的利用率,此方法每次質譜掃描可同時檢測超過 1000 個 transitions,相當於數百個蛋白質。此外,智能選擇反應監測模式 (intelligent SRM, iSRM) 可將 transitions 分為主要和次要部分,分析時只 採集主要的 transitions,只有當主要的 transitions 超過一定 threshold 時 才採集次要的,這樣更進一步縮短掃描時間,提高了通量 41。在生物標誌 物研究領域中,與每次只能檢測一種蛋白質的傳統定量方法如西方墨點法 (Western blot) 或酵素連接免疫分析法 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 相比,MRM 高通量的特點具有很大優勢。. 1.7. 基於 MRM 質譜技術的研究技術. 1.7.1. 預置 MRM 數據採集模式 (schedule MRM, sMRM). 在蛋白質體學研究中,與定性分析方法相比,SRM 技術有著高選擇 性、高靈敏度、高通量和寬動態範圍等特點。在確保數據質量的前提下, 為了使每次進行實驗時的檢測數最多,目前常用一種稱為預置 MRM 16.

(31) (scheduled MRM, sMRM) 的方法,此種方法須先從之前實驗中得知每段 胜肽的滯留時間,利用此信息使得每段胜肽只在其滯留時間内進行 MRM 偵測,能夠顯著提高偵測靈敏度,改善大部分 peak S/N ratio (signal-to– noise ratio) 和降低定量極限 (LOQ)42,並且重複性好,能夠達到對質荷 比相同但滯留時間有差異的胜肽的準確鑑定。. 1.7.2. 穩定同位素稀釋法 (stable isotope dilution, SID). MRM 的定量分析一般分為相對定量和絕對定量分析。MRM 實驗的相 對定量一般是指同一段胜肽在實驗組與對照組的訊號強度比作為其相對 定量值,可以用目前常用的非標記 (label-free) 定量法或者化學標記定量 法來進行實驗。搭配穩定同位素稀釋 (stable isotope dilution, SID) 的 MRM-MS 策略能對目標蛋白質及胜肽進行絕對定量 43,44。SID 為目前 MRM 在蛋白質體學定量分析上普遍使用的方法,且為歷史悠久的質譜定量法 43-47. ,於 1983 年應用於胜肽樣品上. 48. ,1996 年利用快速原子撞擊質譜法. (fast atom bombardment mass spectrometry, FAB) 分析蛋白質水解樣品 49. 。此方法是將已知含量的同位素標記的胜肽片段當作內標準品加至水解. 後之樣品中進行 MRM 檢測的蛋白質定量技術。同位素標記之內標胜肽段 與水解樣品中內源性胜肽具有相同序列、相同滯留時間、相同離子化效應、 產生相同碎片離子,但質量數不同,能在質譜圖上產生訊號不同的差異。 根據樣品中胜肽與其相應同位素標記胜肽段的訊號强度比值來進行定量, 由於內標準品的加入,可以校正系統誤差,提高了 MRM 方法的準確度及 再現性。為不影響胜肽的滯留時間等特性,常用 15N、13C 和 18O 作為重標 同位素。化學合成法是最早使用的胜肽標記方法,以同位素標記的氨基酸 為原料進行製備。近年來學者利用 SID-MRM-MS 技術搭配樣品分餾技術, 如:多維液相層析分餾法、親和性富集或去除高含量蛋白質方法等,可進 17.

(32) 一步提高 MRM 偵測的靈敏度,檢測血清樣品內蛋白質其偵測極限可達 ng/mL 的範圍,動態範圍更可達到五個數量及以上的範圍 38,50-52。. 1.8. MRM 技術在蛋白質體學研究領域的應用 MRM 技術的諸多特點,使其在蛋白質體學以及許多其他領域的研究. 中得到廣泛應用。. 1.8.1. MRM 技術在後轉譯修飾研究中的應用. 生物體内蛋白質的活性主要由共價鍵修飾來調控,這些修飾通常發生 在蛋白質轉譯後。瞭解一個特定蛋白質的功能和調控,常常需要透過鑑定 它的修飾類型和位置。目前利用質譜技術的蛋白質後轉譯修飾研究方法對 蛋白質的磷酸化分析主要藉由對磷酸化胜肽進行富集來提高靈敏度,但其 效果有限。MRM 技術自此方面展示出了其優勢,Eissler 等人利用非標記 (label-free MRM) 質譜技術研究多位點的蛋白質磷酸化,在比較 MRM 技 術與傳統方法對於測量磷酸酶動力學和激酶活性能力的實驗中,MRM 動 態範圍可達到 4 個數量級,且重複分析單個樣品的 CV 值小於 4%,藉由 比較 MRM 技術和傳統技術對於去磷酸化效率的偵測以及反應速率的偵測, 證明 MRM 可用於測量體内磷酸酶和激酶的活性,其高特異性、高通量的 特點在此發揮很大功效 53。此外 MRM 技術也可應用於醣基化、乙醯化、 泛素化等修飾的研究中。Li 等人 54 利用結合特異醣基化的胜肽萃取策略與 MRM 技術測量複雜生物樣品中醣蛋白的不同醣基化形式。. 1.8.2. MRM 技術在疾病生物標誌物驗證中的應用. 隨著蛋白質體學的不斷發展,發現生物樣品中的差異蛋白質,即潛在 生物標誌物已不再困難,然而如何對這些差異胜肽或蛋白質在大量臨床樣 18.

