假馬齒莧的相剋物質對微囊藻的生長影響與作用方式

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國立臺東大學生命科學系碩士論文

指導教授：許振宏博士李炎博士

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻的生長影響與作用方式

The allelochemical of Bacopa monnieri (L.) Wettst on Microcystis sp. Growth and its Physiological Mechanism

研究生：謝宗樺撰

中華民國一零五年七月

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II

國立臺東大學生命科學系碩士論文

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻的生長影響與作用方式

The allelochemical of Bacopa monnieri (L.) Wettst on Microcystis sp. Growth and its Physiological Mechanism

研究生：謝宗樺撰指導教授：許振宏博士

李炎博士

中華民國一零五年七月

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IV

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致謝

首先誠摯的感謝指導教授李炎博士及許振宏博士，兩位老師悉心的叮嚀與建議，是本篇論文能順利完成的重要助力。在這求知研究期間，因為李老師的帶領與指導，使我能逐漸架構起實驗方向，並完成其實驗與研究結果，也因為許老師的指點與建議，使我能將此篇論文修訂的更臻完善，並從中獲益更多學識。而兩位對學問的嚴謹與態度，更已成為我在學習過程上的典範與楷模。

本論文的完成，也必須感謝屏東科技大學生物科技系的徐志宏博士，感謝老師您不辭辛勞地來至臺東協助口試審查與論文修訂，因為有您的體諒與幫忙，而使得本論文能夠更完整而嚴謹。

而於這就學期間，我必須感謝俞穎與奎道兩位，謝謝你們成為我的實驗室夥伴，讓我能在這兩年時間裡能如此快樂並安穩度過。俞穎，謝謝你在統計與化學分析上的鼎力相助，讓我能得以快速而順利的學習應用，也謝謝你能與我共同擔任課程助理，分擔課程準備上的重擔。奎道，也謝謝你在這些期間聽我的牢騷與發洩，讓我可以最自然真誠的樣子來面對所有事物，並讓我毫不畏懼地接受各項困難與挑戰。同時，也必須感謝一起在班上奮鬥努力的德儀、嘉榮、郁雯、宗諺、曉凡，不同領域的知識交流與討論，都已成為我寶貴的記憶與回憶，在這當中，要特別感謝德儀在氣相層析上的操作與協助，讓本篇論文的結果更為豐富與討論性。最後，也必須感謝郁惠學姊與怡菁學姊，因為有兩位系辦助理一路上的幫助，讓我能準時順利地取得身心整合與運動休閒產業學系與生命科學系兩所學士資格，也才能於今日以碩士身分向各位至上深切致意，對此真的十分感謝兩位。

最後，謹以此文獻給我摯愛的雙親與東大膳務部的所有人員。謝謝我的雙親，您們給予我支持與鼓勵，是我追逐理想與目標中不可或缺的背後動力。也謝謝東大膳務部的老闆、家婕學姊、湘勤姊、素吟姊、柏宇、佳霖，您們在這六年期間的照顧，給予我心中許多照料與溫暖，對此，希望能在最後將這份榮耀與像家人般的你們分享。

謝宗樺謹致 中華民國 105 年 7 月

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VI

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻的生長影響與作用方式

作者：謝宗樺

國立臺東大學生命科學系

摘要

近年來, 水體優養化與藍菌藻華問題日益嚴峻, 水體的景觀和生態功能受到嚴重影響。如何有效控制藍菌藻華, 治理優養化水體是目前水環境領域的研究熱點和前沿。而利用植物化感作用抑制有害藻類生長，在最近已經備受世界各國所關注。在本研究中，於共培養與種植水條件下，來研究假馬齒莧對微囊藻的化感抑制作用。並以氣相層析儀分離脂肪酸類相剋物質。最後，透過測定微囊藻的葉綠素 a 濃

度與 K

⁺

滲出量，來研究假馬齒莧對微囊藻的化感抑制機制。

結果顯示，共培養組在 100 克濕重/升時對微囊藻的抑制率可以達到 97.7%，而種植水組在 100%濃度下其抑制率則達到 86.1%。透過氣相層析儀分離出三個未知的脂肪酸類相剋物質。而在培養過程中，

微囊藻的葉綠素 a 受到了損傷。然而在 K

⁺

滲出量實驗中，控制組與

處理組間並沒有顯著差異。這些結果顯示出假馬齒莧能抑制微囊藻的生長，而其相剋物質的主要作用機制在於葉綠素 a 的破壞。

關鍵詞：假馬齒莧、微囊藻、化感作用

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VII

The allelochemical of Bacopa monnieri (L.) Wettst on Microcystis sp. Growth and its Physiological Mechanism

Tsung-Hua Hsieh

Abstract

In recent years, water eutrophication and cyanobacteria blooms have been serious problems influencing the landscape and ecological functions of water bodies. How to control cyanobacteria blooms and water eutrophication efficiently is recognized as vanguard and hot-spot issue in the field of water environment research. The inhibitory allelopathy of plants on harmful algae growth have been receiving world-wide concern recently. In this study,

i

nhibitory effects of Bacopa monnieri (L.) Wettst on Microcystis sp. were studied under co-cultivation and culture waters conditions. The allelopathic fatty acid was isolated by gas chromatography. Finally, the chlorophyll-a and efflux of K

⁺

were determined to study the inhibition of Microcystis sp. by B. monnieri.

Results of co-cultivation group showed that the inhibitory rate of Microcystis sp. could reach 97.7% at 100 g FW·L

^-1

, while the inhibitory rate of the culture waters group could reach 86.1% at 100% concentration.

Three unknown allelopathic fatty acid was isolated by gas chromatography. The chlorophyll-a of Microcystis sp. was damaged during the cultivation. However, in experiment of efflux of K

⁺

, there was no significant difference between the control and the treatment. These results showed that B. monnieri. could inhibit the growth of Microcystis sp.and its main mechanism of allelochemical could cause destruction of the chlorophyll-a.

Keywords：Bacopa monnieri (L.) Wettst, Microcystis, allelopathy

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VIII

表目錄

表一、貧養與優養湖泊的區分特徵（林與黃, 2000） ... 5 表二、聯合國經濟合作發展組織單一參數判定優養化之標準（OECD, 1982）6 表三、卡爾森單一參數判定優養化之標準（Carlson, 1977） ... 6 表四、美國環境保護署單一參數判定優養化之標準（U.S. EPA, 1974） ... 7 表五、湖泊與水庫等水體在不同優養狀態下中常見之浮游植物（ Ryding& Rast,

1989） ... 7 表六、藍細菌(Cyanobacteria)與其可能產生之毒素(Svrcek & Smith, 2004)... 19 表七、各種脂肪酸對抑制微囊藻生長的能力評估 ... 38

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圖目錄

圖一、天然性與人為性優養化過程之比較 (Coastal Environmental/ PBS&J,

Inc.,1998) ... 4

圖二、水生植物生活型與其水生環境間的關係（ French et al., 2009 ） ... 11

圖三、植物相剋物質主要生物合成途徑（ Wang et al., 2007） ... 14

圖四、假馬齒莧的外觀 ... 16

圖五、去除藻華現象後，圈地內葉綠素 a 濃度的變化 (Pan et al., 2006) ... 19

圖六、研究實驗架構圖 ... 23

圖七、吸光值與微囊藻細胞濃度關係之檢量線 ... 28

圖八、種植水組對微囊藻的生長抑制曲線 ... 29

圖九、共培養組對微囊藻的生長抑制曲線 ... 30

圖十、假馬齒莧的相剋作用物質的分離結果 ... 32

圖十一、微囊藻葉綠素 a 含量變化與作用天數關係 ... 33

圖十二、微囊藻於假馬齒莧樣水中 K⁺離子滲出含量與接觸時間關係 ... 33

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第一章、緒論

第一節前言

在 20 世紀以來，隨著人為活動的改變與經濟發展的加速，促使大量的氮、磷等營養物質進入水體之中，從而加速了有機汙染與水體優養化 (Eutrophication) 的問題發生。在這當中，水體優養化將導致藻類與藍菌等水生生物數量異常增長，促使藻華現象頻繁發生，進而造成水域生態景觀的破壞與水體生態結構的失衡。此外，像是藍菌藻華這類有害的藻華現象，甚至會進一步對動物和人類的健康造成嚴重威脅，而微囊藻更是藻華現象形成原因與產生微囊藻毒素中最重要的屬別（ Azevedo, 2002）。因此，抑制微囊藻的生長已經成為控制藍菌藻華發展的關鍵所在（ Chen, 2004; Pan, 2006）。

