猪糞尿廢水處理系統結合人工浮島水培植栽之應用－
不同植物栽種系統中之微生物組成
簡禎嫺，中興大學環境工程研究所碩士班研究生 洪俊雄，中興大學環境工程研究所副教授 王國祥，中興大學生物科技學研究所教授
萬騰州，雲林科技大學環境與安全衛生工程研究所副教授 莊俊德，雲林科技大學環境與安全衛生工程研究所碩士班研究生
許智強，中興大學環境工程研究所碩士班研究生
計畫編號：NSC98-2324-B-005-011-CC1
摘要
養猪廢水具高濃度有機物與高營養鹽之特性，若未經妥善處理而直接排放至 河川，將使大量污染物流入河川中，造成水質污染。本研究結合傳統的三段式廢 水處理系統與植生處理法，以人工浮島植栽方式種植具經濟效益之觀賞植物，藉 由植物生長及受其根圈影響而存在的微生物生態系將污染物轉型或分解，期望以 本處理系統出流水做為灌溉水並同時達到廢水淨化之目的。實驗採用批次式與連 續式反應槽進行相關研究，藉由PCR-DGGE 分析此植生處理系統之微生物組成 變化情形。研究結果顯示，不同植種程序中，大腸桿菌群菌落數皆有逐漸下降的 趨勢，且大腸桿菌菌落數均可維持在10 CFU/100 mL 以下，顯示此系統水質淨化 之功效。經由定序分析，此植生處理系統中存在之微生物如 Acidovorax sp.、光 合菌及其他異營性微生物有助於硝酸鹽氮的去除及有機物的降解，本植生處理系 統除了植物本身生長吸收營養鹽，植物之根圈效應亦有助微生物生長，可有效達 成結合傳統畜牧廢水處理及植生復育技術的系統之廢水淨化目的。
關鍵字：三段式廢水處理系統、人工浮島、PCR-DGGE、植生復育、植栽
一、前言
台灣地區地狹人稠，產業快速發展，因人為活動所產生之污水如生活污水、
工業廢水、畜牧廢水等排入河川，導致河川水質長年受到污染。根據環保署之台 灣地區陸域水體污染來源調查顯示，畜牧廢水佔各類廢水總污染量將近五分之一
中華民國環境工程學會 2010 廢水處理技術研討會
猪糞尿廢水處理系統結合人工浮島水培植栽之應用－不同植物栽種系統中之微生物組成
2
中華民國九十九年十一月十二、十三日 屏東縣國立屏東科技大學環境工程與科學系
(環保署，2008)，其中畜牧廢水排放量以養猪廢水為最大宗。養猪廢水屬高濃度 有機廢水，含有大量糞便固體物，若未經處理即排放至水體中，易導致水體優養 化、產生惡臭、蚊蟲孳生、土壤污染等環境問題，並且會對人體的健康造成危害，
其所產生的問題不容小覷。
一般養猪場常用之三段式廢水處理系統，其流程為固液分離、厭氧消化以及 活性污泥處理單元，正常操作下，此廢水處理系統普遍能將養猪廢水水質處理至 法規標準值以內，但養猪場之廢水處理系統設施逐漸老舊，並因水質急遽變化或 者農民無法應付操作參數變動等因素導致廢水處理效果不彰，排放水質不一定能 達到法規標準值，更常有臭味易散等問題產生(洪，1997)。因此，為解決養猪場 廢水處理效果不佳的污染問題，逐漸發展出許多不同的處理程序，例如上流式厭 氣污泥反應器、AOAO 處理程序、植生處理法等，其中植生處理法具價格便宜、
操作簡單以及無二次污染等優點，使水資源得以永續發展。植生處理系統中，微 生物為污染物去除的重要角色之一(Stottmeister et al., 2003)，因此，本研究結合 傳統的三段式廢水處理系統及新穎的植生復育技術(phytoremediation)，以人工浮 島水培植栽方式將植生復育系統移至養猪場廢水處理放流水槽中，探討此植生處 理系統中微生物族群的變化以及植物根圈之微生物組成分析，評估結合傳統畜牧 廢水處理及植生復育技術的系統之可行性，期望以廢水處理系統之出流水做為灌 溉水並同時達成廢水淨化的目的。
二、材料與方法
1. 模場設置
模場設置於雲林縣林內鄉，本研究於養猪場之傳統的三段式廢水處理系統旁 設置三座反應槽，長5.2 公尺、寬 1.6 公尺、高 0.5 公尺，水深 0.25 公尺，每座 反應槽中放置人工浮島，並在模場外架設一遮雨棚，上半部鋪設防水布，下半部 為透氣防蟲布。反應槽進流水為養猪場之廢水處理場，反應槽設計如圖1，選用 之四種植物分別為雞冠花、羽竹、彩葉草、清香萬壽菊，實驗期間種植之植物如 圖2 所示，各實驗條件如表 1 所示。
