蝴蝶蘭光合作用PEPC基因之研究

計畫名稱：蝴蝶蘭光合作用 PEPC 基因之研究

Studies on the PEPC genes of photosynthesis in phalaenopsis

計畫編號：NSC 90-2311-B-006-002

執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日

主持人：

計畫參與人員：黃明德 吳雨哲 洪士賢

執行單位：國立成功大學

一、 中文摘要

磷酸烯醇丙酮酸羧化(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC) 是光合作用型式為 CAM 型及 C4 型植物中初級固定二氧化碳的關鍵酵素之一，使植物能更有效率地利用水分和 氮源，以適應強日照、高溫、乾旱的環境。磷酸烯醇丙酮酸羧化酵素具有不同異構型(isoform)，

在植物基因組中大多是由小型的多基因族系(multigene family)所轉譯。有關 CAM 特異表現的 PEPC 異構型基因成員，目前只在很少數兼性(facultative)CAM 型、一種絕對性(obligate)CAM 型植物被研究過。台灣蝴蝶蘭為絕對性 CAM 植物，對二氧化碳的吸收呈現日韻律現象(diurnal rhythm)，依據前人研究發現其初生葉主行 C3 型代謝，十天後轉為完全 CAM 型代謝，此種光 合作用型式轉換與發育時期之調控機制仍不清楚，因此蝴蝶蘭是作為探討不同 PEPC 異構型 基因的功能、組織與器官特異性表現以及光合作用型式代謝調控之理想模式植物。因此本研 究利用分子生物技術選殖台灣原生種蝴蝶蘭：姬蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)與台灣阿媽 (Phalaenopsis var. amabilis)之 PEPC 基因，並探討其基因組成、結構、基因表現與親源關係。

首先由基因資料庫中植物 PEPC 基因序列之高保留區域設計簡併引子(degenerate primer)，擴 增姬蝴蝶蘭與台灣阿媽的 PEPC 基因片段並選殖定序，得到 1855 與 1848 bp 的基因組序列。

接著利用此 PEPC 基因片段為探針與蝴蝶蘭基因組 DNA 進行南方雜合反應，研究蝴蝶蘭 PEPC 基因的組成情形，結果顯示蝴蝶蘭 PEPC 基因族系為至少包含兩個成員的小型基因族系。由 於 上 述 蝴 蝶 蘭 PEPC 基 因 片 段 在 5’ 端 不 完 整 ， 因 此 以 快 速 擴 增 基 因 組 末 端 法 (Rapid Amplification of Genomic Ends)進行蝴蝶蘭 PEPC 基因 5’端序列的選殖，得到包含起始密碼上 游 63 bp 至下游 168 bp 處的基因片段。此外，也以 RT-PCR 產物作為模板擴增 PEPC 基因之 cDNA 片段並進行選殖與定序，得到之 PEPC 基因 cDNA 序列再與上述選殖到的基因組序列 之表現子序列組合。在姬蝴蝶蘭與台灣阿媽之 cDNA 序列都可轉譯出 965 個氨基酸之完整啟 解讀碼 (open reading frame, ORF)的 2898 bp 基因序列。將此兩種蝴蝶蘭 PEPC 基因序列與其 他植物 PEPC 基因序列進行比對分析，並以聚類分析法構築基因演化樹，結果顯示 PEPC 基 因異構型之分群現象傾向於支持 CAM 型是由較原始的 C3 型演化而來的論點。此外，分別以 蝴蝶蘭葉片、氣生根與花苞的 RNA 進行北方雜合實驗，探討蝴蝶蘭 PEPC 基因的表現情形，

顯示蝴蝶蘭之 PEPC 基因表現不具組織特異性。綜合演化分析與北方雜合實驗的結果，推測 目前選殖到的蝴蝶蘭 PEPC 基因應為持續表現之異構型 (housekeeping isoform)。

關鍵詞：蝴蝶蘭，磷酸烯醇丙酮酸羧化酵素，基因表現 Abstract

Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) is a key enzyme of primary photosynthetic CO2 fixati in C4 and CAM plants. Due to a particularly efficient water and nitrogen us, these plants are generally well adapted to high light intensity, high temperature and water limitation.

Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) catalyzes theβ-carboxylation of phosphoenolpyruvate to yield oxaloacetate and Pi, and is the key enzyme of photosynthesis. It has been reported that plant PEPC including C3, C4 and CAM isoforms are encoded by small gene family. Many PEPC isoforms of C3 and C4 plants have been identified, but little is known about the PEPC genes of CAM plants. Phalaenopsis orchids are obligate CAM plants, and therefore being suitable materials for studying PEPC genes. In this study, we cloned PEPC genes from two native orchids of Taiwan:

Phalaenopsis equestris and Phalaenopsis amabilis, and investigated gene organization, structure, expression and phylogenetic relationships. Primers were designed from highly conserved regions of other plant PEPC genes, and used for the PEPC genomic sequence amplification. Two clones coding for 1855 and 1848 bp PEPC genomic sequences from Phalaenopsis equestris and Phalaenopsis amabilis were isolated and sequenced, respectively. Southern hybridization of

Phalaenopsis genomic DNA with these fragments suggested that there are at least two members in Phalaenopsis PEPC gene family. Since these PEPC fragments mentioned above are not complete in the 5’ region, their upstream genomic sequences were cloned by RAGE (Rapid Amplification of Genomic Ends)( Cormack and Somssich, 1997) method. The resulting sequences are ranging from 63 bp upstream to 168 bp downstream of start codon. Furthermore, cDNA sequences of PEPC gene were also cloned by RT-PCR and subjected to sequencing. These obtained cDNA sequences were then assembled with the exon sequences of genomic clones described above. Both Phalaenopsis equestris and Phalaenopsis amabilis cDNA contig are with an open reading frame (ORF) of 965 amino acids. Both nucleotide and deduced amino acid sequences of PEPC genes of Phalaenopsis orchids and other plants were aligned and analyzed by neighbor-joining method.Phylogenetic analysis of PEPC genes provided support in favor of the view that CAM isoform was derived from the primary C3 isoform under the stress of environments. Northern blot analysis indicated that gene expression of PEPC was not tissue-specific. In conclusion, the results of phylogenetic analysis and Northern analysis suggested that these PEPCs isolated from Phalaenopsis orchid in this study represent the housekeeping isofrom of PEPC.

Keywords: Phalaenopsis, phosphoenolpyruvate carboxylase, gene expression

二、 緣由與目的

景天酸代謝(Crassulacean Acid Metabolism) 並不只侷限於景天科的植物，一些葉片多肉、

多汁液的植物都是屬於 CAM 植物，它們特別適應乾燥的環境，仙人掌就是最佳例子。因為，

CAM 機制使植物對水的利用效率達到極致：CAM 植物每獲得 1 克二氧化碳，只需消耗 50~100 克水分；C4 植物則需 250~300 克；而 C3 植物所需消耗的水分則高達 400~500 克。CAM 機 制在許多方面都與 C4 植物之 PCA cycle 非常相似，除了有兩點特徵不同：(1) 在 C4 植物，

四碳酸的形成與四碳酸的去羧化、二氧化碳的再固定，是藉由 C4 植物特殊的葉片構造來做 一種“空間上”的分隔。而 CAM 植物則是靠著“時間上”的分隔，來區隔四碳酸的形成與四碳酸 的去羧化、二氧化碳的再固定。(2) CAM 植物缺乏像 C4 植物那樣特殊的葉片構造。CAM 植 物在夜間打開氣孔，白天關閉，以減少水分散失。所以，CAM 植物在夜晚進行固碳作用，PEPC 將澱粉、醣類糖解 (glycolysis) 而來的 PEP 與二氧化碳一起羧化成為草醯乙酸，草醯乙酸再 轉化為蘋果酸，然後運送、堆積於大液泡中。到了白天，氣孔關閉，水分不會散失，但也無 法再從大氣中獲得二氧化碳。此刻，儲存於液泡中的蘋果酸被運送出來，進行去羧化作用。

從蘋果酸釋放出來的二氧化碳則進入 C3 卡爾文循環，被轉化成為碳水化合物 (Bonner and Bonner, 1948)。因為 CAM 植物的 PEPC 酵素與去羧化 (decarboxylase) 都存在於細胞溶質 (cytosol)，卻在不同時間作用。所以，為了避免徒勞的羧化/去羧化循環，羧化必須在夜晚啟 動、白天關上，而去羧化 則在白天活化、在夜晚不活化。因此， CAM 植物的 PEPC 酵素具 有兩種不同型式：白天型 (day form)-對蘋果酸敏感、黑夜型 (night form)-對蘋果酸不敏感。

這兩種不同型式的 PEPC 酵素間的轉換，主要是藉著磷酸化與去磷酸化作用來調節的 (Brulfert et al., 1986)。除了短期的晝夜調節，某些植物也會展現長期的調控 (long-term regulation)，並 且可依環境狀況，調節其“CAMness”的程度，例如：冰花 (ice plant，Mesembryanthemum crystallinum)。當這種植物有充足的水分時，大多使用 C3 卡爾文循環固碳，只有在遇到缺水 之逆境 (stress) 時，才會進行 CAM 模式的光合作用。某些植物之 CAM 代謝路徑的運作，是 經由各種不同的環境壓力所誘發的，稱為“兼性”景天酸代謝植物 (facultative CAM plant)。