而目前處置藻華現象的方法，大致可分為物理、化學與生物技術三類，但其綜合評估上皆具有部分缺點存在，而在此防治困境中，水生植物的化感作用正逐漸被國內外的學者所關注研究。這原因在於水生植物普遍存在於水體當中，且同時具有容易獲取、栽種、移植與數量豐富等優勢條件。此外，水生植物能透過自身生理機制來提高水質透明度與維持水體的清澈狀態，同時其所釋放產生的相剋物質，能在水體環境中自然降解，不會在生態系統中長期累積。而這些優勢特點，充分展示著重要的生態安全意義，並藉由研究水生態系統生物間的化學生態作用機制，來深入探討與發展應用，進而作為一種嶄新且有發展潛力的生物防治方法。

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第二節研究動機

在近年來，水體優養化與藻華現象爆發的問題日益嚴峻，為此，找尋安全且有效的防治方法，已經成為目前生態環境領域研究的趨勢與發展方向。而利用水生植物的化感作用，作為修復與維持水體透明清澈狀態的生物處置方法，已經透過國內外許多學者進行研究並投入實地應用。但在這當中，水生植物可應用的屬別種類並不夠完整，其中僅對少數種類進行了詳細探討與報導。

而假馬齒莧在其自然環境分佈上，具有生長地區廣泛與植株環境適應能力高等優勢條件。同時研究指出，假馬齒莧更具有積聚重金屬的能力，但在這當中，欠缺更多的生態應用方式。而在臺東市森林公園內的琵琶湖中，我們發現到在有假馬齒莧生長的水域中，其水體水質清澈透明，與此相比，附近湖泊的水質便顯地較為混濁不清，甚至有藻類大量生長與優養化的現象發生。因此，本研究中將選定假馬齒莧作為主要研究的水生植物，透過實驗與研究分析，來討論假馬齒莧在藻華現象的防治潛力與應用的可能性，並作為未來生態修復與環境治理的參考選項之一。

第三節研究目的

本篇研究中，將選定假馬齒莧作為主要研究的水生植物，來探討其植株可否抑制藻華現象中主要的微囊藻屬別，並進步探討假馬齒莧所釋放的相剋物質類別，與相剋物質透過何種抑制機制來影響微囊藻的生長。

本篇研究期望能透過討論假馬齒莧與微囊藻屬之間作用的關係，來進步擴展至藻華現象的防治，成為未來具有發展潛力的生物防治方式。

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第二章、文獻回顧

第一節水質優養化的形成與其程度分類

優養化又稱為富營養化 (eutrophication)，意指由於湖泊、河流與水庫等水體中氮磷等營養物質含量過多，而引起的水質變化現象。而在水體當中，隨著氮化物和磷酸鹽濃度增高，將會引起藻類、藍菌與其他浮游生物快速繁殖，進而導致水體溶氧含量下降或耗盡，促使藻類、藍菌、浮游生物、植物、水生生物與魚類等生物窒息而亡。

一、營養物質來源

在水體營養物質的來源上，大致可分為下述二大類，而其優養化過程之時程與因素差異如圖一所示：

（一）天然性優養化（ Natural Eutrophication ）

天然性優養化是一種自然演替過程，在自然狀態下，最初於水體中所溶解的各種礦物鹽類營養物質的含量都很少，當中氮化物和磷酸鹽濃度偏低且不易累積。而這項因素，將會限制藻類、藍菌與其他浮游生物的生長現象。但隨著歲月增長，雨水自上游集水區的山坡上沖蝕溶解各類鹽類物質後，將匯聚成溪流而流至水體內部累積，使水體內的氮化物和磷酸鹽的濃度逐漸增加，進而加速藻類、藍菌與其他浮游生物的繁殖速度，改變了水生態系統中生物的競爭關係與空間生態位（ Ecological niche）的變化。隨後加上泥沙沉積，水體將會開始逐漸老化，並轉變為溼地或陸地。

所以在這項自然演替過程過程中，會伴隨著自然營養鹽的沉降與累積，使初期水域生態的「貧養（ Oligotroph y）」逐漸因為營養鹽的增加而轉變成為「普養（ Mesotroph y）」，最後會進入晚期的「優養（ Eutroph y）」狀態。而這項轉變過程是自然且不可逆的現象，通常會歷經數百年至數千年的時間來完成演替過程，換句話說，這項現象也是水體自然老化的變化過程。因此，天然性優養化並不會對生態環境造成嚴重衝擊或不利影響。

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（二）人為性優養化（ Cultural Eutrophication）

人為性優養化通常與集水區的土地利用不當或水體上的人為活動增加有所關係，其中隨著人類的臨水而居與集水區的開發利用行為，或是山坡地植被破壞、蔬果栽種與遊憩活動，都會使土壤內的氮化物和硝酸鹽物質大量帶入湖泊或水庫等水體之中，導致內部的藻類、藍菌與其他浮游生物大量繁殖，進而促使水域生態的急劇變化與水質的嚴重惡化。

而對於水體內的藻類、藍菌與其他浮游生物來說，一般而言，影響其生長的主要因素有營養鹽、日照、氣候、滯留時間等，而其中營養鹽為當中最主要的影響因素。而人為所排放的農藥、肥料、大量廢水與洗衣粉等汙染物質，當中富含豐富的硝酸鹽與磷酸鹽，經分解利用後可成為水體內生物所需的養分來源，但過於豐富的營養，會使這些生物的生長產生異常，而其呼吸作用會進一步造成水體溶氧迅速消耗，促使魚類等水中生物無法生存而出現大量死亡。在此同時，屍體分解會消耗水中的氧氣，進而形成不斷缺氧的惡性循環，最後，水域生態崩壞，將會急劇地改變及加速自然優養化的過程，並直接或間接地影響水資源的可利用性。

圖一、天然性與人為性優養化過程之比較 (Coastal Environmental/ PBS&J, Inc.,1998)

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二、優養化程度分類

（一）定性指標

水體優養化，可依據浮游性生物繁殖量、水質透明度等特徵，來評估優養化程度。而根據優養化程度，可概分為下述三類，而其水體區分特徵則於表一所示：

1. 貧養性（ Ol i got rophi c）：人類活動少，低度開發下的集水區，即為貧養。如：水庫、湖泊等水體形成之初，水體養分含量低，浮游動、植物含量少，生物歧異度高，水體溶氧量高，透光性良好，水體水質佳。

2. 中養性（ M esot rophic）：此階段為貧養及優養間的過渡期，營養鹽濃度逐漸轉高，且浮游動、植物含量漸增，生物歧異度相對逐漸降低，水體溶氧量與透光性位於中等範圍，水體水質中等。

3. 優養性（ Eut rophic）：營養鹽隨著時間而大量增加，促使藻類大量繁殖，浮游動、植物大量繁殖，生物歧異度低，水體底層嚴重缺氧，懸浮顆粒及殘留物質增加，使水體透明度相對顯著降低而混濁，水體水質劣化。