(33) 品中定量,進行高通量的驗證是目前迫切需要解決之問題。疾病特異性的 生物標誌物研究是蛋白質體學研究中的一個重要領域,對疾病的預防、診 斷及治療效果的監控等有重要作用。生物標誌物的研發可分為 3 個階段: 發現階段、確認階段和臨床驗證階段 55。蛋白質體學研究已經成功應用於 生物標誌物的發現階段,利用二维膠體電泳或散彈槍法 (shotgun) 技術找 尋上調或下調蛋白質以發現生物標誌物的研究策略已趨完整。即在發現階 段從疾病組織中找尋與正常組織有差異的蛋白質,在驗證階段使用 MRM 技術於組織週邊體液、血清或血漿中偵測該差異蛋白質,利用 MS/MS 譜 圖進行定性,最後用 MRM 技術和同位素稀釋標定 (SID) 或質量標籤標記 (MRM tags for relative and absolute quantitation, mTRAQ) 的方法對篩 選出來的生物標記物定量 56,進行臨床驗證。數據的可靠性需要得到最終 的臨床驗證,以往常使用被稱為”golden standard ”的酵素連結免疫分 析方法 (ELISA) 對候選生物標誌物進行多樣品量的篩選。ELISA 方法是 利用抗原抗體之間專一性鍵結之特性,對檢體進行檢測;由於結合於固體 承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性,因此設計 其鍵結機制後,配合酵素呈色反應,即可顯示特定抗原或抗體是否存在, 並可利用呈色之深淺進行定量分析。酵素連結免疫分析法已日益普及,因 為非常靈敏,其對血液中白質定量極限可至 pg/mL 範圍,且不必如免疫螢 光法和放射免疫分析法需要特殊設備。ELISA 是在 1971 年首次由 Engvall 和 Perlman 所提出 57。不論是測抗原或抗體都有很高的敏感性及專一性, 且使用設備相較之下少了許多。固相吸附讓 unbound reagents 快速且完 全地清洗。是一種安全又穩定的方法。但 ELISA 受到需要抗體的製備、耗 費時間、價格昂貴及每次只能分析 1 個目標蛋白質的限制,且易受內源性 抗體干擾造成偵測上困難 58-60。為了降低驗證的成本並提高候選蛋白質在 之後驗證實驗中的成功率,需要高通量的確認驗證技術來填補由發現到驗 19.