這種調節形式顯示 CAM 基因的表現，是可以受環境控制的。

磷酸烯醇丙酮酸羧化(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是普遍存在於植物體內的一 種酵素，由四個相同的次單元 (subunit)所組成，每個次單元之分子量約為 100 kDa。PEPC 催 化 PEP 進行β-羧化作用 (β-carboxylation)，在重碳酸鹽 (bicarbonate) 及二價陽離子 (如：

Mg²⁺, Mn²⁺) 共同作用下，產生草醯乙酸 (oxaloacetate, OAA) 及 Pi。PEPC 是一種變構象的 (allosteric) 酵素，其酵素活性會被蘋果酸抑制，也會受到 G-6-P (glucose-6-phosphate) 的活化。

PEPC 在植物體內具有多種功能，例如：供應三羧酸循環 (tricarboxylic acid cycle, TCA cycle) 所需的中間物、提供碳源讓植物進行固氮作用及合成氨基酸、維持植物體內離子及酸鹼平衡、

調節氣孔開闔…等。但是，PEPC 最引人注意的，仍是它在 C4 及 CAM 植物中所扮演的初級 固碳 (initial carbon fixation) 角色 (Osmond and Holtum, 1981 ; Hatch, 1987)。

在 C4 及 CAM 光合作用中，PEPC 都是將大氣中的二氧化碳固定成四碳酸，如：草醯乙 酸、蘋果酸、天冬氨酸的起始羧化。四碳酸經由去羧化作用，在植物細胞內釋放出二氧化碳。

然後，二氧化碳進入卡爾文循環，進行光合作用。在 C4 及 CAM 植物中，PEPC 所催化的初 級羧化作用是分別以空間上 (spatially) 及時間上 (temporally) 的區隔方式被分開的。而基於 生理上的考量，C4 及 CAM 植物之 PEPC 酵素活性必須經由光、暗交替來調節。以避免 CAM 植物在白天進行徒勞的羧化/去羧化循環，也可以減少 C4 植物在黑暗中無限制地使用糖解作 用 而 產 生 的 PEP 。 CAM 植 物 具 有 兩 種 型 式 之 PEPC 酵 素 ： 白 天 型 - 對 蘋 果 酸 敏 感 (malate-sensitive)、黑夜型-對蘋果酸不敏感 (malate-insensitive)。而這兩種型式的 PEPC 酵素 主要是藉著磷酸化作用/去磷酸化作用(phosphorylation/dephosphorylation)來轉換的。夜晚時，

PEPC 酵素 N 端的一個可調節的絲氨酸 (regulatory serine) 被磷酸化，使 PEPC 具有活性，不 會受蘋果酸回饋抑制(feedback inhibition) 的影響；白天時，PEPC 酵素的絲氨酸去磷酸化，並 且受蘋果酸回饋抑制，活性降低 (Jiao and Chollet, 1991)。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酵素(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是光合作用型式為 CAM 型及 C4 型植物中初級固定二氧化碳的關鍵酵素之一，使植物能更有效率地利用水分和 氮源，以適應強日照、高溫、乾旱的環境。磷酸烯醇丙酮酸羧化酵素具有不同異構型(isoform)，

在植物基因組中大多是由小型的多基因族系(multigene family)所轉譯(Gehring et al., 1995;

Cushman and Bohert, 1998a, 1998b; Kawamura et al. 1990)。有關 CAM 特異表現的 PEPC 異構 型基因成員，目前只在很少數兼性(facultative)CAM 型、一種絕對性(obligate)CAM 型植物被 研究過。台灣蝴蝶蘭(Phal. amabilis)為絕對性 CAM 植物，對二氧化碳的吸收呈現日韻律現象 (diurnal rhythm) (Avadhani et al., 1982; Hew et al., 1996)，依據前人研究發現其初生葉主行 C3 型代謝，十天後轉為完全 CAM 型代謝，此種光合作用型式轉換與發育時期之調控機制仍不 清楚，因此蝴蝶蘭是作為探討不同 PEPC 異構型基因的功能、組織與器官特異性表現以及光 合作用型式代謝調控之理想模式植物。蝴蝶蘭的栽培目前雖已能利用溫室控制環境因子，使 其大量生產，但是，蝴蝶蘭的生長速度緩慢，平均約需二～三年才能長成可開花的成株。這 段期間內，溫室的溼度、溫度、光照時間之控制仍須耗費許多物力、人力。本計畫由選殖蝴 蝶蘭 PEPC 基因著手，比較分析不同原生種之基因組成、結構與基因族系之基因成員間分子 演化親緣及其基因表現。因此本研究結果將對蝴蝶蘭光合作用的分子層次特性有較清楚的瞭 解，並能提供蝴蝶蘭產業應用上的有益資料提升蝴蝶蘭的光合作用效率及對逆境的耐受力。