表一、貧養與優養湖泊的區分特徵（林與黃, 2000）

貧養水體優養水體

營養鹽輸入量低高

深度深淺

表層水與下層水比例 <1 >1

水色清澈碧綠

基礎生產量低(50-300 mg C m^-2d^-1) 高(>1000 mg C m^-2d^-1) 藻類生物量少(0.02-0.1 mg C l^-1 或

0.3-3 μg Chl a l^-1)

多(>0.3 mg C l^-1 或 10-500 μg Chl a l^-1)

營養鹽濃度低。總磷濃度(季節充分

混合後)<10 μg l^-1

多。總磷濃度(季節充分混合後)>30 μg l^-1

藍菌少大量生長(藻華)

底層水氧飽合度 >50% 缺氧，甚至無氧

溶氧隨水深趨勢線緩降急降

底土表面氧化狀態(呈黃色) 還原狀態(呈黑色)

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（二）定量指標

定量指標分類是將各項優養化之理化參數加以量化，然後依照其選定使用的指標法來評定水體優養化之程度，其評估結果相對較客觀且爭議較小。各種指標法可依所用參數之多寡，而區分為單一指數指標法與多變數指標法，詳細內容如下方所述：

1. 單一參數指標法：單一參數指標採用各種營養鹽濃度、水中物理參數及藻類或浮游動物，而其評定基準係以該單項指標是否超過界限值為準，可單獨作為水質優養化程度之判定標準。但由於單一參數指標法所使用之參數易受季節影響而有明顯的變動，導致透明度及總磷參數兩者數值會有偏差，可能無法反映實際優養化程度。一般而言，目前有三項標準値可作為水體優養化程度之判斷依據，包括聯合國經濟合作發展組織（ Organization for Economi c Co -operat ion and Devel opm ent , OECD , 1982）調查檢定標準法、卡爾森判定標準法（ Carlson, 1977）與美國環境保護署（ U.S. Environmental Protection Agency, U.S. EPA, 1974）制定的單項營養鹽濃度優養判定標準法，採用總磷、葉綠素 a 及透明度作為水質參數的數值依據。而關於水質參數與水體優養程度之關係，如下方表二至表四所示。

表二、聯合國經濟合作發展組織單一參數判定優養化之標準（OECD, 1982）

等級總磷（μg/L）葉綠素-a（μg/L）透明度(m)

貧養＜7.9 ＜2.0 ＞4.6

貧養～中養 8~11 2.1~2.9 4.5~3.8

中養 12~27 3.0~6.9 3.7~2.4

中養～優養 28~39 7.0~9.9 2.3~1.8

優養＞40 ＞10 ＜1.7

表三、卡爾森單一參數判定優養化之標準（Carlson, 1977）

貧養＜12 ＜2.6 ＞4

中養 12~24 2.6~7.2 2~4

優養＞24 ＞7.2 ＜2

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表四、美國環境保護署單一參數判定優養化之標準（U.S. EPA, 1974）

貧養＜10 ＜4 ＞3.7

中養 10~20 4~10 2~3.7

優養＞20 ＞10 ＜2

2. 多變數指標法：水體優養化起始主要原因在於營養鹽含量的增加，因此判斷水體優養化的程度，水中營養鹽氮及磷即為重要指標。此外，營養鹽濃度增加，會間接造成藻類大量繁殖，促使水中葉綠素 a 增高與透明度降低，故計算水體優養化多以總磷量、葉綠素 a、總有機氮及透明度一起做為計算參數來進行分析評估。一般而言，以卡爾森優養指數法（ Carlson, 1977）、Morihiro 優養指數法（ Aizaki, 1981）與北卡優養指數法（ Weiss et al., 1985）

等較為常見，其計算上皆以上述多項水質複合參數進行評估。

（三）生物性指標

優養化作用，會造成水體中的生物種類與數量產生極大的變化，而不同營養程度狀態下，營養物濃度與氮磷比例均會有所差異，這不僅會改變浮游植物的生物質量，其種類也會隨之產生變化。因此在傳統生物指標上，會選擇浮游植物作為水體優養化指標，並以水中出現之浮游植物種類為指標依據。但該項指標需能明確鑑定浮游植物種類及其生長之水質狀況，若在鑑定浮游植物種名上出現困難時，該項方法將會受到限制。而關於不同優養狀態與浮游植物間的關係，如下方表五所示。

表五、湖泊與水庫等水體在不同優養狀態下中常見之浮游植物（ Ryding& Rast, 1989）

貧養狀態優養狀態

綠藻：Staurastrum, Oocystis, Closterium；矽藻：Tabellaria, Navicula, Cyclotella, Gomphonema, Achnanthes；金藻：Dinobryon

綠藻：Pediastrum, Chlorella, Scenedesmus；矽藻：Melosira, Asterionella, Fragilaria,

Stephanodiscus；藍菌：

Aphanizomenon, Anabaena, Microcystis, Oscillatoria；甲藻：

Peridinium, Gymnodinium；裸藻：

Euglena

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（四）生化需氧量（ BOD）

水體中的微生物，將水中有機物分解成無機質的氧化過程中所需要的溶解氧量，稱作為生化需氧量（ Biochemical Oxygen Dem and, BOD ）。因生物為有機物所構成，分解過程將會需要消耗大量氧氣，而如果水中的氧氣降低到魚類等生物無法生存時，將使更多藻類、魚類死去，該水域就宣告死亡，因此生化需氧量能間接作為優養化程度的參考依據。

在常用標準測定上，是在 20℃ 下經過 5 天，對每公升消耗多少毫克的氧氣進行紀錄。而生化需氧量偏高時，表示在水中分解的有機物濃度高，汙染程度也隨之增高。而水體中的有機物，主要來自於自然界中森林的落葉，或是人類排放的工廠、城市的廢水與農業廢棄物等。但是，即使水體不受污染，大自然的植物腐蝕及沖蝕現象，也會使河川有一最低的生化需氧量濃度，而其值大約是 1~2 mg/L。

（五）化學需氧量（ COD）

化學需氧量（ Chemical Ox ygen Demand, COD）是以化學方法測量水樣中有機物被強氧化劑氧化時所消耗之氧的相當量，用以表示水中有機物量的多寡。當水中有機污染物越多，生化需氧量和化學需氧量也會提高，而一個良好的水體將具有較高的溶氧量及偏低的生化需氧量與化學需氧量。

當水中的污染物超過了一定的限度，水體中的溶氧量就會大量降低，而生化需氧量和化學需氧量也相對的提高，水中浮游生物的種類及作用型態也跟著改變，產生甲烷、硫化物、氨等惡臭物質。在這樣生態環境中，將不適合一般魚類生存，同時更會影響都市觀瞻及環境衛生，甚至威脅到自來水的供應和農產品的安全性。

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第二節優養化與藻華形成的關係與控制

水體優養化由於在水中含有過量的氮磷物質，這導致浮游植物

（藻類、藍菌等）異常繁殖而形成藻華（ Algal bloom），因此，藻華被定義為水體一些浮游植物過度繁殖，在水體表面大量聚集到達一種極為顯著的現象。所以，優養化所造成的影響應歸因於藻類的大量繁殖，水中營養物質則是決定藻類生長的主要因素。而浮游植物會吸收水中的營養元素，如氮（常以 NO₃^-形式吸收）、磷（常以磷酸鹽形式吸收）、硫（常以 SO42 -

之形式吸收）和一些微量元素如鈉、鉀、鈣、鎂、鐵、銅、鉬等來大量生長，最後形成藻華現象。在這當中，可以發現藻華大多是由一些單細胞物類大量繁殖所引起的，其浮游植物種類大多數為藍菌門（ C yanobacteria）的微囊藻 (Microcystis)、魚腥藻

