東亞地區水韭屬植物親緣關係研究

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(1)壹、前言一、水韭屬植物概述 George （ 1955 ）將水韭分類於蕨類植物門（ Pteridophyta ），石松綱（Lycopsida），水韭目（Isoetales）水韭科（Isoetaceae）水韭屬（Isoetes）。這一屬的植物在世界上的分佈範圍很廣，廣佈於全球，是泛世界性分佈的植物（Hickey, 1986；Taylor and Hickey, 1992）。水韭屬的植物起源於古生代，有非常長的時間和機會使其快速地適應於各種環境，從常綠水生的冰湖、突出的岩塊上、間歇性的水流中、田間，甚至路邊溝渠裡皆有（Hoot and Taylor, 2001），雖然棲地種類很多樣化，但水韭屬的植物卻缺乏形態上的變異（Taylor and Hickey, 1992）。因此利用形態去界定種以及種間的關係時，有許多問題，主要的原因在於水韭屬的形態構造簡單、外形上的趨同（convergence）以及含有許多異源多倍體種化（allopolyploid speciation）的事件（Hickey, 1986；Taylor and Hickey, 1992）。許多研究者對於水韭屬內種的數量有不同的看法，現存估計約有 150 種左右（Taylor and Hickey, 1992），甚至有人估計達到 400 種之多（Strivastava et al., 1993）。目前由染色體數目的證據和細胞學上的資料，用於研究水韭屬植物種化問題上，的確可提供某些訊息（Taylor & Hickey, 1992）。應用染色體數目的觀察，可以很清楚的區別二倍體和其他多倍體的種類，解決在界定種的困擾。由染色體的數目可知，水韭屬的演化是以兩種方式進行，基本的二倍體種類因地理上的分隔與遺傳變異的累積而種化；多倍體的種類則透過種間雜交和染色體數目加倍的事件而種化（Hoot and Taylor, 2001）。異源多倍體（allopolyploid）在許多植物是一個相當普遍的種化機制，兩個物種發生雜交再加上染色體加倍的事件，會產生一個異源多倍體的新種。據估計被子植物多倍體的頻率是 30-80%，在非開花植物中，多倍體的頻率甚至更高（Masterson, 1994；Soltis and Soltis, 2000）。在水韭屬的植物裡，有相當高數目 1.

(2) 的雜交種和多倍體，也有很多關於多倍體起源和親本探討的研究，而親本可由中間形的形態特徵、地理分佈、雜交試驗等來推知（Hoot et al., 2004）。不過，要決定一個植物是否為雜交種或是雜交起源並不是那麼容易，從形態上呈兩親本的中間型來判斷或許有時候有用，但也可能造成誤導（Rieseberg and Ellstrand, 1993）。由形態和細胞學上的證據提出可能的雜交起源假說時，需要額外的資料去檢測此假說的正確性（Soltis et al., 1992）。為了要解決這樣的問題，一些分子生物學的工具被發展出來，驗證雜交種、檢測雜交關係的網狀演化假說以及決定親本。傳統上系統分類學家會使用 AFLP （ Amplified fragment-length polymorphism）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）或同功異構酵素（Isozyme）等去決定雜交關係，而低重複數（copies）的核 DNA 序列資料也越來越普遍被使用在這樣的工作中（Sang et al., 1995；Campbell et al., 1997；Ge et al., 1999；Small and Wendel, 2000；Ingram and Doyle, 2003）。 Hoot et al.（2004）曾使用核 LEAFY 的第二個 intron 片段（以下簡稱 LEAFY）來研究美洲地區水韭屬植物在界定種和決定雜交起源的問題。在被子植物中， LEAFY 通常是單一重複序列（copy），但在水韭屬的植物裡卻有兩個重複序列，這兩個重複序列，其中一個較長為 1150 bp，另一個較短為 1050 bp。研究中發現在水韭屬的植物裡，LEAFY 長度為 1150bp 的重複序列，其第二個 intron 有相當多數目的變異位點，而周圍的 exon 則非常保守，有助於引子（primer）的設計，在此一片段累積足夠多的簡約訊息位點（informative site），很適合用在雜交種與雜交起源的研究中。 Oh et al.（2003）在研究 Neillia 和 Stephanandra 這兩個屬物種間親緣關係時，曾比較核 LEAFY 的第二個 intron、葉綠體 trnL-trnF、trnD-trnY-trnE-trnT、matK-trnK 以及核 ribosomal ITS（internal transcribed spacer）片段，在這兩個屬種間序列的差異時，也發現以 LEAFY 的第二個 intron 變異位點最多（7.4/100 bp），相較於 ribosomal ITS（3.2/100 bp）、cp DNA（0.7/100 bp）。因此，在建築親緣關係樹以 2.