三、 結果與討論

(一)蝴蝶蘭 PEPC 基因片段之選殖與序列分析

依據選殖自七種植物的九個 PEPC 基因之譯碼區中的高保留序列設計引子分別以台灣原 生種的姬蝴蝶蘭 (Phalaenopsis equestris) 與台灣阿媽 (Phalaenopsis amabilis var. formosa) 之 基因組 DNA 為模板，進行聚合酵素連鎖反應擴增蝴蝶蘭的 PEPC 基因片段，產物經電泳分析 後於 2 kb 處出現可能為 PEPC 基因片段的 DNA 條帶，將 DNA 條帶回收並純化後與 pGEM-T Easy Vector 進行接合作用。由姬蝴蝶蘭與台灣阿媽選殖質體分別定序出 1855 bp 與 1848 bp 的 PEPC 基因片段。與已發表之高粱 (Sorghum vulgare) 及香草 (Vanilla planifolia) 之 PEPC

基因序列相比較，結果顯示此二個 PEPC 基因選殖片段中皆含有三個插入子，在 5’端尚缺少 包含轉譯起始密碼 (start codon) 的核甘酸序列，在 3’端則還缺少包括六個表現子的序列。以 此二個蝴蝶蘭 PEPC 基因片段序列進行初步的核干酸相似度比對，發現除了在表現子 III 的相 似度較低 (89 %)，二個蝴蝶蘭 PEPC 基因片段序列在插入子及表現子的序列相似度皆大於 94

%，顯示姬蝴蝶蘭與台灣阿媽的 PEPC 基因序列具有頗高的保留性。分析蝴蝶蘭 PEPC 基因組 片段之序列，發現其中包含表現子 I~IV 與插入子 I~III，於所有插入子的剪接位置 (splice site) 上，皆存在著插入子 5’端以 GT 為開端，3’端以 AG 做為結尾的剪接保留序列 (consensus sequence)。與其他植物如：玉米 (Zea mays, accession No. X15642), 高粱 (Sorghum vulgare, accession No. X59925)之 PEPC 基因組序列比對發現在表現子序列保留性，相似度介於 64-1%；而插入子 I~III 在序列長度上也是變化頗大，因此序列保留性也偏低。總結來說，PEPC 基因的表現子序列在不同物種間具有較高的保留性，而插入子序列則缺乏保留性，但同一物 種的插入子序列卻仍具有頗高的保留性，如：姬蝴蝶蘭與台灣阿媽；因此推論插入子序列雖 然在物種間的保留性偏低，卻可能是用來區別不同物種的依據；也可解釋為何 PEPC 基因的 插入子會多達九個。分析姬蝴蝶蘭與台灣阿媽 PEPC 基因之 cDNA 序列並將其轉譯成氨基酸 序列，結果 PEPC 基因之 cDNA 序列可轉譯成包含十個表現子，全長為 965 個氨基酸的完整 PEPC 基因，姬蝴蝶蘭與台灣阿媽 PEPC 基因之 cDNA 序列及氨基酸序列的相似度非常高，皆 為 97%，顯示蘭科植物之 PEPC 基因序列具有很高的保留性(Figure 1)。在姬蝴蝶蘭與台灣阿 媽 PEPC 基因之氨基酸序列中都可找到與其他植物相同的重要氨基酸 motif, 如：可調節的磷 酸化位置 (regulatory phosphorylation site)— SIDA (氨基酸位置 11-14)；活化中心 (active centre)— GYSDSGKDAG (氨基酸位置 594-603) 以及受質結合位— FHGRGGTVGRGGGP (氨 基酸位置 632-645)；而且其分佈位置與 1998 年發表之蘭科植

物

(二) 蝴蝶蘭 PEPC 基因族系的組成

將姬蝴蝶蘭與台灣阿媽之基因組 DNA 以特定限制酵素切割並電泳分離後，進行南方轉印 實驗，由於姬蝴蝶蘭與台灣阿媽的 PEPC 基因序列的保留性頗高，因此選用限制酵素 EcoR I 切割選殖質體，電泳分離並純化回收 740 bp 的插入片段 (包含姬蝴蝶蘭 PEPC 基因部份表現 子 I 及 II 與插入子 I) 以隨機引子法製作蝴蝶蘭 PEPC 基因序列的放射性探針。結果顯示經限 制酵素 EcoR I、BamH I 與 Hind III 切割的姬蝴蝶蘭基因組 DNA 都只顯示一個雜合反應條帶；