（ Anabaena）、束絲藻（ Aphanizomenon ）、顫藻（ Oscillatoria）；綠藻門（ Chlorophyta）的小球藻（ Chlorella）；甲藻門（ Dinoflagellat e）

的多甲藻（ Peridinium）；裸藻門（ Euglenophyta）的裸藻（ Euglena）；

金藻門（ Chrysophyta）等（陳等人 , 2010）。

藻華常發生於流速緩慢的河川及水庫，因其上下移動性較差；反之，若水體混合情況良好，則藍綠細菌就不易聚集。故水體上下移動及混合情況是藍綠細菌藻華形成的最關鍵決定因子，其他營養源通常只是決定藻華形成程度大小之因子（ Cooperative Research Center, 2004）。而藻華對於水體生態與人類日常飲用水品質都會造成許多負面影響，其主要原因在於浮游植物大量繁殖，會使顆粒性與溶解性有機物增加，導致水體透視度降低，而直接威脅到用水品質。因此，找出導致優養化問題的基本原因並加以控制，為解決藻華問題的治本方法。透過控制外部氮磷營養物質進入水體之中，再輔以內部管制與汙水處理來逐步縮小藻華範圍，並加強環境、生態、生物和氣象水文等領域的交流與合作，聯合開展藻華過程及其調控機理研究，藉由分析各種物理、化學和生物因數對藻華發生、發展和消亡的調控作用和機制，以適應藻華特有的多時空尺度過程變動的複雜性，這些皆為目前防治與控制藻華現象的應用策略（陳與潘 , 2011）。

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第三節水生植物的定義與發展概況

水生植物（ Aquatic plants）是一種在生態學範疇上的分類類群，並廣泛分布於各種水體當中，而與其他植物相比，水生植物對於水分的要求與依賴遠遠高於其他各類植物，因此在生活習性上，有其獨特性與生態意義存在。

一、水生植物的定義與分類

水生植物是屬於生態學的名詞，其定義因各研究者的認定而有所不同。依據最初文獻定義，水生植物是一種具有可在水中繁殖的休眠芽，其營養器官為沉水或浮水的植物（ Raunkiaer, 1937）。但隨生態研究進展，其定義開始產生爭議。在狹義定義中，指的只有生長及多樣的生物相，特指在淡水水域中的草本維管束植物，當中僅包括蕨類植物與種子植物。而在廣義定義中，水生植物則是涵蓋了所有水域中的孢子植物與種子植物，當中包括藻類植物、苔蘚植物、蕨類植物以及草本與木本的種子植物等等；而其水域則包括了淡水域（ fresh wat er）、海水域（ sea wat er），以及淡海水交接處的汽水域（ brackish wat er）（大滝、石戶 , 1980 ；楊等人 , 2001）。另外，在水生植物生活史的觀察定義上，認定為在生活史中大部分時期是生長在多水的環境中，以完成其生活史的植物（李 , 2005）。而因其前述對於水生植物定義上的差異，目前國內外學者普遍以植物的生活型（ life-form）作為其主要定義與分類依據，其原因在於對於同一生活型的生物而言，其形態通常會有所相似，同時在適應的特點上也是類似的，這在探討環境對植物生長和分布的影響上，有著密切的關係依據。而根據其生活型，可以分為挺水植物、浮葉植物、漂浮植物與沉水植物四類（ Wetzel, 1983）。而在同一水體中，各生活型水生植物的分布成一定規律，自沿岸帶向深水區呈連續分布態，依次為挺水植物 -浮葉植物 -漂浮植物 -沉水植物（劉 , 1999），而其水生植物與水生環境的關係，如圖二所示；其分類定義與生活型特性如下所述：

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圖二、水生植物生活型與其水生環境間的關係（ French et al., 200 9 ）

（一）挺水植物（ Marginal plants）

挺水植物是指其根、根狀莖生長在水體底泥中，其莖、葉挺出水面的水生植物，當中包括草本與木本植物兩類。常分布於 0~1.5 m 的淺水處，其中有部分種類會生長於潮濕的岸邊。此類植物在空氣中的部分具有陸生植物的特徵，而生長在水中的根或地下莖的部分則具有水生植物的特徵，其花則多數在水面上開放。而代表植物如蘆葦、菖蒲、香蒲等。

當中以植物生長情況可再細分為挺水狀與蔓生狀兩類。挺水狀水生植物通常具地下根莖，莖葉具發達的機械支持構造而能挺立出水面；而蔓生狀水生植物的莖細長，在水面蔓延生長。有些種類有兩型葉的現象，即在水中的莖節長出水中葉，而末端彎升出水面的部份則長出空中葉，當中有些則發展出特化漂浮構造。

（二）浮葉植物（ Rooted Floating Plants）

浮葉植物是指葉片漂浮於水面，而根部紮生於水體底泥水生植物，在水底和水面之間具有細長的枝條或葉柄，可隨水位漲落而維持浮水葉漂浮在水面的狀態，通常沉水部份能長出和浮水葉不同型態的水中葉。而代表植物如玉蓮、睡蓮、荇菜等。

當中以植物生長情況可再細分為叢生狀與蔓生狀兩類。叢生狀水生植物具有橫向的地下根莖或球莖，但不具有水中蔓生的莖，浮水葉具細長柔軟的葉柄，叢狀排列；蔓生狀水生植物少數具有根莖，有在水中蔓生的莖，末端接近水面，但莖葉不挺出水面（除非族群過於擁擠，或水位下降過低）。

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（三）漂浮植物（ Free-floating Plants）

漂浮植物是指整個植物體懸浮於水面，而根沉於水中而不接觸水體底泥，而此般生活特性，會使漂浮植物容易受到水流的影響而四處漂流，對此這些植物的根系會較為發達，有時根系的比例會遠遠超過上端莖葉的比例，因此漂浮植物的根部通常會對植物體的平衡有所幫助，使植物體不致於翻覆。而代表植物如鳳眼蓮、浮萍等。

當中以植物生長情況可再細分為漂浮狀與懸浮狀兩類。漂浮狀水生植物植物體多呈扁平狀，上方莖葉具角質或絨毛等疏水組織，以及儲氣漂浮之構造；下端沉水部份則為具吸收水中養份作用，和平衡作用的根系或根狀葉，有些甚至無根；懸浮狀水生植物植物體漂浮在水面之下，但不露出水面，能以細長蔓狀的莖葉攀附在其他水生植物身上；或以叉狀葉固著於底土中，有些種類開花時會將花序伸出水面。

（四）沉水植物（ Submerged Plants）

沉水植物其根或根狀莖生長於水體底泥中，而莖葉全部沉沒於水中，僅在開花時露出水面，但當中有些種類的沉水型植物則發展出在水中授粉的水中花。此外沉水植物的莖與葉多呈線形或絲狀，細長且柔軟，如此則能隨著水流擺動，來減少水流的衝擊，同時還能隨著水位的高低而伸展或彎曲，使植物整株能夠保持在水面下成長，而細小的葉片能增加植物體與水流接觸的表面積，並以此提高接收水中氣體的效率，再者，其錯開生長的葉片，使葉子能隨著水流擺動的同時，接受到來自不同角度的陽光。而代表植物如狐尾藻、金魚藻、苦草等。

當中以植物生長情況可再細分為叢生狀、蔓生狀與葉狀體三類。叢生狀水生植物有些種類具有地下根莖或走莖，但無水中莖或莖甚短，莖節密集，葉片叢狀排列；蔓生狀水生植物通常不具有地下根莖，以細長蔓生的水中莖為主；葉狀體水生植物植物體退化成扁平或枝狀的葉狀體。

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13

二、水生植物與水生態系統的關係

水生植物作為水生態系統的重要組成部分，其在整個水生態系統的建構、平衡、維持、恢復等過程中發揮著不可替代的作用。水生植物是水生態系統主要的初級生產者，可以透過光合作用，向周圍環境來釋放氧氣，來發揮多種生態功能。在空間生態位（ Ecological niche）

