Study of cultural methods on polysaccharide and ethanol extract product of Antrodia cinnamomea (CCRC36716)
潘若芝、謝建元
E-mail: [email protected]
ABSTRACT
The fruiting body of Antrodia cinnamomea is well known in Taiwan by name niu-chang-chih or jang-jy. This fungus is know only in Taiwan and is restricted to cinnamomum kanehirai Hay. The basidiomes have been used for the treatment of food and drug intoxication, diarrhea, abdominal pain, hypertension,skin itching and cancer. The main purpose of this research was to study the effect of different cultivation conditions on the production of biomass, extracellular polysaccharide and triterpene in submerged culture. In this study 3%C.S.P as the nitrogen source the best cell concentration was found at 12.52g/L and 1% C.S.P as the nitrogen source the best triterpene production was found at 17mg/g-DW. Among the carbon sources 2% glucose had resulted in the highest intracellular polysaccharide concentration (49mg/g) after 10 day’s cultivation. Addition of camphor oil or wood chips of Cinnamomum kanehirae could enhance the production of triterpenes. The addition of sunflower seed oil the exopolysaccharide concentration increases to 873mg/L after 10 day’s cultivation. Increase the concentration of oxygen to 30% in a 5-L jar fermentation, the triterpene concentration was also found increase to 18mg/g-DW.
Keywords : Antrodia cinnamomea ; polysaccharide ; triterpene
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封面內頁 簽名頁 授權書 iii 中文摘要 v 英文摘要 viii 誌謝 viii 目錄 viii 圖目錄 viii 第一章 前言 1 第二章 文獻回顧 2 2.1 樟芝之介紹 2 2.2 食藥用菇之生理活性物質 5 2.3 三帖類化合物 6 2.3.1 樟芝中之三帖類 7 2.4 樟之中之多醣體 9 2.5 液態培養 12 2.5.1 高等蕈類深層培養 12 2.5.1.1 環 境因子對深層培養的影響 13 第三章 實驗材料與方法 17 3.1 實驗材料 17 3.1.1 試驗菌種 17 3.1.2 實驗藥品 17 3.1.3 實驗器材 18 3.2 實驗方法 19 3.2.1 平板培養 19 3.2.2 液態菌?培養 19 3.2.3 基礎平板之試驗 20 3.2.3.1 不同氮源對A.
cinnamomea固態培養基 生長直徑之試驗 20 3.2.4 樣品萃取試驗 21 3.2.4.1 不同萃取方法對於樟 芝三帖類之影響 21 3.2.5 搖瓶液態發酵試驗 21 3.2.5.1 不同濃度氮源 21 3.2.5.2 不同濃度碳源 22 3.2.5.3 不同碳源混合 22 3.2.5.4 時間變化 23 3.2.5.5 添加樟腦油 24 3.2.5.6 添加牛樟木屑 24 3.2.5.7 添加不同油脂 25 3.2.6 探討不同溶氧 26 3.3 分析方 法 27 3.3.1 菌體乾重測定 27 3.3.2 pH測定 27 3.3.3 胞外多醣分析 27 3.3.3.1 酚硫酸法 27 3.3.3.1.1 標準曲線製作步 驟 27 3.3.3.1.2 胞外多醣濃度測定 28 3.3.4 胞內多醣分析 28 3.3.4.1 胞內多醣濃度測定 28 