全靜脈營養液中添加 L-glutamine 對燒傷老鼠營養素代 謝及免疫反應之影響
葉松鈴
台北醫學大學保健營養系
前言
燒燙傷是一種創傷後之發炎反應(post-traumatic inflammatory disease)，嚴重燒燙 傷會造成賀爾蒙分泌之改變、蛋白質及脂質之分解、糖質新生、引起嚴重氮流失、代 謝速率增加，也會活化吞噬細胞和中性球(neutrophil)及 arachidonic acid 之代謝反應，
產生eicosanoid 之代謝產物並促進 cytokine 之生成(1-4)。有研究顯示燒傷病人免疫
功能會降低，體內IgG 量減少、延遲性皮膚敏感試驗及腸道免疫功能受損，造成細
菌轉移，而使病人較易受到感染，產生敗血性之併發症(5-7)。另外燒傷也會促使活 性氧自由基之產生，而使遠離燒傷部位之器官受損(8-10)。Deitch 等人(11)建議燒傷 20%或不及 20%但有營養不良的人均應積極給予營養支持。
Glutamine(GLN)是全血中含量最多的氨基酸，也是細胞間質中含量最多的游 離氨基酸，由於其在體內可自行合成，以往常忽略其重要性，近年來，一些研
究發現在受傷及一些異化的疾病狀況下，血中及骨骼肌中GLN 的濃度有明顯下
降(12,13)，其下降量的多寡與其存活率相關(14 )，而根據研究嚴重燒燙傷病人 血中GLN 濃度較正常人減少 58%,且此種低 GLN 濃度會持續 21 天以上(15)。另 外一些複製快速的細胞如淋巴球、fibroblasts、癌細胞和腸黏膜細胞等均消耗大量 的GLN (16 )，加上其在一些細胞、組織培養上的必要性，遂逐漸受到重視，甚 至被認為在某些生理或疾病狀況之下，GLN 是一種必需氨基酸(17)。有研究顯示 GLN 添加於全靜脈營養(total parenteral nutrition,TPN)的配方中，有助於維持腸 道構造和功能之完整性並可增加氮保留量(18-20 )。GLN 除了在疾病狀況下對蛋
白質代謝有正面影響外，近年來的實驗顯示 GLN 之添加在體外實驗可促進 T
lymphocyte 增生(21)，在 interleukin(IL)-2 存在下 GLN 之添加可促進 killer cell 之 活 性 同 時tumor necrosis factor (TNF)-α、interferon-γ 之產生亦與 GLN 有 dose response 之關係(22)。人體實驗中顯示，骨髓移植的病人，飲食中添加 GLN 的組
別血中T lymphocyte、CD4 及 CD8 較未添加組高(23)，手術後的病人若添加 GLN 可使 T-cell DNA 之合成增加，但對 IL-2、TNF、IL-6 無影響(24)。在 GLN 對 NO 之產生上 in vitro 得到的結果並不一致，O'Dorod 等人(25)之實驗顯示，GLN 會促進neutrophil 產生 NO 。而 Meininger 等人(26)的實驗則顯示 GLN 會調節 arginine-NO pathway 抑制 L-citrullin 轉變成 L-arginine， 因而抑制 NO 之產生，
而抑制NO 之產生可應用於減輕發炎反應。
在燒燙傷補充 GLN 之研究方面，補充較高量 GLN 之燒傷老鼠其細菌轉移之 比 例 較 低(27) ， 而 給 予 Arginine 或 GLN 之 前 驅 物 質 ornithin A-ketoglutarate (OKG)之老鼠在燒傷後 2-3 天氮平衡之情形顯著較未添加 OKG 者為佳(28)，另
外燒傷病人之中性白血球在體外實驗中若培養液中有GLN 存在時，其噬菌能力
會增強(29)。
TPN 是一種不經由腸道之營養支持方式，常用於重症病人。燒燙傷病人常需 要TPN 作為營養支持，目前並無在 TPN 溶液中添加 GLN 對燒傷病人營養素代
謝及免疫反應之研究。因此本研究擬以燒傷老鼠之動物模式來探討TPN 溶液中
添加GLN 對燒傷老鼠之影響。本研究將分成兩部分進行，由於燒傷會造成免疫
能力之降低，為研究GLN 之添加對燒傷後 24 小時內細胞激素及 T 淋巴球之變 化情形，第一部份先以TPN 方式輸入含 GLN 之溶液一星期再進行燒傷，來探
討GLN 之添加是否有可能減輕燒傷所造成之異化作用，並增強燒傷後之免疫能