經限制酵素 EcoR I、BamH I 與 Hind III 切割的台灣阿媽基因組 DNA 則分別顯示二個、三個 與一個的雜合反應條帶。另外，也將其他品系之蝴蝶蘭與朵麗蘭之基因組 DNA 以限制酵素 EcoR I 切割並電泳分離後，進行南方轉印實驗，並利用上述之探針進行南方雜合實驗，結果 除了姬蝴蝶蘭只顯示一個雜合反應條帶，其他品系之蝴蝶蘭與朵麗蘭皆顯示二至三個雜合反 應條帶。由於用於製備探針的 PEPC 基因序列沒有 EcoR I 與 Hind III 的切點，因此初步推測 大部份蝴蝶蘭的 PEPC 基因為至少包含二個成員的小型基因族系(Figure 2）。在姬蝴蝶蘭基因 組 DNA 的南方雜合實驗結果都只顯示一個雜合反應條帶，可能是由於南方雜合實驗所用之探 針序列來自於姬蝴蝶蘭，與姬蝴蝶蘭基因組內的其他 PEPC 基因族系成員之序列相差較多，

且雜合反應作用條件過於嚴苛以致無法偵測到其他成員的存在。

(三) 蝴蝶蘭 PEPC 基因之演化分析

將姬蝴蝶蘭與台灣阿媽 PEPC 基因之 cDNA 序列及台灣阿媽 PEPC 基因譯碼區之氨基酸 序列以網際網路傳送至國家衛生研究院 GCG 之 SeqWeb，與基因庫中其他植物已登錄之 PEPC

基因核甘酸與氨基酸序列分別進行排序與比對，然後以聚類分析法 (neighbor-joining method) 建構 PEPC 基因演化樹(Figure 3)。結果無論是以核甘酸序列或氨基酸序列所建構之基因演化 樹皆顯示蝴蝶蘭 PEPC 基因與 Vanilla planifolia 之根型 PEPC 基因 (VpR) 最為相近，推測可 能是由於蝴蝶蘭與 Vanilla planifolia 同為蘭科植物，故其序列相似度較高。此外，觀察以 PEPC 核甘酸序列所構築之演化樹，發現其可明顯區分為單子葉與雙子葉植物兩大群，而單、雙子 葉植物的 PEPC 基因異構型可再各自分為 CAM 型及 C3 型的小分群；在 PEPC 氨基酸序列所 建構的演化樹也可發現這種類似的分群現象；這樣的分群結果與 Gehrig 等人於 1998 年以涵 蓋藻類、苔蘚、蕨類及種子植物門的 12 種植物之 PEPC 基因 3’端的 1100 bp cDNA 序列所構 築之演化樹相吻合(Gehrig, 1998b)；Gehrig 等人依據這種分群現象推論 PEPC 基因在很古老的 年代就已存在於植物體的基因組中，甚至比單、雙子葉植物之分化更早，所以利用 PEPC 基 因序列建構之演化樹都可區分為單子葉與雙子葉兩大分群；而 C3 型 PEPC 為最原始的 PEPC 基因異構型，PEPC 的其他異構型 (CAM 型及 C4 型) 則是後來植物為了適應各種惡劣環境而 演變出來的 (Gehrig et al., 1998b)；因此依據本研究構築之基因演化樹的分群現象也傾向於支 持這種推論。

（四）PC 基因表現之分析

為了瞭解蝴蝶蘭之 PEPC 基因在不同器官內基因表現情形的差異，分別抽取台灣阿媽之 葉片、氣生根與花苞的 total RNA。每種器官的 RNA 各取 10 g 以 glyoxal 處理後，經電泳分 離即進行北方轉印實驗將 RNA 轉漬至耐龍膜。以姬蝴蝶蘭葉片 total RNA 之 RT-PCR 產物作 為模板，ExIIf (5’GTTATGAGCTTTCTGCTG3’)和 ExII(5’CTGCCATGCTTCTGAAGCAA3’) 為引子，進行聚合酵素連鎖反應，擴增姬蝴蝶蘭 PEPC 表現子 II, 大小為 384 bp 之基因片段；