圖1 植生復育反應槽設計圖
圖2 各階段種植之植物 表1 各實驗條件
廢水處理場廢 水：地下水
操作條件 種植植物
第一階段 1：20 50 天/批次 雞冠花；羽竹
第二階段 1：7 連續式(HRT=14 天) 彩葉草；清香萬壽菊
2. DNA 萃取
進行DAN 萃取前，取適量水樣以孔徑 0.45 μm 之濾膜過濾後，將濾膜放入 50 mL 之尖底離心管，倒入約 10 mL 之 1×PBS 後，劇烈搖晃尖底離心管後移除 管中之濾膜，再以9000 g 離心 10 分鐘，取出上澄液並將剩餘之沉澱液移至 1.5 mL tube，接著以 8000 g 離心 5 分鐘，取得適量 pellet，再以 VIOGENE 商業套組萃 取樣本中的核酸。商品隨附之標準步驟為，加入200 μL LYS buffer，並懸浮 pellet 使樣品與藥劑混合均勻，放置37℃下 30 分鐘，每隔 5 分鐘需將樣本搖晃均勻。
接著分別加入20 μL proteinase K solution 及 150 μL FX buffer 混合均勻，放置 60℃下 40 分鐘，每隔 5 分鐘需將樣本搖晃均勻，同時以 70℃加熱無菌水；加入 150 μL FX buffer 和 200 μL 異丙醇至樣品中並混合均勻後，將混合液移至 SpinFilter，以 8000 g 離心 2 分鐘過濾混合液，將濾液丟棄，接著加入 500 μL WS buffer 以 8000 g 離心 2 分鐘，並重複此清洗步驟兩次，將濾液移除後再以 8000 g 離心2 分鐘去除殘留液體，再把 SpinFilter 移至新的 1.5 mL tube，加入 200 μL 之 前預熱的無菌水，靜置2~5 分鐘後，高速離心數分鐘，丟棄 SpinFilter 保留濾液 並保存於低溫環境。
3. 聚合酶鏈鎖反應(PCR)
聚合酶鏈鎖反應所需之混合試劑本研究使用PCR master mix(Promega, USA)，
中華民國環境工程學會 2010 廢水處理技術研討會
猪糞尿廢水處理系統結合人工浮島水培植栽之應用－不同植物栽種系統中之微生物組成
4
中華民國九十九年十一月十二、十三日 屏東縣國立屏東科技大學環境工程與科學系
成分包含：25 units/ mL Taq DNA Polymerase、200 μm dNTP 和 1.5 mM MgCl2， 另 外 加 入 適 量 引 子 對 與 稀 釋 過 的 DNA(template) ， 利 用 聚 合 酶 鏈 鎖 反 應 器 iCycleTM Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)操作在三種溫度下循環，以利酵素進行合 成反應，本研究所使用之引子對及其對應之PCR 反應條件如表 2、3 所示。
表2 PCR 所使用之引子對
Primer Spectificity Target site Sequence(5’→3’) Reference 968f-gc Bacteria 16S(968-984) Gc-clamp+AACGCG
AAGAACCTTAC
(Nielsen et al., 1999) 1392r Bacteria 16S(1392-1406) ACGGGCGGTGTGT
AC
(Nielsen et al., 1999) Gc-clamp 序列：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC
(Muyzer et al., 1993) 表3 PCR 反應條件
Primer set Spectificity Program Reference 968f-gc/1392r Bacteria Initial denaturing of 5 min at 95℃;
followed by 28 cycles of 1 min at 94℃,1 min at 54℃,1 min at 72℃;
and final extension at 72℃ for 10 min.