3.3.5 三帖分析 29 3.3.5.1 菇類菌絲體粉末製備 29 3.3.5.2 樣品萃取 29 3.3.5.3三帖含量測定 30 3.3.5.4三帖類化學結構之鑑定 30 第四章 結果與討論 32 4.1 基礎平板之試驗 32 4.1.1 不同氮源對A. cinnamomea固態培養基生長 直徑之影 響 32 4.2 樣品萃取試驗 34 4.2.1 不同萃取方法對於A. cinnamomea三帖類之 影響 34 4.3 液態搖瓶發酵 36 4.3.1 不同濃度氮源對樟芝菌絲體及其生理活性物 質生成之影響 36 4.3.2 不同濃度碳源對樟芝菌絲體及其生理活性物 質生成之影響 44 4.3.3 不同 碳源混合對樟芝菌絲體及其生理活性物 質生成之影響 52 4.3.4 時間變化對樟芝菌絲體及其生理活性物質生 成之影響 55 4.3.5 添加樟腦油對樟芝菌絲體及其生理活性物質 生成之影響 63 4.3.6 添加 木屑對樟芝菌絲體及其生理活性物質生 成之影響 67 4.3.7 不同油脂類對樟芝菌絲體及其生理活性物質 生 成之影響 69 4.3.8 探討不同溶氧對A. cinnamomea於發酵槽中 批次發酵之影響 76 4.3.9 三帖類化 學結構之鑑定 83 第五章 結論 96 參考文獻 97 附錄一 營養源A成分表
102 附錄二 營養源B成分表 103 附錄三 多醣體濃度檢量線 104 附錄四 標準 品Ginsenoside-RC濃度檢量線 105 附錄五 口試問題 106 圖目錄 圖2.1 樟芝子實體萃取物中發現 新的三帖類化合物 10 圖2.2 樟芝子實體萃取物中發現新的三帖類化合物 11 圖4.1 樟芝菌絲體在不同氮源之固態培 養皿上之生長曲線 33 圖4.2 不同方式萃取A. cinnamomea之HPLC層析圖 35 圖4.3 不同氮源對樟芝三帖成分生成之影響 42 圖4.4 不同氮源對樟芝三帖含量生成之影響 43 圖4.5 不同碳源對樟芝三帖成分生成之影響 49 圖4.6 不同濃度 之碳源對樟芝三帖含量生成之影響 50 圖4.7 不同碳源混合對樟芝三帖總量生成之影響 54 圖4.8 以不同濃度氮源探討時間變 化對樟芝菌絲體生成之影響 56 圖4.9 以不同濃度氮源探討時間變化對樟芝菌多醣生成之影響 57圖4.10 以0.5%
C.S.P為氮源探討時間變化對樟芝菌三帖生成 之影響 59 圖4.11 以1.0% C.S.P為氮源探討時間變化對樟芝菌三帖生成 之影 響 60 圖4.12 以1.5% C.S.P為氮源探討時間變化對樟芝菌三帖生成 之影響 61 圖4.13 不同濃度氮源之樟芝三帖含量生長 曲線 62 圖4.14 添加物對樟芝菌三帖生成之影響 65 圖4.15 添加物對樟芝三帖含量生成之影響 66 圖4.16 添加不同油脂對樟 芝菌三帖生成之影響 74 圖4.17 不同濃度之油脂對樟芝三帖總量生成之影響 75 圖4.18 以批次發酵探討不同溶氧對樟芝菌體 生長之影響 77 圖4.19 以批次發酵探討不同溶氧對樟芝菌產生多醣之影響 78 圖4.20 以批次發酵探討21% O2對樟芝菌三帖 生成之影響 80 圖4.21 以批次發酵探討30% O2對樟芝菌三帖生成之影響 81 圖4.22 以批次發酵探討不同溶氧對樟芝三帖含 量之影響 82 圖4.23 子實體及菌絲體經HPLC分析之圖譜 84 圖4.24 子實體peak 1(滯留時間66min)之質譜 85 圖4.25 子實 體peak2(滯留時間68min)之質譜 86 圖4.26 子實體peak3(滯留時間70min)之質譜 87 圖4.27 子實體peak4(滯留時間76min)之質 譜 88 圖4.28 子實體peak 5(滯留時間80min)之質譜 89 圖4.29 菌絲體 component A之質譜 90 圖4.30 菌絲體 component B之質 譜 91 圖4.31 菌絲體 component C之質譜 92 圖4.32 子實體peak 1之核磁共振光譜 93 圖4.33 子實體peak 2之核磁共振光譜 94 圖4.34 子實體peak 3之核磁共振光譜 95 表目錄 表4.1 不同氮源培養10天對A. cinnamomea菌體生成之影響 37 表4.2 不同氮源 培養14天對A. cinnamomea菌體生成之影響 38 表4.3 不同氮源對樟芝菌發酵液呈色及pH之影響 39 表4.4 不同碳源培養10天 對A. cinnamomea菌體生成之影響 45 表4.5 不同碳源培養14天對A. cinnamomea菌體生成之影響 46 表4.6 不同碳源混合培 養10及14天對A. cinnamomea菌體生成 之影響 53 表4.7 添加樟腦油培養10及14天對A. cinnamomea菌體生成之 影響 64 表4.8 添加牛樟木屑培養10及14天對A. cinnamomea菌體生成 之影響 68 表4.9 不同油脂培養10天對A. cinnamomea菌體生 成之影響 70 表4.10 不同油脂培養14天對A. cinnamomea菌體生成之影響 71
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