(34) 證的鴻溝。而 MRM 質譜技術正是藉由其高選擇性、高靈敏度、高通量、 低成本的優點,在生物標誌物的發現後驗證過程中發揮了重要的作用。在 Whiteaker 等人的研究中,以小鼠為模型研究乳癌的生物標誌物;用液相 層析串聯質譜法 (LC-MS/MS) 對腫瘤和正常乳房組織的蛋白質進行偵測, 篩選出 700 個以上差異蛋白質;再搭配抗體及 MRM 技術最後鑑定出 fubulin-2 作為血漿中的生物標誌物。實驗結果進一步驗證了 MRM 技術驗 證生物標誌物的方法,在發現新穎生物標誌物研究中的可行性,其中蛋白 質的平均偵測極限 (limit of detection, LOD) 為 68 ng/mL,平均定量極限 (limit of quantitation, LOQ) 為 157 ng/mL,所有分析物在定量極限的平均 變異係數 (coefficient of variation, CV) 為 5.7%,由此顯示 MRM 對於複 雜生物樣品的分析具有不可忽視的價值,適合應用於生物標誌物的高通量 驗證工作. 61. 。Kuhn 等人研究 MRM 技術與同位素標記相結合進行絕對定. 量分析,可以節省分析時間,並且能得到與抗體和免疫分析等傳統驗證方 法具良好相關性的實驗結果 62。他們利用具穩定同位素標記所合成的胜肽 段和 MRM 技術相结合,檢測類風溼性關節炎患者的血漿樣品中生物標記 物 C-reactive protein 的濃度,並對此方法的回收率、線性範圍等進行討論, 結果能達到高達 66%的回收率和 3 個數量級以上的線性範圍。. 1.8.3. MRM 技術在定量蛋白質體學研究中的應用. 複雜樣品中共沖堤物的訊號干擾和寬達 9 個數量級以上的動態範圍, 一直是影響血清或血漿等生物樣品中蛋白質、胜肽準確定量的關鍵因素。 多年來研究學者們嘗試利用多種方法,包括經過充分的液相層析分離,去 除高含量蛋白質等,但質譜對低含量蛋白質的偵測靈敏度和準確度仍不能 滿足分析的要求。MRM 技術的特點在定量蛋白質體學應用上展現了其優 勢。高選擇性優點,在一定程度上提高了偵測時的動態範圍,因 MRM 技 20.

(35) 術經過兩次特異性離子的選擇,降低了複雜樣品的背景訊號,增強了低含 量蛋白質的偵測靈敏度;另一方面藉由對高、低含量蛋白質 MRM 離子對 的選擇來平衡兩者的訊號差異並且減少了複雜共沖堤物的干擾,增强了偵 測時的特異性。高通量的優點,也使多種蛋白質的樣品可以同時被定量。 Anderson 等人用 MRM 技術定量分析了人類血漿中 53 種高、中度含量蛋 白質。其中 47 組數據 CV 值為 2~22%,顯示了定量的良好準確度。分析 结果的動態範圍達到 4.5 個數量級 36。Keshishian 等人也利用 MRM 和同 位素稀釋的方法進行了定量分析。在未使用蛋白質或胜肽親和性富集的條 件下,去除血漿 6 種高含量蛋白質後,低含量蛋白質的偵測極限在 1~10 mg/L,CV 值在 3~15%,與質譜直接偵測血漿蛋白的方法相比,分析效果 改善了 1000 倍. 50. 。實驗结果顯示 MRM 技術進行絕對定量的高準確度,. 以及用於分析複雜樣品的高動態範圍。. 1.9. 蛋白質純化策略 血液樣品中(血漿、血清等)蘊藏著與疾病發生機制、早期診斷及預. 後評估密切相關的眾多信息,使其成為臨床上最為常見且重要的診斷樣 品。 然而,血漿中蛋白質含量差異甚大,血漿中 20 種主要高含量及中等 含量的蛋白質,如 albumin、IgG、transferrin 等占血漿總蛋白含量的 97~99%以上,而其餘的 1%則由為數眾多的低含量甚至極低含量的蛋白 質组成。如 interleukin 6 (IL-6) 通常濃度範圍在 0~5 µg/L,而 albumin 含 量為 35~50 × 109 µg/L,高低含量蛋白質數量可差 1012 之巨 58,如圖五, 遠遠超出了二維膠體電泳 (two-dimensional electrophoresis, 2DE) 及其 他一般蛋白質體學分析技術所能偵測的範圍。由於大部分蛋白質,包括一 些具有疾病診斷意義的生物標誌物,往往是含量較低之蛋白質,用少量樣 21.