(Nielsen et al., 1999)
4. 變性梯度凝膠電泳分析法 (DGGE)
本研究以 6%(wt/vol)acrylamide/bis 為膠體，變性梯度範圍為 30%~65%，其 配製成分如表4 所示。變性梯度膠配製完成後，使用變性梯度凝膠電泳槽(Dcode gene System, Bio-Rad)，以 80 伏特電壓、60℃下進行電泳 12 小時，最後利用 Ethidium Bromide 進行核酸染色，並以紫外光顯像。經過 PCR 反應放大之產物，
利用 DGGE 分析後，將變性梯度膠放置於照膠台上，透過紫外光照射將膠體上 所顯示之相異的亮帶分別切下來置於無菌水中，經過“freeze-and-thaw”過程以獲 取目標 DNA 片段；為檢視切下的亮帶，需重複進行 PCR-DGGE 與切膠純化的 分析直至確定為單一亮帶為止。最後，所純化的DNA 再利用無 GC clamp 的引 子對將DNA 放大後，即委託明欣生物科技有限公司(Mission Biotech,Taiwan)進行 定 序 分 析 ， 將 經 由 定 序 分 析 所 得 到 之 序 列 利 用 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 網站所提供 Nucleotide Blast 服務，查詢定序結果並與 已知序列進行比對以得知菌相組成。
表4 變性梯度凝膠之配製成分表
Denaturing solution 30% 65%
40% Acrylamide/Bis 3 mL 3mL
50x TAE buffer 0.4 mL 0.4 mL
Formamide 2.4 mL 5.2 mL
Urea 2.52 g 5.46 g
Add H2O to 20 mL 20 mL
10% Ammonium Persulfate Solution(APS) 200 μL 200 μL
TEMED 20 μL 20 μL
三、結果與討論
1. 栽種雞冠花及羽竹之微生物組成分析
於反應槽中分別種植植物雞冠花及羽竹，另設置一反應槽僅放置人工浮島且 未種植植物做為本實驗之空白對照組，其樣本代號分別設定為A1(種植雞冠花之 反應槽)、A2(種植羽竹之反應槽)及 A3(空白對照組)。針對第一週、第二週系統 中微生物族群之分析如圖 3 所示，將 DGGE 圖譜中不同位置之亮帶回收後進行 定序，並將其序列比對結果以NCBI 資料庫提供之 BLAST 軟體進行 16S rDNA 序列之比對，比對結果如表 5 所示，由於 DGGE 圖譜上亮帶位置密集，純化不 易，僅成功獲得兩段目標DNA 序列，分別為 Uncultured bacterium 及 Acidovorax sp.，相似度(identities)分別為 93%及 96%在 DGGE 圖譜上之相對位置如圖 4-4 所 示，Uncultured bacterium 屬於未被定義的菌種，Acidovorax sp.則為脫硝菌食酸菌 屬，屬於β-Proteobacteria，可進行脫硝作用，將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。
以Dice’s ciefficient 計算個樣本微生物多樣性之相似度，第一週 A1 及 A2 之 Dice’s ciefficient 為 0.66，至第二週 Dice’s ciefficient 亦為 0.66，顯示種植雞冠花 或者羽竹，兩者之間微生物族群之變動情形相似，進而推測反應槽啟動到第二週 為止，雞冠花及羽竹對反應槽中微生物族群所造成之影響差異性不大。比較 A1 及A3 樣本之微生物多樣性，其 Dice’s ciefficien 為 0.52，比較 A2 及 A3，其 Dice’s ciefficien 為 0.56，由此結果得知，A1/A2 之微生物族群相似度略高，A1/A3 及 A2/A3 之相似度略低，顯示種植雞冠花及羽竹之兩種反應槽具有較相似之微生物 組成，而未種植植物之反應槽其微生物組成具有差異性。
中華 猪糞
之分 為8 最低 第一 在此
華民國環境工程 糞尿廢水處理系
表5
Uncu
另外針對 分析結果如 82,000 CFU 低分別降至 一週起，各 此系統中數 Uncultured
Acid
程學會 2010 系統結合人工
圖3 第一 (1~2 分 A1 序列分析
Organis Acidovorax ultured bac
對水中之大腸 如圖4 所示
U/100 mL 以 至330 CFU/1 各反應槽中之 數量沒有增加
圖4 植植
A1 A2 A3 1E+0 1E+1 1E+2 1E+3 1E+4 1E+5 1E+6
大腸桿菌群菌落數(CFU/100 mL)
d bacterium dovorax sp.