然後以隨機引子法製作放射性探針，進行北方雜合實驗。結果在葉片、氣生根與花苞皆出現 明顯之雜合反應條帶 (Figure 4A )，此條帶依據蝴蝶蘭 25S 與 17S rRNA 在電泳圖的位置估計 其大小約為 2.8 kb，然後再以這一張耐龍膜與作為內控制組之蕃茄 1.2 kb 肌動蛋白 (actin) 基 因探針進行北方雜合實驗，結果顯示進行北方轉印實驗時所取用之葉片、氣生根與花苞 total RNA 的量並不一樣多 (Figure 4B )，可能是由於葉片 sample 內含有 DNA 造成 RNA 濃度的高 估。顯示蝴蝶蘭 PEPC 基因之初級轉錄產物 (primary transcript) 大小約為 2.8 kb, 與姬蝴蝶蘭 選殖到的 PEPC 基因之 cDNA 序列總長相近；且此 PEPC 基因不僅會在葉片 (主要的光合作 用器官) 表現，也可以在其他器官如：氣生根、花苞表現，所以此 PEPC 基因沒有組織特異 性的基因表現情形，與 Vanilla planifolia 之 PpcV2 異構型的表現情形相同 (Gehrig et al., 1998a)，因此初步推測可能為持續表現之 PEPC 基因異構型 (housekeeping isoform)。

四、參考文獻

Avadhani, P. N., Goh, C. J., Rao, A. N. and Arditti, J. (1982) Carbon fixation in orchids. p.173-193.

In: Orchid Biology: Reviews and Perspective II. J. Arditti (ed). Cornell Univ. Press. New York.

Bonner, W. and Bonner, J. (1948) The role of carbon dioxide in acid formation by succulent plants.

Am. J. Bot. 35: 113-117.

Brulfert, J., Vidal, J., Le Marechal, P., Gadal, P. and Queiroz, O. (1986) Phosphorylation-dephosphorylation process as a probable mechanism for the diurnal regulatory changes of phosphoenolpyruvate carboxylase in CAM plants. Biophys. Res. Commun. 136:

151-159.

Cormack, R. S. and Somssich, I. E. (1997) Rapid amplification of genomic ends (RAGE) as a simple method to clone flanking genomic DNA. Gene 194: 273-276.

Cushman, J. C. and Bohnert, H. J. (1989a) Nucleotide sequence of the Ppc2 gene encoding a housekeeping isoform of PEPC from M. crystallinum. Nucleic Acids Res. 17: 6743-6744.

Cushman, J. C. and Bohnert, H. J. (1989b) Nucleotide sequence of the gene encoding a CAM specific isoform of PEPC from M. crystallinum. Nucleic Acids Res. 17: 6745-6746.

Dong, L. Y., Masuda, T., Kawamura, T., Hata, S. and Izui, K. (1998) Cloning, expression and characterization of a root-form phosphoenol-pyruvate carboxylase from Zea mays: comparison with the C4-form enzyme. Plant Cell Physiol. 39: 865-873.

Gehrig, H., Taybi, T., Kluge, M. and Brulfert, J. (1995) Identification of multiple PEPC isogenes in leaves of the facultative Crassulacean acid metabolism plant Kalanchoe blossfeldiana. FEBS Letters 377: 399-402.

Gehrig, H., Faist, K. and Kluge, M. (1998a) Identification of phosphoenolpyruvate carboxylase isoforms in leaf, stem and roots of the obligate CAM plant Vanilla planifolia Salib. (Orchidaceae):

a physiological and molecular approach. Plant Mol. Biol. 38: 1215-1223.

Gehrig, H., Heute, V. and Kluge, M. (1998b) Toward a better knowledge of the evolution of phosphoenolpyruvate carboxylase by comparison of partial cDNA sequences. J. Mol. Evol. 46:

107-114.

Hatch, M. D. (1987) C4 photosynthesis: a unique blend of modified biochemistry, anatomy and ultrastructure. Biochim. Biophys. Acta. 895: 81-106.

Hew, C. J. and Yong, J. W. H. (1996) Photosynthesis. p.38-92. The physiology of tropical orchids in relation to the industry. World scientific publishing.

Jiao, J. and Chollet, R. (1991) Posttranslational regulation of phospho-enolpyruvate carboxylase in C4 and Crassulacean acid metabolism plants. Plant Physiol. 95: 981-985.

Kawamura, T., Shigesada, K., Yanagisawa, S. and Izui, K. (1990) Phosphoenolpyruvate carboxylase prevalent in maize roots: isolation of a cDNA clone and its use for analyses of the gene and gene expression. J. Biochem. 107: 165-168.

Lepiniec, L., Keryer, E., Philippe, H., Gadal, P. and Cretin, C. (1993) Sorghum phosphoenolpyruvate carboxylase gene family: structure, function and molecular evolution. Plant Mol. Biol. 21: 487-502.