部分，水生植物及其群落所構成的生態，能為水體生物提供餌食、棲息與繁殖場所，來有效增加空間生態位，穩定水體生物多樣性

（ Lauridsen et al., 1996）。同時，水生植物可以直接吸收底泥中的營養物質，短期儲存 N、 P、 K 等營養物質，改變根際底泥的生物化學性質（種等人 , 2003），降低水流速率等動力擾動，促進懸浮顆粒物沉降和減少沉積物再懸浮（ Scheffer et al., 1993），抑制底質營養、重金屬和有機汙染物質的釋放（ Kassim et al., 1997），從而穩定水體底質環境。而水生植物還可以透過過濾沉澱、吸收富集等方式來提高水體透明度，並利用吸收營養鹽、富集重金屬、轉化和降解有機物等方式，來達成淨水清水的功能（吳 , 2011）。

而在水生態系統中，由於水生植物與浮游藻類的空間生態位有高度重疊，同時在光照與礦物質營養鹽有相同需求下，而使二者之間存在著複雜的相互競爭關係（楊 , 1996）。這項競爭關係觀察源於早期自然環境中植物與藻類之間數量消長現象，同時亦被指出此項關係屬於化感作用（ allelopathy）的一種（ Jelenic, 1987）。這種相互關係對水生態系統中水生生物群落的組成和分布具有非常重要的作用，而水生態系統的水生植物生活環境與陸生植物相比，水生植物在水介質中傳播相剋物質（ allelochemical ）的方式更為複雜。因此，由於水生態環境的特殊性與複雜性，使水生植物化感作用研究面臨挑戰，而隨著近年來對化感作用方式、途徑和機制，相剋物質的分離提取和鑑定等研究發展深入，促使化感作用成為目前生態學與環境科學研究的熱點之一。

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第四節水生植物化感作用與相剋物質的研究與應用

一、水生植物化感作用的定義與分類

化感作用，又可以稱為異種化感、他感作用或異種剋生，最早由 Molish 於 1937 年所提出，其英文 allelopathy 源自於希臘語 allelon

（相互）和 pathos（損害、妨害）用來描述生物之間生物化學物質的相互作用現象。隨後，Rice（ 1984）進一步將這種作用現象定義為「一種植物透過向環境中釋放化學物質，來影響其他生物生長的現象」，

在此處即闡明化感作用的本質意義在於影響自身以外生物的生長作用。而在化感作用所釋放的化學物質，由 Whittaker 與 Feeny（ 1971）

將植物產生並釋放到環境中表現的次級代謝產物（ Secondary

met abol ites ）稱為 al lelochemi c ，隨後統稱為 all el ochemical ，即為相剋物質。

Rice（ 1984 ）依據相剋物質的化學結構，將其分類為水溶性有機酸；簡單不飽和內酯；長鏈脂肪酸和多炔；苯醌、蒽醌和複醌；簡單酚、苯甲酸及其衍生物；肉桂酸及其衍生物；香豆素類；類黃酮；單寧；萜類和甾類化合物；氨基酸和多肽；生物鹼和氰醇；硫化物和芥子油苷；嘌呤和核苷等 14 個類別。以此作為發展，相剋物質已被進步探討其生物合成途徑（ Wang et al., 2007），其途徑如下方圖三所示。而當中不同類別的相剋物質在植物體內都具有其獨特的代謝途徑，並在植物提高自身保護和生存競爭力、協調與環境關係中具有重要的角色意義。

圖三、植物相剋物質主要生物合成途徑（ Wang et al., 200 7）

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在這當中，隨著相剋物質的分析進展與探討，其作用特性與模式正逐漸被研究並投入環境進行評估。在作用選擇性部分，相剋物質已被認為僅對幾種或某一類植物或微生物有抑制作用（和等人 , 2001），

對於同種類（ Nakai et al., 2000）或不同類別（ Gao et al., 2015）的相剋物質，多種混合作用下會產生聯合抑制作用，進而降低單個物質所需劑量，同時達到同等或更好的抑制效果。再者，視水生植物種類、數量、混合比例及受試生物的不同，相剋物質之間會表現出不同的聯合抑制作用。

二、相剋物質的研究與應用

目前發現的水生植物抑藻相剋物質的種類相對較少，當中又以酚類、萜類以及長鏈脂肪酸等相剋物質較為常見。而目前相關已研究之相剋物質如下所述：

（一）酚類

酚類物質是一種分子結構中至少含有一個羥基（ — OH）直接鍵結在苯環上的芳香族化合物，同時此類物質亦是生態系統中最重要也最為常見的一類植物相剋物質（孔等人 , 2001），而根據結構上的差異，酚類物質可分為簡單苯酚類、羥基苯甲酸和肉桂酸衍生物、香豆素類、黃酮類、醌類和單寧六種（ Zeng et al., 2008）。由於酚類相剋物質的分子結構中至少含有一個苯羥基，這在生物體中容易與糖配體結合形成糖苷分子，另一方面，苯羥基與鹼或金屬離子容易形成鹽，這將會增加其相剋物質的水溶性，進而容易在自然環境中被雨淋融或土壤吸收（ Inderjit et al., 1999）。

（二）萜類

萜類物質是一種具有 (C5H8)n 通式的碳氫化合物及其含氧衍生物 (包括醇、醛、酮、羥酸、酯等 )，此類物質廣泛存在於高等植物中，並透過合成或聚合來生成各種類型的萜類化合物。當中，單萜或倍半萜為揮發油的主要成分，同時也為高等植物中主要的生物抑制劑。

（三）脂肪酸和酯類

脂肪酸物質是一種一端含有羥基的長脂肪族碳氫鏈，通常會

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以酯的形式存在於各種脂質組成分中，而以游離形式存在的脂肪酸在自然界中是很罕見的。而根據碳氫鏈飽和度，可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸。

第五節挺水植物假馬齒莧的研究進展與應用

一、假馬齒莧的生態分布與應用

假馬齒莧（ Bacopa monnieri (L.) Wettst），又名過長沙、百克爬草、白豬母乳、過塘蛇或蛇麟菜，屬於多年生玄參科（ Scrophulariaceae ）匍匐草本植物，亦屬於水生植物中挺水植物的一種，而其外觀特徵如圖四所示。全株光滑無毛，植株匍匐地面，節上生根，葉對生，略呈肉質，無葉柄，葉片呈倒卵形或匙狀形，長 1.5~1.8 cm，寬 0.7~0.8 cm，

鋸齒緣，先端圓或鈍形。花腋生且具長梗，長 2.0~3.0 cm；卵形萼片五枚，長 0.8 cm，寬 0.3~0.4 cm；萼片內側具二枚披針形苞片，0.2~0.5 cm 。花瓣白色帶淡藍紫色，花冠五裂，直徑約 1.0 cm ，雄蕊四枚，插於花冠筒上，花柱單一。蒴果披針形，居於宿存萼內，種子橢圓錐形，黃褐色，具縱稜紋（邱、張 , 1995；李 , 2005）。關於假馬齒莧植株外觀，如下方圖四所示。

圖四、假馬齒莧的外觀

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17

在生態分布上，假馬齒莧常分布於熱帶和亞熱帶地區，其自然分佈地區廣泛，多見散生或群生，並主要生長於水邊、濕地及沙灘上；而其植株環境適應能力極高，能部分或完全地浸入淡水中，甚至可以在汽水域環境中生長（ Ribeiro et al., 2015）。此外，假馬齒莧對於營養需求較低（ Fang et al., 2007），並能以其匍匐莖於溼地中快速生長與營養繁殖，同時也具有水流傳播特性與不需要特別傳粉與傳播機制等生物地理學及生物學特徵存在（何、張 , 2007）。