(36) 品進行分析時,因為高含量蛋白質訊號的遮蔽,使一些低含量蛋白質不易 被發現,在分析時受到很大的限制。因此,如何去除血清中的高含量蛋白 質,富集低含量蛋白質提高其相對含量,以利於發現新的疾病診斷生物標 誌物和提高偵測時的靈敏度已越来越受到人們的重視。現今常用之方法為: 免疫親和層析法和血漿蛋白預分離法。以下針對本實驗所應用之免疫親和 層析法做進一步詳細介紹: 免疫親和層析法是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的 親和力進行分離的方法。親和層析的應用主要是生物大分子的分離、純化。 親和層析的高度選擇性使得纯化複雜樣品,富集某一含量較低的目標蛋白 質成為可能,因此親和層析是蛋白質分離纯化過程中最有效的方法之一, 常用的有免疫沉澱法及免疫親和去除法。 免疫沉澱法 (immnuoprecipitation) 是利用抗原及抗體特異性反應純 化目標蛋白質的一種方法。將要被純化的目標蛋白質之抗體鍵結在固態載 體表面上(如 agarose 或 Mag Sepharose 等),以此製備管柱,此種管 柱稱為免疫親和性管柱 (immunoaffinity column, IAC),利用抗體對抗原的 專一性與親和性,IAC 從複雜的生物樣品中萃取出目標蛋白,藉由抗體對 目標蛋白質與其非特異性蛋白的專一性不同,樣品中的目標蛋白質會相應 地找到其結合位點而被抗體捕獲。而沒有與結合位點結合的那些非特異性 的高含量蛋白質則因為沒被抗體捕獲而在隨後的洗脫過程中被除去。與此 相反,低含量的蛋白質富集在其特定親和力配基上。透過這種方式,低含 量蛋白質相對得到了純化與濃縮,方法流程示意圖如圖六。 免疫親和去除法 (immunoaffinity depletion),利用蛋白質和抗體間的 相互作用,特異性结合 albumin、IgG、transferrin 等高含量蛋白質,從而 富集血清中剩餘的低含量蛋白質。此方法為將血漿中多種高含量蛋白的 monoclonal 或 polyclonal 抗體結合於固體支持物上,製備成管柱,透過將 22.

(37) 生物樣品通過此管柱,高含量蛋白質與管柱上相對之抗體專一性的結合, 達到特異性去除血清中高含量的蛋白質,其實驗流程如圖七。目前已開發 出可以同時去除 6、7 或 14 種血清高含量蛋白質的免疫親和層析管柱,如 Agilent 公司的 MARS Human-6,7,14 和 Sigma 公司的 Seppro® Tandem IgY14/SuperMix 免疫親和層析管柱。去除這些高含量蛋白質,有效地擴大 了分析的動態範圍,從而改善 LC/MS 及膠體電泳方法對低含量蛋白質分 析時的靈敏度。. 1.10. 實驗動機 前列腺特異性抗原 (prostate specific antigen, PSA) 是目前最成功且. 廣泛運用的血清標誌物,但其缺乏疾病特異性。近年來,越來越多相關文 獻報導前列腺特異性抗原前體 (proPSA) 及其截斷亞型分子 (truncated proPSA) 與前列腺癌更具相關性且更具疾病特異性。過去研究學者多利用 被稱為「黃金標準」的酵素連接免疫方法 (ELISA) 檢測生物樣品血清中 的 proPSA 含量。但使用 ELISA 法檢測受到多個抗體製備昂貴、方法開發 費時且一次實驗只能針對一個目標分析物做偵測的限制,如:文獻報導 71 檢測生物樣品中四種不同 truncated proPSA ([-2] proPSA、 [-4] proPSA、 [-5] proPSA、[-7] proPSA) 需三種不同抗體的 ELISA kit 分三次實驗檢 測。 本研究建立一套利用免疫沉澱法搭配質譜多反應監測掃描技術之方 法,檢測定量血清樣品中 proPSA 及 truncated proPSA ([-5] proPSA),藉 此改善 PSA 對前列腺癌偵測之特異性。此研究考慮血清標誌物具有高複 雜度與含量低的特點,為此採用免疫沉澱方法更有效地純化富集血清中 proPSA,實驗使用 NHS-activated beads 這種固相載體,與抗體結合後進 而與樣品中特異性抗原蛋白質结合,洗脫後搭配高選擇性及靈敏性的質譜 23.

(38) 多反應監測技術檢測目標蛋白質。因 MRM 技術高通量特性可以在一次實 驗中同時偵測多段胜肽,相較於傳統使用之方法,能在實驗上大幅縮短分 析時間與花費。. 24.