(3) 進行種階層的分析時，LEAFY 的第二個 intron 是非常有用的片段，很適合用在本研究中。. 二、東亞地區水韭屬植物之分類研究回顧 Takamiya et al.曾在 1994 年針對日本境內的幾種水韭（包括 I. asiatica、I. japonica 和 I. sinensis）進行形態及染色體數目上的比較，結果 I. asiatica 的染色體數目為 2n=22；I. japonica 的染色體數目有 2n=66、77 及 88 三種；I. sinensis 的染色體數目有 2n=44 及 66 兩種。將 I. asiatica 與 I. japonica 和 I. sinensis 比較後，發現它們在形態上有許多差異，所以推測 I. asiatica 應該不是 I. japonica 和 I. sinensis 的祖先，而 I. japonica 和 I. sinensis 沒有共域，不可能雜交，所以也不會有異源多倍體種化的演化。 1996 年 Takamiya et al.再比較這幾種不同染色體數的水韭，產生孢子的可孕性、外型差異及存活率，發現 2n =77 的 I. japonica 產生之孢子為不規則型，且是不孕的，故推測其為 2n=66 和 2n=88 的雜交種。在大小孢子外型的比較上，I. japonica 2n=66 和 2n=88 的孢子外型完全相同；I. sinensis 2n=44 和 2n=66 的孢子外型也相同，但可由小孢子的大小來分辨，此外這幾種水韭小孢子的大小與其染色體的倍數成正相關（Takamiya et al., 1996）。 1997 年 Takamiya et al.比較這幾種水韭在形態及比較解剖學方面的差異，結果顯示除 I. asiatica 是球莖二瓣外，其他水韭之球莖均為三瓣，且 I. asiatica 的球莖寬度小，葉片也較短，分布在葉片尖端的氣孔很少，其他的五個類群（I. japonica 的 66、77、88 和 I. sinensis 的 44、66）在葉片 1/3 處上方均有許多氣孔分布。在保衛細胞長度方面，I. sinensis （2n=44）的保衛細胞長 65.2µm，I. sinensis （2n=66）為 92.7µm。I. japonica 2n=66、77、88 的植株保衛細胞大小則沒有顯著差異。在葉片的橫切觀察方面，只有 I. asiatica 缺乏周邊纖維束（peripheral fibers），其他物種均有，分佈在葉片的四個地方。比較中柱孔道的數目方面，發現 I. sinensis 3.

(4) 2n=44、66 的植株有三個 intrastelar canal，I. asiatica 和 I. japonica 均只有一個。綜合以上結果，Takamiya et al.正式將原本認為是三個種的水韭分類為：I. asiatica （2n=22）、I. japonica（2n=66）、I.× michinokuana（2n=77）（不孕，是 I. japonica 和 I. pseudojaponica 的雜交種）、I. pseudojaponica（2n=88）、I. sinensis var. sinensis （2n=44）和 I. sinensis var. coreana（2n=66）。在中國大陸及台灣地區，學者們原本認為只有四種水韭：I. hypsophila （2n=22）、I. taiwanensis（2n=22），I. sinensis（2n=44）與 I. japonica（2n=66）（劉等, 2002）。其中在雲貴高原（1200-1900m）發現的族群亦被認為是 I. japonica；然而，2002 年劉等又將雲貴高原採得的水韭和其他水韭互相比較，其孢子形態與染色體數目和先前已被發表過的水韭均不相同，應為新的種類，故將之命名為 I. yunguiensis。目前台灣地區已被命名的水韭只有一種，即為 I. taiwanensis。民國 90 年於金門發現水韭族群，根據黃於 2002 年進行同功異構酵素分析的結果，顯示二者有差異。形態方面，郭於 2003 年將金門地區水韭和東亞其他地區水韭互相比較，發現形態上與金門地區水韭最相像的是 I. taiwanensis，兩者僅在大小孢子花紋、大小與球莖瓣數上有差異：大孢子方面，二者均為散彎紋（rugulate）；但 I. taiwanensis 的大孢子大小為 300-360µm，金門產水韭大孢子大小為 250-310µm。小孢子方面，二者均為刺紋（echinate），但 I. taiwanensis 的刺紋是屬於較尖的刺紋，金門地區水韭則為較鈍的刺紋；金門產水韭之小孢子大小為 32-34µm，I. taiwanensis 小孢子大小為 23-26µm。此外，I. taiwanensis 的球莖形態為三瓣與金門產水韭的球莖瓣數二瓣或三瓣，亦有不同。由於金門地區水韭與 I. taiwanensis 在形態上雖有差異，但差異不大，因此，目前是將金門地區水韭處理為分類地位不明的狀態。 Liu et al.（2004）曾整理目前東亞地區水韭已被發表的種類，共有大陸地區三種，分別是 I. hypsophila、I. yunguiensis、I. sinensis var. sinensis；日本地區六種，分別是 I. sinensis var. sinensis、I. sinensis var. coreana、I. asiatica、I. japonica、 4.