力。因現實生活中燒傷之發生並不能預知，故第二部份為燒傷後再給予富含 GLN 之 TPN 溶液 2 或 3 天，燒傷後之 48-72 小時是燒傷異化作用最嚴重之時期，
而老鼠在燒燙傷3 天之後可能漸漸恢復，故在輸入富含 GLN 之 TPN 48 及 72 小
時後分別抽血，來觀察GLN 之添加對燒傷後之異化作用及免疫能力之影響。
實驗材料及方法
第一部份
本計劃擬以230-250g 之雄性 Wistar rat 為實驗對象，經一星期之適應期後，將老 鼠分成2 組，分別進行頸靜脈插管，完全由 TPN 方式供給營養一星期，兩組輸 入 之 TPN 溶 液 營 養 素 含 量 均 完 全 相 同 只 有 胺 基 酸 組 成 不 同 ， 一 組 添 加
Glycine(Gly)，一組添加 GLN，以往之研究顯示在 TPN 溶液添加 2%之 GLN，
在氮平衡及維持小腸黏膜細胞重量上均較未添加組為佳(30)，故本研究亦以此 為添加量。兩組輸液為等氮量（Isonitrogenous ），TPN 溶液中所含熱量為 1kcal/1ml, 每 天 給 予 之 熱 量 為 270kcal / kg BW, N / kcal 為 1:105, protein、fat、carbohydrate 約佔總熱量之 22%、11%、67%，一星期後進行燒燙傷實 驗。本實驗組別為GLN 燒傷組(GLN-Burn)及 Gly 燒傷組(Gly-Burn)。
燒燙傷實驗之動物模式：
將老鼠以腹腔注射麻醉後，剃掉背部的毛，將老鼠置於一底部開有一長方形空
窗之隔熱模型中，將剃毛部位緊貼於空窗，再將此曝露處浸於沸水中10 秒鐘，
造成老鼠體表約25%之三度燙傷(31,32)，燙傷後立即給予腹腔注射生理食鹽水 (10ml/100g BW)以補充水分(32)。燙傷後之 1-6 小時每小時由頸靜脈抽血 0.5 ml，並於 24 小時時犧牲取血、腹腔 macrophage 及肝、腎、肺、脾等器官，來探討 GLN 添加與否對燒傷後短時間內不同時間點細胞激素及 nitric oxide (NO)產生之 變化，及燒燙傷24 小時後非特異性免疫反應、T 淋巴球分佈之情形。
測定之項目為：
1. 血漿中 NO 之測定：Arg 為 NO 之前身，本研究擬比較兩組各不同時間點 NO 產生量之差異性來探討 NO 與其他代謝變化上之相關性。NO 會轉變成 nitrate 及 nitrite, 將 nitrate 以 nitrate reductase 轉變成 nitrite 後，以比色法測定 之(Calbiochem-Novabiochem Corp, USA)。
2. 血 漿 中 cytokine 之 測 定 ： 擬 測 定 之 cytokine 包 括 與 發 炎 反 應 相 關 之 Interleukin (IL)-1 、 IL-6 、 tumor necrosis factor(TNF)- 及 與 T cell proliferation 相關之 IL-2，cytokine 之測定為利用 ELISA 之方法(Biosource, Belgium)(33)。
3. macrophage cytokine 之分泌：將兩組分離出之 macrophage 以 2x106/ml 之濃 度置於培養皿中，以定量之LPS 來刺激，經過 24 小時之培養後將之離心取 上清液，以測定其cytokine 之製造量，
4. 巨噬細胞吞噬綠膿桿菌之能力：由於臨床資料顯示燒傷病患最容易被綠膿 桿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染，本計劃擬用顯微鏡下觀察吞噬作用的 方法，先將綠膿菌培養至mid-log phase，以 4℃的 PBS 洗 2 次，再以
RPMI 1640 調整細菌濃度為 108 CFU/ml。 將腹腔收集之巨噬細胞以冷卻的 RPMI 1640 清洗，再以含 10% 胎牛血清之 RPMI 調整細胞濃度為 2 x 105 cells/ml。吞噬作用之進行是將滅過菌、直徑 11 mm 之圓型蓋玻片放入 24 孔 培養皿中的每一孔洞中，再加入1ml 的巨噬細胞，在 37℃之 CO2培養箱
中靜置2 小時，讓巨噬細胞吸附於蓋玻片後，將未吸附之腹腔細胞沖洗掉，
在37℃，5%的 CO2培養箱中靜置30 分鐘。以冷卻的 PBS 沖洗吸附在蓋玻 片上的巨噬細胞以去除未被吞入之綠膿桿菌。以1% methanol 固定細胞後，