Osmond, C. B. and Holtum, J. A. (1981) Crassulacean acid meta-bolism. Biochem. Plants 8:

283-328.

P. equestris 1 MSRSTVERHASIDAQLRLLAPRKVSEDDKLVEYDALLLDRFLDLLQEIHG 50 P. amabilis 1 MSRSTVERHASIDAQLRLLAPRKVSEDDKLVEYDALLLDRFLDILQEIHG 50

P. equestris 51 EDIRETVQECYELSAEYEGNHDSKKLEELGHVLTSLDPGDSIVAAKSFSN 100 P. amabilis 51 EDIRETVQECYELSAEYEATHDSKKLEELGHVLTSLDPGDSIVVAKSFSN 100

P. equestris 101 MLNLANLAEEVQIAFRRRIKLKKGDFVDENSAATESDIEETLRRLVHELK 150 P. amabilis 101 MLNLANLAEEVQIAFRRRIKLKKGDFVDENSAATESDIEETLRRLVHELK 150

P. equestris 151 KFPEEVLDALKNQTIDLVFTAHPTQSVRRSLLQKHGRIRNCLAQLYAKDI 200 P. amabilis 151 KSPEEVFDALKNQTIDLVFTAHPTQSVRRSLLQKHGRIRNWLLQLYAKDI 200

P. equestris 201 TPDAKQELDEALQREIQAAFRTDEIRRTAPTPQDEMRAGMSYFHETIWKG 250 P. amabilis 201 TPDDEQELDETXQREIQAAFRTDEIRRTAPTPQDEMRAGMSYFHETIWKG 250

P. equestris 251 VPKFLRRVDTALKNIGINERVPYNAPLIQFSSWMGGDRDGNPRVTPEVTR 300 P. amabilis 251 VPKFLRRVDTALKNIGINERVPYNAPLIQFSSWMGGDRDGNPRVTPEVTR 300

P. equestris 301 DVCLLARMMAANLYFSQIEDLMFELSMWRCSDELRVRADELHRASKKDAE 350 P. amabilis 301 DVCLLARMMAANLYFSQIEDLMFELSMWRCSDELRVRADELHRASKKDAK 350

P. equestris 351 HYIEFWKQVPPNEPYRVVLADVRDKLYNTRERSRHLLSSGYSDIPEETTL 400 P. amabilis 351 HYIEFWKQVPPNEPYRVVLADVRDKLYNTRERSRHLLSSGSSDIPEETTL 400

P. equestris 401 TNVEQFLEPLELCYSSLCTCGDRPIADGSLLDFMRQVSTFGLSLVRLDIR 450 P. amabilis 401 TNVEQFLEPLELCYSSLCTCGDRPIADGSLLDFMRQVSTFGLSLVRLDIR 450

P. equestris 451 QESDRRTDVLDAITTHLGIGSYRDWSEEQRQEWLLSELSGKRPLFGPDLP 500 P. amabilis 451 QESDRHTDVLDAITTHLGIGSYRDWSEEQRQEWLLSELSGKRPLFGPDLP 500

P. equestris 501 KTEEIADVLDTLRVIAELPHDSFGAYIISMATAASDVLAVELLQRECQVK 550 P. amabilis 501 KTEEIADVLDTLRVIAELPHDSFGAYIISMATAASDVLAVELLQRECQVK 550

P. equestris 551 KPLRVVPLFEKLADLEAAPAALSRPFSINWYRNRIDGKQEVMIGYSDSGK 600 P. amabilis 551 KPLRVVPLFEKLADLEAAPAALSRLFSINWYRNRIDGKQEVMIGYSDSGK 600

P. equestris 601 DAGRLSAAWQLYKAQEDLIKVAKEFGVKLTMFHGRGGTVGRGGGPTHLAI 650 P. amabilis 601 DAGRLSAAWQLYKAQEDLIKVAKEFGVKLTMFHGRGGTVGRGGGPTHLAI 650

P. equestris 651 LSQPPDTIHGSLRVTVQGEVIEQSFGEEHLCFRTLQRFTAATLEHGMHPP 700 P. amabilis 651 LSQPPDTIHGSLRVTVQGEVIEQSFGEEHLCFRTLQRFTAATLEHGMHPP 700

P. equestris 701 ISPKPEWRALLDEMAVVATKEYRSIVFQEPRFVEYFRLATPETEYGRMNI 750 P. amabilis 701 ISPKPEWRALLDEMAVVATKEYRSIVFQEPRFAEYFRLATPETEYGRMNI 750