(5) I. x michinokuana、I. pseudojaponica；韓國四種，分別是 I. sinensis var. sinensis、 I. sinensis var. coreana、I. asiatica、I. japonica；加上台灣的 I. taiwanensis。除此之外，暫將金門地區的水韭列為未確定的種 I. sp.（金門），故目前東亞地區總共有九種水韭及一個未確定種。. 三、研究背景近年於金門國家公園太武山區發現水韭族群，其來源不明，經郭（2003）運用植物形態學、解剖學、孢粉學、染色體數目等方法，比對金門產水韭與東亞鄰近地區其他水韭之特徵，包括 I. yunguiensis、I. sinensis var. sinensis、I. sinensis var. coreana 、 I. asiatica 、 I. japonica 、 I. x michinokuana 、 I. pseudojaponica 、 I. taiwanensis、I. hypsophila，發現金門地區水韭與東亞其他地區水韭皆有相異之處，故目前其分類地位不明。郭（2003）推測目前棲地應該不是演化出該物種的原生地，根據金門地區候鳥與過境鳥之遷徙路線，許多候鳥來自大陸，且二者之間距離較近，推測金門地區水韭來自中國大陸的可能性較高，如要更加確認，還需進行 DNA 序列的分析比較。目前水韭屬植物在分子方面所使用的片段多是以核 ITS 及 LEAFY 的第二個 intron 來進行分析。Hoot et al.（2001）曾嘗試使用核 ITS 和葉綠體 atpB-rbcL spacer 等片段來建構美洲、歐洲、紐西蘭、澳洲、亞洲等地的水韭屬植物親緣關係（圖一）。以核 ITS 和葉綠體 atpB-rbcL spacer 片段的結果可知，可將全世界水韭屬的植物可分為三大分支，舊世界和加州分支、亞洲分支、北美洲分支。其中舊世界和加州分支包括來自加州、非洲、歐洲的種類；亞洲分支則包含來自東亞、紐西蘭和澳洲的種類；北美洲分支則為來自美洲的種類。研究中發現，美洲的水韭屬植物因加州的兩個種類 I. nuttallii 及 I. orcuttii 被併入舊世界的分支中，因此並非一個單系群；而東亞的種類與紐澳地區較為相近，合併在同一個分支中，兩者呈. 5.

(6) 姊妹群關係，但此研究中所使用的東亞種類僅有 I. taiwanensis 和 I. japonica 兩種，種類過少代表性不足。 2004 年 Taylor 等人，曾利用核 ITS 和 LEAFY 等片段研究大陸、台灣地區五種水韭間的關係，研究中提出大陸地區的 I. sinensis var. sinensis 可能是一個異源多倍體假說，而其雜交親本可能來自 I. taiwanensis 和 I. yunguiensis 兩者的祖先。由於研究中僅針對大陸、台灣地區進行，但鄰近的日本地區與金門地區水韭並未在此研究中被探討，因此，此項假說目前有待驗證。. 四、研究目的本研究擬利用兩個分子遺傳標記片段：核 ribosomal ITS 及 LEAFY 的第二個 intron。針對東亞和紐澳地區水韭屬植物進行研究，除東亞地區所收集到的種類外，加入由美國威斯康新大學密爾瓦基分校的 Dr. Sara Hoot 與密爾瓦基博物館 Dr. Carl Taylor 所提供的序列，一起合併分析，建構親緣關係樹（Phylogenetic tree）。用此分子資料來輔助形態資料，解決金門地區水韭分類地位的問題；並由親緣關係樹上的歸群情況，以瞭解東亞地區水韭屬植物間的親緣與雜交關係。. 6.