(39) 第二章 2.1. 實驗材料. 樣品 人類重組前列腺特異性抗原前體 (human recombinant precursor of. prostate specific antigen, proPSA) 標準品,由工業技術研究院周民元博 士 提 供 , 其 合 成 蛋 白 質樣 品 包 含 兩 種 前列 腺 特 異 性 抗 原 前 體 形式 : full-length proPSA ([-7] proPSA-APLILSRIVGGW……) 、 truncated proPSA ([-5] proPSA-LILSRIVGGW…....)。 人類血清來自健康女性自願者抽血提供 (n=4, age=23),收集全血至 BD SST 血清分離膠管,以 3000~5000 rpm/min 離心 10 min,離心後分 隔血細胞和血清,取上層液體即為本實驗之血清空白標準品,凍存於 -20 °C 待實驗使用。 本研究利用將人類重組前列腺特異性抗原前體 (human recombinant precursor of prostate specific antigen, proPSA) 標準品自行依不同實驗 需求,以不同濃度比例加至健康人類女性血清中,作為本實驗血清樣品。 同位素標記胜肽標準品購自 Sigma 公司作為絕對定量配對試劑,分別 為;LILSR[13C6,. 15. N4]、APLISR[13C6,. 15. N4]、LSEPAELTAVK[13C4,. 15. N4]. 三段胜肽,經過 HPLC 純化,胺基酸分析和定量測試,標記效率大於 98 atom %。該穩定同位素標記 (13C,. 15. N) 標記於賴氨酸 (K) 或精氨酸 (R). 位置,從而分別有 8 或 10 Da 的質量增加。. 2.2. 藥品 Monoclonal antibody against prostate specific antigen (Fitzgerald) NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow beads (GE Healthcare) 25.

(40) Sodium bicarbonate (Sigma-Aldrich) Sodium acetate (Sigma-Aldrich) Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Bio-Rad) Glycine (Bio-Rad) Sodium chloride (J. T. Baker) Urea (J. T. Baker) Sequencing grade modified trypsin (Promega) Ammonium bicarbonate (J. T. Baker) D,L-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich) Iodoacetamide (Sigma-Aldrich) Bovine serum albumin (Standard II, Bio-Rad) Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate (Bio-Rad) Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad) Glycerol (Sigma-Aldrich) Ammonium persulfate (Bio-Rad) Bromophenol Blue (Bio-Rad) Sodium dodecyl sulfate (J. T. Baker) N,N,N’,N’-t,etramethylethylenediamine, TEMED (Bio-Rad) Sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich) Sodium carbonate (Sigma-Aldrich) Sodium acetate (Sigma-Aldrich) Silver nitrate (Sigma-Aldrich) Ethylenediaminetetraacetic acid (Sigma-Aldrich). 26.

(41) 2.3. 試劑 Acetic acid (J. T. Baker) Formic acid (J. T. Baker) Acetonitrile (Merck) Methanol (Mallinckrodt Baker) Hydrochloric acid (J. T. Baker) Sodium hydroxide (J. T. Baker) Dye reagent concentrate (Bio-Rad) Prestained Protein Ladder (PageRulerTM) Formaldehyde (Sigma-Aldrich) Glutardialdehyde (Sigma-Aldrich). 2.4. 耗材 Macro spin column™ (Hoefer) Microcentrifuge Tube (Labcon) Amicon® Ultra-0.5 (Millipore) BD Vacutainer® blood collection tube (BD Biosciences) Slide-A-Lyzer® MINI Dialysis Devices--3.5 kDa (Thermo Scientific) Oasis® HLB 96-well µ–elution plate (Waters). 2.5. 儀器設備. A. 超純水系統 (Millipore Direct-Q3) B. 酸鹼度計 (Mettler Toledo, EL20) C. 電磁加熱攪拌機 (IKA, C-MAG) D. 數字型恆溫乾浴槽 (Major Science, MD-02N-110) 27.

(42) E. 超音波震盪洗淨機 (Delta, DC150H) F. 桌上型離心機 (FOCUSBIO, pc-200) G. 微量天平 (METTLER TOLEDO, AL104) H. 濾鏡式分析儀 (Thermo Scientific, Multiskan FC) I.. 高速低溫離心機 (Hitachi, CT15RE). J.. 真空離心式濃縮機 (miVAC, DUC-12060-C00). K. 電子防潮箱 (Eureka, AD-98) L.. MARS Human-14 column (Agilent Technologies Inc.). M. 快速蛋白質純化系統 (GE Healthcare, AKTA purifier 10) N. 正壓萃取裝置 (Waters, Positive pressure-96) O. 迷你電泳槽系統 (BioRad Mini-PROTEIN 3 System) P. 超高效液相層析系統 (Waters, nano ACQUITY) Q. QTRAP® 5500 mass spectrometer (AB SCIEX). 28.