此外，已知假馬齒莧在實驗室與野外實地條件下（ Vajpayee et al., 1995），皆具有積聚重金屬的能力，在這當中，假馬齒莧可以積聚水中所含的銅（ Sinha & Chandra, 1990）、汞（ Sinha et al., 1996）、鉛

（ Kumar, 2012）、砷（ Mishra et al., 2013）與鎘（ Dogan et al., 2015）

等重金屬。而這些重金屬無法以自然或生物方式降解，同時將對於水體環境中的生物生存造成危害（黃等人 , 2006）。

二、假馬齒莧的化學成分與臨床應用

假馬齒莧於傳統應用上，多用於中國傳統醫藥與印度阿育吠陀醫藥體系（ Ayurvedic system of medicine ）中。在中醫理論中，認為假馬齒莧具有清熱解毒、消炎退腫之功效，並可用於治療赤目痢疾、目赤腫痛、丹毒、痔瘡中痛、皮膚紅腫等炎性症狀；而在印度醫藥理論中，則認為其具有安神、增進記憶力和智力，促進學習獲得，並有抗氧化的作用（巫 , 2007）。而在此傳統基礎上，伴隨分離技術的進步，已陸續有學者以有機溶劑萃取的方式，將假馬齒莧的化學成分單一分離純化，並鑑定其化學結構。至目前為止，從假馬齒莧中分離得到約 20 多個化合物，當中以三萜皂苷（ Tri t erpenoi d s aponin s）類與苯乙醇苷（ Phenylethanoid glycosides ）類化合物為其主要成分，其中，三萜皂苷類化合物可依據其結構上的差異，可以再細分為含酸棗仁苷元

（ Jujubogenin saponins）化合物與含偽酸棗仁苷元（ Pesudojujubogenin saponins）化合物兩種。同時，除了上述之化合物外，假馬齒莧還可以分離出黃酮類（ Flavonids）化合物與其他單獨類群之有機化合物。

以上述化學成分鑑定與純化的基礎，已有許多學者以其來研究假馬齒莧的臨床藥理作用。在對神經系統的作用上，具有增強記憶學習

（ Roodenrys et al., 2002）、抗焦慮（ Shanker & Singh, 2000）、抗抑鬱活性（ Sairam et al., 2002）、抗壓力（ Rai et al., 2003）、抗應激

（ Chowdhuri et al., 2002）、止痛（史 , 1998）、減輕嗎啡戒斷症狀

（ Sumathi et al., 2002）與治療或預防神經變性疾病（ Russo et al., 2003）；在對消化系統的作用上，具有抗潰瘍（ Sai ram et al., 2001）

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與平滑肌解痙（ Dar et al., 1999）；在對血液循環系統的作用上，具有抑制支氣管收縮（ Dar et al., 1997）與心搏過緩（ Channa et al., 2003）。

而除了上述的臨床應用以外，對於肝臟保護（ Sumathy et al., 2001）

與抗腫瘤（高等人 , 1996）也具有功效作用存在。

第六節微囊藻的生理特性與其影響探討

微囊藻為藍菌的一種，細胞通常成球形、類橢圓型，細胞內含有氣囊（李 , 2005），因此能漂浮在水面，並藉此得以在水體中進行垂直升降（ Robarts and Zohary, 1987 ），以在爭取陽光上獲得細胞族群競爭優勢。微囊藻細胞壁由聚醣類（ polysaccharides ）所組成，細胞外圍有一層薄黏液（ mucilage）或透明膠質外鞘，在自然情況下，細胞藉由不定形的黏液狀保護鞘聚集在一起，當水域發生藻華時，常常會發現在下風處水面發現微囊藻團聚成厚厚一層浮渣（ scum）或藻泥層，

特別在夏日優養化發生的水域裡，微囊藻容易大量繁殖並發生藻華，聚集而產生臭味，而細胞所含毒性物質的釋出，會引起魚群暴斃或家畜的死亡，在水質上也增加了飲用水處理上的困難度以及含毒自來水的安全顧慮。

同時，根據 Reynolds 等人（ 1987）指出，微囊藻之所以能於大多水體中取得藻種優勢之主要原因，是由於浮力調控機制所致，因此相對於其他物種，也更容易形成藻華並遍佈整個水體（蘇 , 2006）。綜上所述，微囊藻是藻華現象形成原因與產生微囊藻毒素中最重要的屬別（ Azevedo et al., 2002；Robarts and Zohary, 1987）。而如圖五所示，抑制微囊藻的生長是控制藍菌藻華的關鍵所在，其中圖五內的小圖為其放大顯示，使其變化趨勢更為明顯（ Chen et al., 2004 ； Pan et al., 2006）。

而水庫藻類的大量繁殖，經常導致供水問題，其中甚至還有些藻類會產生或分泌出毒素，而形成藻華現象的藻體中估計有

25%~75% 是含有毒素的（ Lawt on et al., 1991； Chorus , 2001 ），這對於生物及人類身體健康都將造成不小的傷害。而在這些的毒素當中，又以微囊藻（ Microcystis）所分泌的微囊藻毒素（ Microcystins）最為普遍 (黃等人 , 2010)，但除了微囊藻會產生外，部份種類的魚腥藻、念珠藻、水華束絲藻也會產生此種毒素（ Carmichael et al., 19 88）。

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19

微囊藻毒素為七個胺基酸組成一個小型環狀羧氨酸，屬於環多胜肽（ C yclic olypeptides）的一種，其主要化學結構式為 cyclo-

（ -D-Ala-X-D-MeAsp-Y-Adda-D-Glu-Mdha-），而根據其上主要位置 X 與 Y 或其他次要位置的鍵結胺基酸或官能基不同，其種類可以區分出超過 80 種不同的形式。而根據先前文獻中指出，微囊藻毒素主要是一種肝毒素（ Hepatotoxins），並會造成嚴重的肝出血與肝衰竭（ Kaya, 1996；Svrcek et al.,2004；Toi vol a et al., 1999 ），而其關係如表六所示。

圖五、去除藻華現象後，圈地內葉綠素 a 濃度的變化 (Pan et al., 2006)

表六、藍細菌(Cyanobacteria)與其可能產生之毒素(Svrcek & Smith, 2004)

藻毒種類毒性或潛在風險產毒藻種

Microcystins Hepatotoxic

Anabaena, Anabaenopsis, Aphanocapsa, Hapalosiphon, Microcystis,

Nostoc, Oscillatoria

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20

第三章、實驗材料與方法

第一節實驗材料

一、

儀器設備

下述為本研究中所使用到之儀器設備：

1. 電子分析天平 (High precision electronic balance) AY220, Shimadzu S ci enti fi c Inst rum ents C o., Tai pei , Tai wan

2. 滅菌釜 (Autoclave) Model SS-320, Tomy Co., Tokyo, Japan 3. 無菌操作台 Kansin Co., Taipei, Taiwan

4. 恆溫水浴槽 (Water bath) B206-T1, Firstek Scientific Co., Tai pei , Taiwan

5. 超音波震盪洗淨機 (Ultrasonic steri -cleaner) D-78224, Elmasoni c Co.,Germ an y

6. 水平振盪器 LS-3, Lian Shen Enterprise Co., Taichung, Taiwan 7. 倒直式顯微鏡 BI-500, Motican Co., USA

8. 盤式全光譜分析儀 Multiskan Go, Thermo Scientific Co., Germ an y

9. 超純水製造機 (Ultrapure water system) RO -1070, PA-E Machiner y Indus tri al Co., Tai chung, Tai wan