P. equestris 751 GSRPSKRKPSGGIESLRAIPWIFAWTQTRFHLPVWLGFGTAFKHAIAKDI 800 P. amabilis 751 GSRPSKRKPSGGIESLRAIPWIFAWTQARFHLPVWLGSGTAFKHVVAKDI 800 P. equestris 801 KNLNMLQEMYNEWPFFRVTIDLVEMVFAKGDPGIAALYDKLLVSDDLGHF 850 P. amabilis 801 KNLYMLQEMYNEWPFFRVTIDLVEMVFAKGDPGIAALYDKLLVSDDLWSF 850

P. equestris 851 GERLRANFEETKTLLLQVAGHRDLLEGDPYLKQRLRLRDAYITTLNVCQA 900 P. amabilis 851 GERLRANFEETKTLLLQVAGHRDLLEGDPYLKQRLRLRDAYITTLNVCQA 900

P. equestris 901 FTLKRIRDPSFHVNLRPHLSREIMNSNKPAAELVKLNPTSEYAPGLEDTL 950 P. amabilis 901 FTLKRIRDPSFHVNLRSHLSREIMNSNKPAAELVKLNPTSEYAPGLEDTL 950

P. equestris 951 ILTMKGIAAGLQNTG* 965 P. amabilis 951 ILAMKGIAAGMQNTG* 965

Figure 1 Alignment of Phalaenopsis equestrisand Phalaenopsis amabilis PEPC amino acid Sequences

Both of Phalaenopsis equestris(PpcPe1, GenBanK accession number AJ300741) and Phalaenopsis amabilis(PpcPa1, GenBanK accession number AJ300742) PEPC encode 965 amino acids, and the deduced amino acid sequences were aligned, showing 97% identity. The different amino acids between two PEPCs are singly underlined. The amino acid motifs also known from the PEPC of other plants, the regulatory phosphorylation, active centre and the substrate-binding site are doubly underlined, respectively.

Figure 2 姬蝴蝶蘭與台灣阿媽之南方氏雜合反應結果

(A) 姬蝴蝶蘭與台灣阿媽之基因組 DNA 進行限制酵素切割作用並以電泳分離，

電泳完成之瓊脂凝膠再進行南方氏轉印實驗。Lane 1～3 為姬蝴蝶蘭基因組 DNA 分別 以限制酵素 EcoR I、BamH I 與 Hind III 切割；lane 4～6 為台灣阿媽基因組 DNA 分別 以限制酵素 EcoR I、BamH I 與 Hind III 切割。(B) 以限制酵素 EcoR I 切割選殖質體 pPef1-r1，電泳分離並純化 740 bp 的插入片段，製作蝴蝶蘭 PEPC 基因的放射性探針進 行南方氏雜合實驗。Lane 1～3 都只顯示一個雜合反應條帶；lane 4～6 分別顯示一～三 個雜合反應條帶；lane M 為λ/Hind III marker。

Figure 3 PEPC 基因在台灣阿媽不同器官之表現情形

g 以 glyoxal 處理後，經電泳分離即進行北方轉印實驗將 RNA 轉漬至耐龍膜。先以(A) 姬蝴蝶蘭葉片之 384 bp PEPC 表現子 II cDNA 片段製作放射性探針，進行北方雜合實 驗；再以同一張耐龍膜與(B)蕃茄的 1.2 kb 肌動蛋白 (actin) 基因探針 (作為內控制組) 進行北方雜合實驗。結果在葉片、氣生根與花苞皆具有明顯的雜合反應條帶，其中 PEPC 表現子 II cDNA 片段所雜合之反應條帶，以 25S 與 17S rRNA 為依據，推估其大小約 為 2.8 kb。

Figure 4

以聚類分析法構築蝴蝶蘭 PEPC 基因譯碼區氨基酸序列之演化樹狀圖

NO. AJ300742), Vanilla planifolia (VpC3 Ac. NO. X87149; VpCAM Ac. NO. X87148),

(B) 1 2 3

(A) 1 2 3

Mesembryanthemum crystallinum (McC3 Ac. NO.X14588 , McCAM Ac. NO. X13660), Zea mays (ZmC3 Ac. NO. ABO12228; ZmC4 Ac. NO. X15288), Sorghum vulgare (SvC4 Ac. NO. X55664;, SvC3 Ac. NO. P29194), Glycine max (Ac. NO. AB008540), Nicotiana tabacum (Ac. NO. X59016), Solanum tuberosum (Ac. NO. X67053) 與 Amaranthus hypochondriacus (Ac. NO. Z68125) 共 14 個 PEPC 基因譯碼區氨基酸序列，利用 SeqWeb 之 GrowTree 程式進行聚類分析法所得之演化 樹狀圖。