廢水處理技術 工浮島水培植
一週及第二 分別代表反應
析比對結果 sm
x sp.
cterium
腸桿菌群及
，第三週A 以及570,000
100 mL 及 2 之大腸桿菌 加。
植物雞冠花
第一週 第二週
14000 4100 4800 6100 4600 13000
m
術研討會 植栽之應用－不
6 屏
二週微生物族 應槽啟動第 果
Identit 96%
93%
及大腸桿菌菌 A1 及 A2 具
0，第三週以 200 CFU/10 菌菌落數皆為
花及羽竹反應
週 第三週 第
0 82000 0 570000 5
0 1500
A1 A2 1 2 1 2
不同植物栽種
中華民國九 屏東縣國立屏東
族群分析之 第一週及第二
ties
%
%
菌落數進行 具有最高之大
以後，大腸桿 00 mL(第七 為< 10 CFU
應槽之大腸
第四週 第五週
11000 1300 53000 260
9500 210
A3 1 2
種系統中之微生
九十九年十一 東科技大學環
之DGGE 圖 二週之樣本
Accession N DQ854967 AB354619
行分析，大腸 大腸桿菌群 桿菌群菌落 七週)。大腸 U/100 mL，
腸桿菌群菌落
週 第六週 第
500 9400
650
生物組成
一月十二、十 環境工程與科
圖譜 本)
No.
7.1 9.1
腸桿菌群菌落 群菌落數，分 落數逐漸下降 腸桿菌菌落數 顯示大腸桿
落數
第七週 330 200 900
十三日 科學系
落數 分別 降，
數自 桿菌
2. 栽種彩葉草及芳香萬壽菊微生物族群分析
反應槽分別種植植物彩葉草及芳香萬壽菊，另外設置一反應槽僅放置人工浮 島且未種植植物做為本實驗之空白對照組，其樣本代號分別設定為B1(種植彩葉 草之反應槽)、B2(種植芳香萬壽菊之反應槽)及B3(空白對照組)。B1、B2及B3反 應槽之微生物族群分析如圖5所示，各反應槽中微生物多樣性豐富，經由定序分 析，得知系統中存在有Hylemonella gracilis、Magnetospirillum sp.、Alcaligenes faecalis、Rhodobacter sp.、bacterium AEOC021、Candidatus Accumulibacter、
Verrucomicrobium sp.及Verrucomicrobiaceae bacterium等微生物，其比對結果及 DGGE圖譜上相對代號位置如表6所示。Hylemonella gracilis屬於β-Proteobacteia 菌屬。Magnetospirillum sp.具有趨磁性，為兼性厭氧菌。Alcaligenes faecalis為革 蘭氏陰性菌，全名稱為糞生產鹼桿菌，只以acetate為碳源，而不以其他醣類為碳 源，但是可以還原nitrite (NO2⎯)。Rhodobacter sp.屬於α- Proteobacteia菌屬，可光 合 自 營 ， 也 可 好 氧 及 厭 氧 呼 吸 ， 具 產 氫 之 能 力 。bacterium AEOC021 屬 於 unclassified bacterium。Candidatus Accumulibacter屬於β-Proteobacteia菌屬，化學 異營菌，常被應用於除磷系統中，在Enhanced Biological Phosphorus Removal (EBPR) 程 序 中 和 Phosphate-accumulating Organisms (PAO) 同 屬 重 要 微 生 物 。 Verrucomicrobium sp.屬革蘭氏陰性菌，為化學異營。
表6、各反應槽序列分析比對結果
代號 Organism Identities Accession No.
a Hylemonella gracilis 98% AB539995.1
b Magnetospirillum sp. 91% Y17390.1
c Alcaligenes faecalis 82% FN433013.1
d Rhodobacter sp. 99% GU184187.1
e bacterium AEOC021 93% AB208736.1
f Candidatus Accumulibacter 95% CP001715.1
g Verrucomicrobium sp. 90% GQ304751.1
h Verrucomicrobiaceae bacterium 97% FN554389.1
中華民國環境工程學會 2010 廢水處理技術研討會
猪糞尿廢水處理系統結合人工浮島水培植栽之應用－不同植物栽種系統中之微生物組成
8
中華民國九十九年十一月十二、十三日 屏東縣國立屏東科技大學環境工程與科學系
圖5 B1、B2 及 B3 反應槽之微生物族群分析之 DGGE 圖譜 (M 代表 Marker；1~4 分別代表第一週第四週)
3. 植物根部之微生物族群分析
由於雞冠花根部短，未生長分布至水面下，而羽竹之根部約可生長至水面下 5 cm左右，如圖6所示，因此本研究僅分析羽竹之根部微生物族群。分析結果如 圖7所示，和第二週之A3樣本做比較，羽竹根部之微生物多樣性較單純，微生物 族群數量較少，經由定序分析，如表7所示，第六週羽竹根部之微生物族群包含 Clostridium sp.、Aeromonas veronii及Pseudomonas sp.，而根據第八週之分析結果，
Clostridium sp.並未自第八週之樣本中被分析出來。
(A)雞冠花根部生長情形 (B)羽竹根部生長情形 圖6 雞冠花及羽竹之根部生長情形
M 1 2 3 4 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M
Klebsiella oxytoca Citrobacter koseri Enterobacter sp.