10. 氣相層析儀 (Gas Chromat ograph y, GC ) 7890A, Agil ent Technologi es Co., USA

11. 氣相層析自動取樣器 (GC -Autosm pler) 7683B, Agilent Technologi es Co., USA

12. 氣相層析管柱 (GC -C loumn) HP5, Agil ent Technologi es Co., USA

13. 氣相層析火焰離子化偵測器 (GC - flame ioniz ation det ector, GC-F ID) Agil ent Technologi es C o., US A

14. 原子吸收光譜儀 (At omic Abs orption Spectrom et er ) AA100, Perkin -Elm er Co., USA

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21

二、

藥品藥劑

下述為本研究中所使用到之藥品藥劑： 1. Trace m et al mix A5

H₃BO₃ 2.86 g

MnCl₂·4H₂O 1.81 g ZnSO₄·7H₂O 0.222 g NaMoO₄·2H₂O 0.39 g CuSO₄·5H₂O 0.079 g Co(NO₃)₂·6H₂O 49.4 mg Distilled water 1.0 L

2. BG-11 M edium

NaNO3 1.5 g

K2HPO4 0.04 g

MgSO4·7H2O 0.075 g CaCl2·2H2O 0.036 g

Citric acid 0.006 g

Ferric ammonium citrate 0.006 g EDTA (disodium salt) 0.001 g

Na2CO3 0.02 g

Trace metal mix A5 1.0 ml Agar (if needed) 10.0 g Distilled water 1.0 L

(32)

22

三、

實驗菌株來源與培養條件

微囊藻菌株（ Microcystis sp.），由國立臺東大學生命科學系藍菌 暨生物再生能源實驗室中所保存的菌種中取得，而該菌種由李佳蓮自環境中所分離出來（李等人 , 2009）。根據先前的研究（胡等人 , 2004）

中指出，微囊藻對 BG-11 medium 有良好的適應性，並能快速生且達到較高生物量，因此以前述之 BG-11 medium 藥品配方，作為微囊藻生長所需之營養培養基，並將其菌株純化後，再進行放大培養與保存。

微囊藻菌株在實驗進行前，將全程以室溫（ 22~25℃ ）、 24 小時全日光照（ 3330 Lux），放置於水平振盪器上進行震盪培養。而在後續實驗進行前，將依據所建立的吸光值與細胞濃度檢量線，來換算所需之細胞濃度。

四、

實驗植物來源與培養條件

假馬齒莧（ Bacopa monnieri (L.) Wettst ），於臺灣臺東縣臺東市之 台東森林公園內的琵琶湖（22°45’48’’N 121°09’30’’E）中以人工徒手方式採集取得。採集範圍選定離湖岸約 0.5 m 內的完整假馬齒莧植株，

並將採集的植株放置於含湖水的透明塑膠採集桶內，後送回國立臺東大學生命科學系藍菌暨生物再生能源實驗室進行植株清洗處理。植株處理全程將以蒸餾水小心清洗，並在不損傷植株的情況下，去除一些附著的著生植物與泥沙顆粒，清洗完成後，將假馬齒莧植株放置於蒸餾水內進行馴化培養。

馬齒莧植株的馴化培養，將全程以室溫（ 22~25℃ ）、24 小時全日光照（ 3330 Lux），放置於 20×30×20 cm 的透明玻璃水族箱內馴化培養。而在後續實驗進行前，將植物取出後以乾布吸附殘留水份，並秤其植物濕重（ fresh weight , FW）。

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23

第二節研究實驗架構

本研究實驗架構如圖六所示，主旨在於探討假馬齒莧的相剋物質是以何種作用方式來抑制微囊藻的生長。在「假馬齒莧抑制微囊藻的生長試驗」中，將分別以共培養與種植水兩種系統模式，探討假馬齒莧對微囊藻的生長是否具有抑制作用；接續在「相剋作用物質分析」中，將以氣相層析（ Gas Chromatography）對假馬齒莧釋放於水中的相剋物質，進行純化分離分析；最後進行「相剋物質抑制微囊藻生長的成因」探討，將分別進行光合作用影響與細胞結構破壞兩種實驗，來討論影響微囊藻生長的成因與其作用機制。

圖六、研究實驗架構圖

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第三節假馬齒莧抑制微囊藻的生長試驗

一、微囊藻菌株的細胞濃度測定與建立

在進行假馬齒莧抑制微囊藻的生長抑制實驗前，為使各實驗組別的初始細胞濃度相同，須對微囊藻菌株進行細胞濃度的測定與建立。在先前的研究（彭等人 , 2000）中指出，藍菌的細胞濃度與吸光值有良好的線性關係，因此可取所測得之吸光值來繪製標準檢量線，再由檢量線以內差法方式求得各實驗組別的初始細胞濃度。

參照先前學者靳萍等人（ 2013）的實驗方法，將微囊藻菌液放入 96-well 微量培養盤中，以盤式全光譜分析儀在 400~800 nm 的範圍內進行全波長掃描，頻寬設定為 10 nm，測定其最高吸收峰的波長吸光值（ OD）。接續，取 1 mL 的微囊藻菌液，分別稀釋成 0.2、0.4、0.6、

0.8、 1.0 五個濃度（ 10⁶ cells^•m L^{- 1}），並備製蒸餾水作為空白組，當中各項濃度與空白組以前述所測定之最大吸收峰的波長吸光值來進行三重複測定，取平均值得到各濃度吸光值 Ai與空白組吸光值 A0。同時，使用顯微鏡與血球計數器（ counting chamber）對各濃度進行細胞計數，三重複計數後取平均值得到細胞濃度 Ci。

利用上述測定之吸光值（ Ai-A0）與細胞濃度 Ci 數值，來建立吸光值與細胞濃度的檢量線。在後續實驗項目中，即可將所測得之吸光值代入檢量線中，來換算其細胞濃度。

二、假馬齒莧種植水組對微囊藻的生長試驗

在實驗進行前，依據微囊藻生長曲線，於微囊藻初始細胞密度為 1× 10⁶ cell s^•m L^{- 1} 時進行實驗。

取 100g 濕重（ 100g FW·L^{- 1}）假馬齒莧，使用 20× 30× 20 cm 的透明玻璃水族箱，加入 10 cm 高的蒸餾水量，並以室溫 (22~25℃ )、全光照方式預先培養 5 天後，取出植物來獲得假馬齒莧種植水。將種植水以蒸餾水稀釋成 25 %、 50 %、 100 %的比例作為實驗處理組；以蒸餾水做為控制組，與微囊藻進行生長抑制試驗，並做三重複試驗。試驗進行中，全程以室溫 (22~25℃ )、全光照方式培養 8 天，並每隔 24 個小時，以盤式全光譜分析儀來計算微囊藻數量。而於每日生長抑制率計算上，將以下述公式進行計算。

生長抑制率 (%) = (1-Nn/ N) 100%

公式中 Nn指實驗處理組微囊藻數量， N 指控制組微囊藻數量

(35)

25

三、假馬齒莧共培養組對微囊藻的生長試驗

實驗進行前，依據微囊藻生長曲線，於微囊藻初始細胞密度為 1× 10⁶ cell s^•m L^{- 1} 時進行實驗。

分別取 25g、 50g、 100g 濕重（ 25、 50、 100g FW·L^{- 1}）假馬齒莧與蒸餾水作為實驗處理組；以塑膠植物與蒸餾水做為控制組，與微囊藻進行生長抑制試驗，並做三重複試驗。試驗進行中，使用 20× 30× 20 cm 的透明玻璃水族箱，加入 10 cm 高的蒸餾水量，全程以室溫 (22~25