(43) 第三章 3.1. 實驗方法. 微透析. 【材料與試劑】 1.. Slide-A-Lyzer® MINI Dialysis Devices (Thermo Scientific) Molecular weight cut-off (MWCO) 為 3.5 kDa Capacity 為 0.5 mL. 2.. Monoclonal PSA antibody 384 µL at a concentration of 5.2 mg/mL (Fitzgerald). 3.. Coupling buffer: 0.2 M NaHCO3 with 0.5 M NaCl, pH 8.3. 【實驗步驟】 1.. 取 500 mL coupling buffer 加入至 500 mL 燒杯,並放入大小適當之 磁石攪拌子於燒杯中。. 2.. 取 384 µL PSA antibodies 至 Slide-A-Lyzer® MINI Dialysis unit 中, 並放置於樣品浮板上使之漂浮於步驟一之燒杯中。. 3.. 將步驟二之燒杯放置於電磁加熱攪拌機上,於 4°C 下緩和攪拌 overnight。. 3.2. 使用免疫沉澱策略純化血清樣品. 【材料與試劑】 1.. NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow beads (GE Healthcare). 2.. Monoclonal PSA antibody (Fitzgerald). 3.. Macro spin column™ (Hoefer). 4.. Coupling buffer: 0.2 M NaHCO3 with 0.5 M NaCl, pH 8.3 29.

(44) 5.. Blocking buffer A: 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5. 6.. Blocking buffer B: 0.1 M sodium acetate with 0.5 M NaCl, pH 4. 7.. Wash buffer: 50 mM Tris with 150 mM NaCl and 1 M urea, pH 7.5. 8.. Elute buffer: 0.1 M glycin-HCl with 1 M urea, pH 2.9. 【實驗步驟】 1.. 取 20 µL NHS-activated beads slurry 至 macro spin column™,以 1,500 x g 離心 1 分鐘去除儲存溶液. 2.. 加入 200 µL cold 1mM HCl solution 至 macro spin column™中,以 1,500 xg 離心 1 分鐘,並去除 flow-through。此步驟重複三次。. 3.. 加入 200 µL coupling buffer 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離心 1 分鐘,並去除 flow-through。此步驟重複五次。. 4.. 加入 13 µL monoclonal PSA antibody solution (conc.= 6 µg/µL)至 macro spin column™中,並封住 macro spin column™上下開口,以 震盪器在室溫下震盪 2 小時。. 5.. 以 1,500 x g 離心 1 分鐘,將 flow-through 重新吸取至 macro spin column™中,並封住 macro spin column™上下開口,以震盪器在室 溫下震盪 1 小時。. 6.. 以 1,500 x g 離心 1 分鐘,將 flow-through 吸取至新 tube 中,待之後 實驗測量 capacity 即 beads 與 anti-PSA 之結合效率。. 7.. 加入 200 µL blocking buffer A 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離心 1 分鐘,並去除 flow-through。. 8.. 加入 200 µL blocking buffer B 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離心 1 分鐘,並去除 flow-through。. 9.. 加入 200 µL blocking buffer A 至 macro spin column™中,並封住 macro spin column™上下開口,以震盪器在室溫下震盪 3 小時。 30.

(45) 10. 以 1,500 x g 離心 1 分鐘,將 flow-through 去除。 11. 加入 200 µL blocking buffer B 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離心 1 分鐘,並去除 flow-through。 12. 加入 200 µL blocking buffer A 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離心 1 分鐘,並去除 flow-through。 13. 加入 200 µL blocking buffer B 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離心 1 分鐘,並去除 flow-through。 14. 加入 200 µL coupling buffer 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離心 1 分鐘,並去除 flow-through。此步驟重複五次。 15. 加入 100 µL serum sample spiked in 七個不同濃度的 PSA (1000, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 1, 0.1 ng/mL) 至 macro spin column™中,並 封住 macro spin column™ 上下 開口 , 以震 盪器 在 4 °C 下震盪 overnight。 16. 以 1,500 x g 離心 1 分鐘,將 flow-through 重新吸取至 macro spin column™中。此步驟重複三次,為確保反應完全。 17. 加入 200 µL wash buffer 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離 心 1 分鐘,並去除 flow-through。此步驟重複七次。 18. 加入 50 µL elute buffer 至 macro spin column™中,以 1,500 x g 離心 1 分鐘,收集 flow-through。此步驟重複三次,收集三次流出液即為本 實驗最終純化之樣品。 19. 以 1 M Tris buffer (pH 8) 使樣品為中性,利用 miVAC 抽乾樣品,保 存在-20°C 冰箱中。. 31.

數據

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參考文獻

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