Citrobacter freundii Escherichia coli
d c b a
e
d f d h g
B1 B2 B3
圖7 羽竹根部之微生物族群分析 DGGE 圖譜-(1)第六週羽竹根部；(2)第六週羽 竹根部樣本經PCA 培養基培養；(3)第八週羽竹根部；(4)A3 反應槽
表7 羽竹根部序列分析比對結果
Organism Identities Accession No.
Clostridium sp. 99% AB539901.1 Aeromonas veronii 100% GU735964.1 Pseudomonas sp. 99% EU140961.1
反應槽種植彩葉草及芳香萬壽菊，根據圖8所示，彩葉草及芳香萬壽菊之根 部較雞冠花及羽竹都來得茂密且長，約可長至水面下10-15 cm，而芳香萬壽菊最 長可長至水面下約20 cm，經由PCR-DGGE分析，分析結果如圖9所示，由DGGE 圖譜發現，彩葉草及芳香萬壽菊根部之微生物多樣性較豐富，研究結果顯示，彩 葉草及芳香萬壽菊的根部較羽竹的根部長，生長較茂密，其微生物多樣性也較羽 竹根部之微生物多樣性豐富，因此，初步推測，彩葉草及芳香萬壽菊較具有保存 系統中微生物多樣性之效果。
(A)彩葉草根部生長情形 (B)芳香萬壽菊根部生長情形 圖8 彩葉草及芳香萬壽菊根部生長情形
1 2 3 4
Clostridium sp.
Pseudomonas sp.
Aeromonas veronii
中華民國環境工程學會 2010 廢水處理技術研討會
猪糞尿廢水處理系統結合人工浮島水培植栽之應用－不同植物栽種系統中之微生物組成
10
中華民國九十九年十一月十二、十三日 屏東縣國立屏東科技大學環境工程與科學系
圖9 彩葉草及芳香萬壽菊根部之微生物族群分析DGGE圖譜 (1)彩葉草根部；(2)芳香萬壽菊根部
四、結論
根據植生處理系統中之大腸桿菌群菌落數監測結果，大腸桿菌群菌落數有逐 漸下降的趨勢，且大腸桿菌菌落數均可維持在10 CFU/100 mL 以下，顯示此系統 水質淨化之功效。由定序分析比對結果顯示，各反應槽水樣中均發現 Acidovorax sp.存在，且 Acidovorax sp.可進行脫硝作用將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，推測此菌 株於本系統之硝酸鹽氮的去除上具有貢獻，另外，反應槽中存在之光合菌 (Rhodobacter sp.)與其他化學異營菌亦有助於有機物降解。植物根部微生物族群 分析結果顯示，植物根部周圍存在有好氧異營性微生物，如 Clostridium sp.、
Aeromonas veronii 及 Pseudomonas sp.等，根據植物之根圈效應，植物根部釋放氧 氣有利於微生物生長並有助污染物降解與轉型。綜合上述結論，植生處理系統中，
除了植物本身生長吸收營養鹽，植物之根圈效應亦有助微生物生長，可有效達成 結合傳統畜牧廢水處理及植生復育技術的系統之廢水淨化目的，進一步降低廢水 處理場之出流水污染濃度，減少環境污染問題。
五、參考文獻
1. 行政院環境保護署網站(2008)。(http://www.epa.gov.tw/)
2. 洪嘉謨，三段式猪糞尿處理系統之評估-放流水質與 87 年環保標準比較，畜產 研究(1997)。
1 2
3. Stottmeister, U., Wieer, A., Kuschk, P., Kappelmeyer, U., Ktner, M., Bederski, O., M ler, R. A., Moormann, H. , Effects of plants and microorganisms in constructed wetlands for wastewater treatment. Biotechnology Advances 22, 93-117 (2003).
4. Nielsen, A. T., Liu, W.-T., Filipe, C., Grady, L., Jr., Molin, S., and Stahl, D.A., Identification of a Novel Group of Bacteria in Sludge from a Deteriorated Biological Phosphorus removal Reactor. Applied and Environmental Microbiology 65: 1251-125 (1999).
5. Muyzer, G., de Waal, E.C., and Uitterlinden, A.G., Profiling of Complex Microbial Populations by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Genes Coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology 59: 695-700 (1993).