再以1% crystal violet 染色。以油鏡將細胞放大 1000 倍後，觀察 100 個巨 噬細胞的吞菌作用，並計算每個細胞吞噬細菌的數目。將巨噬細胞吞噬綠 膿桿菌的數目，分為三種程度：小於6 個，6 個至 19 個，大於 19 個細菌。
分別計算100 個巨噬細胞中三種所佔的百分比(34)。
5. 自然殺手(NK)細胞比例、數目及細胞活性之測定：將脾臟細胞取出並製成 單一懸浮液，更進一步利用Tris-Ammonium chloride 緩衝液將紅血球懸浮，
白 血 球 則 利 用 Hank’s 溶 液 清 洗 三 次 。 將 NK 細 胞 分 離 出 後 ， 利 用 Fluorescein isothiocyanate (FITC)及 Phycoerythin (PE)染色之單株抗體來計 算不同表面標記之比例和數目。NK 細胞之活性則先培養其標的細胞(YAC- 1 細胞株)，將 YAC-1 細胞與51Cr 一起培養約 4 小時，再將殘餘之51Cr 除 去，此時再加入NK 細胞與已經與51Cr 培養過的標的細胞一起培養，過一 段時間取出上清液，以counter 計算其放射強度(35)。
6. T 細胞之反應：取全血測定之。CD4+及 CD8+為helper T 及 supressor T 淋巴 球上之細胞標記，測定CD4+及 CD8+蛋白質可知T 淋巴球之變化情形。CD4+ 及 CD8+量之下降或CD4+/ CD8+比例下降均表示免疫能力降低(36)。CD4+及 CD8+ T 淋 巴球 以 接 合 FITC 之 antibody 結合 後以 Flow Cytometry 測定 之 (37)。
第二部份
同樣以230-250g 之雄性 Wistar rat 為實驗對象，經一星期之適應期後，將老鼠分 成2 組，麻醉後分別進行頸靜脈插管並同時燒燙傷，燒燙傷後由 TPN 方式供給
營養二或三天，兩組輸入之TPN 溶液營養素含量均完全相同只有胺基酸組成不
同，如第一部分實驗所述。在燒傷後之48 及 72 小時分別犧牲老鼠，取腹腔吞噬 細胞、血及肝腎肺等器官。
其測定項目為：
1. 肺、肝、腎之過氧化物之測定：根據研究顯示燒燙傷時 neutrophil 會侵襲遠端 器官，造成器官中malondialdehyde(MDA)之濃度增高，使器官受損(9,10)。
測定器官中MDA 之濃度可間接知道器官受損之程度。各器官以 250mM
sucrose, 10mM Hepes 調成 pH 7.4 後，打成 15%之均質液測定其中之 TBARS 濃度(38)。
2. 肺、肝、腎臟抗氧化酵素活性之測定：Saitoh 等人(9)之研究顯示在燒傷 6 小 時後即可看出肺中superoxide dismutase (SOD)之活性明顯較未燒傷組高，顯
示燒傷確會造成較大之氧化壓力。本研究擬測定肺、肝、腎之SOD 及
glutathione peroxidase (GSHPx)活性，來探討 Arg 添加對燒傷老鼠體內抗氧
化酵素活性之影響，並比較不同時間點抗氧化酵素活性之改變。SOD 及
GSHPx 之測定為將 15%之器官均質液，經離心後取 cytosolic fraction 測定其 中之酵素活性(38)。
3. 血漿中乳酸之分析：血漿中乳酸濃度可作為兩組醣解作用進行之依據。
4. 血漿中游離脂肪酸之分析：血漿中游離脂肪酸濃度可知兩組脂解作用進行 之狀況。
5. 血漿中 NO 濃度之測定：測定方法如第一部分所述。可知 GLN 添加對燒傷 異化作用下血中NO 產生之影響。
6. macrophage cytokine 之分泌：測定方法如第一部分所述。
7. T 細胞之反應：測定方法如第一部分所述。
8. 巨噬細胞吞噬綠膿桿菌之能力：測定方法如第一部分所述。
預期結果
預期 GLN 不論燒傷前或後添加於 TPN 溶液中可減輕燒傷所引致之異化作用，
並增強免疫反應，期望將來可實際應用於燒傷之病患。但由於GLN 對 NO 之產 生到底是抑制或促進尚有爭議，可能亦因疾病狀況不同而有不同之影響，因為 燒傷亦屬於一種發炎反應，若GLN 之添加促進 NO 之產生，其對燒傷時所造成
之正面或負面影響仍有待本實驗結果來釐清。
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