℃ )、全光照方式培養 8 天，並每隔 24 個小時，以盤式全光譜分析儀來計算微囊藻數量。而於每日生長抑制率計算上，將以下述公式進行計算。

生長抑制率 (%) = (1- Nn /N) 100%

公式中 Nn指實驗處理組微囊藻數量， N 指控制組微囊藻數量

第四節假馬齒莧釋放的相剋作用物質類別分析

在進行假馬齒莧釋放的相剋作用物質類別分析前，須備製相剋物質分析所需使用的樣本。在樣本備製上，須取 100 g 溼重（ 100g FW·L^{- 1}）假馬齒莧，使用 20× 30× 20 cm 的透明玻璃水族箱，加入 10 cm 高的蒸餾水量，並以室溫 (22~25℃ )、全光照方式預先培養 5 天後，取出植物來做為假馬齒莧種植樣水。植物樣水須以 0.2 µ m 濾膜進行過濾，再取出 1 µ L 過濾樣品注入柱層中，以氣相層析儀於下述操作條件

（ Nakai et al., 2005）中來進行相剋物質類別的分析。

Cloumn HP5 30.0 m×320 µm×0.25 µm Carrier gas N₂(99.9999%) 1.3 mL^•min^{- 1}

Oven temperature 50℃ (1 min)； 10℃•min^{- 1}to 280℃

20℃•min^{- 1}to 310℃

Injection mode Splitless Injection volume 1 µ L Injection temperature 250℃

Detector GC- flame ionization detector

相剋物質分析完成時，將其分離結果以圖譜方式呈現。

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻 的生長影響與作用方式

國立臺東大學 生命科學系 碩士論文

指導教授：許 振 宏 博士 李 炎 博士

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻 的生長影響與作用方式

The allelochemical of Bacopa monnieri (L.) Wettst on Microcystis sp. Growth and its Physiological Mechanism

研 究 生：謝宗樺 撰

中 華 民 國 一 零 五 年 七 月

國立臺東大學 生命科學系 碩士論文

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻 的生長影響與作用方式

The allelochemical of Bacopa monnieri (L.) Wettst on Microcystis sp. Growth and its Physiological Mechanism

研 究 生： 謝宗樺 撰 指導教授： 許振宏 博士

李 炎 博士

中 華 民 國 一 零 五 年 七 月

致謝

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻 的生長影響與作用方式

作者：謝宗樺

摘 要

度與 K

滲出量，來研究假馬齒莧對微囊藻的化感抑制機制。

結果顯示，共培養組在 100 克濕重/升 時對微囊藻的抑制率可以 達到 97.7%，而種植水組在 100%濃度下其抑制率則達到 86.1%。透 過氣相層析儀分離出三個未知的脂肪酸類相剋物質。而在培養過程中，

微囊藻的葉綠素 a 受到了損傷。然而在 K

滲出量實驗中，控制組與

處理組間並沒有顯著差異。這些結果顯示出假馬齒莧能抑制微囊藻的 生長，而其相剋物質的主要作用機制在於葉綠素 a 的破壞。

The allelochemical of Bacopa monnieri (L.) Wettst on Microcystis sp. Growth and its Physiological Mechanism

Tsung-Hua Hsieh

Abstract

nhibitory effects of Bacopa monnieri (L.) Wettst on Microcystis sp. were studied under co-cultivation and culture waters conditions. The allelopathic fatty acid was isolated by gas chromatography. Finally, the chlorophyll-a and efflux of K

were determined to study the inhibition of Microcystis sp. by B. monnieri.

Results of co-cultivation group showed that the inhibitory rate of Microcystis sp. could reach 97.7% at 100 g FW·L

, while the inhibitory rate of the culture waters group could reach 86.1% at 100% concentration.

Three unknown allelopathic fatty acid was isolated by gas chromatography. The chlorophyll-a of Microcystis sp. was damaged during the cultivation. However, in experiment of efflux of K

, there was no significant difference between the control and the treatment. These results showed that B. monnieri. could inhibit the growth of Microcystis sp.and its main mechanism of allelochemical could cause destruction of the chlorophyll-a.

Keywords：Bacopa monnieri (L.) Wettst, Microcystis, allelopathy

目錄

表目錄

圖目錄

第一章、緒論

第 一 節 前 言

第 二 節 研 究 動 機

第 三 節 研 究 目 的

第二章、文獻回顧

第 一 節 水 質 優 養 化 的 形 成 與 其 程 度 分 類

一 、 營 養 物 質 來 源

二 、 優 養 化 程 度 分 類

第 二 節 優 養 化 與 藻 華 形 成 的 關 係 與 控 制

第 三 節 水 生 植 物 的 定 義 與 發 展 概 況

一 、 水 生 植 物 的 定 義 與 分 類

二 、 水 生 植 物 與 水 生 態 系 統 的 關 係

第 四 節 水 生 植 物 化 感 作 用 與 相 剋 物 質 的 研 究 與 應 用

一 、 水 生 植 物 化 感 作 用 的 定 義 與 分 類

二 、 相 剋 物 質 的 研 究 與 應 用

第 五 節 挺 水 植 物 假 馬 齒 莧 的 研 究 進 展 與 應 用

一 、 假 馬 齒 莧 的 生 態 分 布 與 應 用

二 、 假 馬 齒 莧 的 化 學 成 分 與 臨 床 應 用

第 六 節 微 囊 藻 的 生 理 特 性 與 其 影 響 探 討

第三章、實驗材料與方法

第 一 節 實 驗 材 料

一 、

二 、

三 、

四 、

第 二 節 研 究 實 驗 架 構

第 三 節 假 馬 齒 莧 抑 制 微 囊 藻 的 生 長 試 驗

一 、 微 囊 藻 菌 株 的 細 胞 濃 度 測 定 與 建 立

二 、 假 馬 齒 莧 種 植 水 組 對 微 囊 藻 的 生 長 試 驗

三 、 假 馬 齒 莧 共 培 養 組 對 微 囊 藻 的 生 長 試 驗

第 四 節 假 馬 齒 莧 釋 放 的 相 剋 作 用 物 質 類 別 分 析

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻的生長影響與作用方式

國立臺東大學生命科學系碩士論文

指導教授：許振宏博士李炎博士

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻的生長影響與作用方式

研究生：謝宗樺撰

中華民國一零五年七月

國立臺東大學生命科學系碩士論文

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻的生長影響與作用方式

研究生：謝宗樺撰指導教授：許振宏博士

李炎博士

中華民國一零五年七月

假馬齒莧的相剋物質對微囊藻的生長影響與作用方式

摘要

結果顯示，共培養組在 100 克濕重/升時對微囊藻的抑制率可以達到 97.7%，而種植水組在 100%濃度下其抑制率則達到 86.1%。透過氣相層析儀分離出三個未知的脂肪酸類相剋物質。而在培養過程中，

處理組間並沒有顯著差異。這些結果顯示出假馬齒莧能抑制微囊藻的生長，而其相剋物質的主要作用機制在於葉綠素 a 的破壞。

第一節前言

第二節研究動機

第三節研究目的

第一節水質優養化的形成與其程度分類

一、營養物質來源

二、優養化程度分類

第二節優養化與藻華形成的關係與控制

第三節水生植物的定義與發展概況

一、水生植物的定義與分類

二、水生植物與水生態系統的關係

第四節水生植物化感作用與相剋物質的研究與應用

一、水生植物化感作用的定義與分類

二、相剋物質的研究與應用

第五節挺水植物假馬齒莧的研究進展與應用

一、假馬齒莧的生態分布與應用

二、假馬齒莧的化學成分與臨床應用

第六節微囊藻的生理特性與其影響探討

第一節實驗材料

一、

二、

三、

四、

第二節研究實驗架構

第三節假馬齒莧抑制微囊藻的生長試驗

一、微囊藻菌株的細胞濃度測定與建立

二、假馬齒莧種植水組對微囊藻的生長試驗

三、假馬齒莧共培養組對微囊藻的生長試驗

第四節假馬齒莧釋放的相剋作用物質類別分析