(7) 貳、研究材料及方法一、材料採集以大陸、日本、台灣、金門地區採集到水韭為研究對象，包括大陸地區 I. sinensis var. sinensis、日本地區 I. japonica、I. asiatica、台灣 I. taiwanensis 及 I. sp. （金門），每一物種採五個個體新鮮葉片，攜回實驗室後，儲存在-80℃冰箱保存，以供後續實驗使用。外群方面，參考 Dr. Sara Hoot 針對世界各地水韭屬植物所建構的親緣關係樹（圖二）（未發表），以東亞和紐澳地區種類為內群，地中海地區或美洲地區的種類為外群進行分析。紐澳、地中海、美洲與部分東亞地區的序列由美國威斯康新大學密爾瓦基分校的 Dr. Sara Hoot 和密爾瓦基博物館的 Dr. Carl Taylor 提供，一併加入分析比對（表一、表二）。 ribosomal ITS 片段方面，所使用的內群種類有：東亞地區，I. hypsophila、 I. yunguiensis、I. taiwainensis、I. asiatica、I. japonica、I. sinensis var. sinensis、I. sp.(金門)；紐澳地區，I. drummondii、I. gunnii、I. brevicula、I. pusilla、I. muelleri、 I. kirkii。外群部分為地中海地區，I. setacea、I. histrix。 LEAFY 的第二個 intron 片段方面，所使用的內群種類有：東亞地區，I. hypsophila、I. yunguiensis、I. taiwainensis、I. asiatica、I. japonica、I. sinensis var. sinensis、I. sp.(金門)；紐澳地區，I. drummondii、I. gunnii、I. pusilla、I. muelleri、 I. kirkii；新幾內亞地區，I. habbemensis。外群部分為地中海地區，I. setacea；美洲地區，I. echinospora。. 二、形態觀察採新鮮樣本利用掃瞄式電子顯微鏡（JSM-6300 scanning electron microscope，JEOL，U.S.A）觀察水韭大小孢子形狀、大小、表面之花紋。步驟如下： 7.

(8) 以 FAA（formalin-acetic acid-alcohol）固定水韭孢子 24 小時後，每隔十分鐘依序以 70％、85％、95％及 100％的乙醇置換先前的溶液。於臨界點乾燥機中，以液態二氧化碳將 100％乙醇置換掉再進行臨界點乾燥，乾燥後的孢子取出進行鍍金處理，完成鍍金的孢子以掃瞄式電子顯微鏡進行觀察並照相。. 三、染色體於早上 11：30，取下約 1 公分長的根尖組織，泡在 PDB 溶液（paradichlorobenzene 水溶液）中，於室溫下靜置 3 小時，取出根尖組織，固定於 5 ml 新鮮配置的 Farmer’s 溶液中（95％乙醇：冰醋酸=3：1）室溫下 1 個小時，以 3 ml 濃度 1N 的鹽酸於 60℃中處理 10 分鐘；再以 4 ml 95％的乙醇於室溫清洗 15 分鐘，並重複此清洗動作一次；將根尖吸乾，以 Whittman’s Hematoxylin 染劑染色 50 分鐘；2 ml 冰醋酸於室溫處理 5 分鐘以去除染劑並軟化根尖組織；在解剖顯微鏡下，取根尖組織最前端 1 mm 部分，並將之置於乾淨的載玻片上；滴一滴 Hoyer’s Mounting Medium 於載玻片上，使用金屬棒末端將根尖組織壓碎；蓋上蓋玻片，將玻片翻面放在 45℃加熱板中處理 30 秒後取回；再以鉛筆末端進行根尖組織壓片，將製作好的根尖組織壓片以 400X 光學顯微鏡觀察。. 四、分子資料方法與分析（一）DNA 萃取將採回的葉片取約半片，用液態氮磨成粉末，加入 500µl 的 extraction buffer，上下翻轉混勻後，於 65℃加熱 10 分鐘，冷卻至室溫後，加入 500µl 的 phenol : chloroform（1:1）溶液，上下翻轉混勻，以高速離心 10 分鐘（10000rpm），取上清液至一離心管後，再加入 500µl 的 chloroform，上下翻轉混勻後，以 10000rpm 離心 10 分鐘，再取上清液到已含 300µl isopropanol 的離心管中，將 sample 上下翻轉混勻，置於冰上 5 ~ 10 分鐘，再以 13000 rpm 離心 10 分鐘，將上清液吸掉，留下 pellet，加入 1 ml 70%的 EtOH 清洗，將 pellet 拍打至懸浮後，再以 13000rpm. 8.

(9) 離心 5 分鐘後，將 EtOH 倒掉，管子倒置晾乾，待 pellet 乾燥後，溶在 50µl 的 ddH2O 中，並在瓊脂膠片（agarous gel）中以 120V 電泳 15 分鐘檢查其完整性， UV 照相時根據條帶亮度粗估總 DNA 之含量。萃取出來之總 DNA 保存於-20 OC 冰箱。. （二）引子設計本研究使用的引子（primer）片段有兩組，核 ribosomal ITS 片段的引子是參考 Hoot and Taylor（2001）所使用的引子。在核 LEAFY 的第二個 intron 片段，使用的引子是參考 Hoot et al.（2004）針對 1150 bp 重複序列的第二個 intron 所設計的專一性引子（specific primer），引子的序列資料如下：核 ribosomal ITS 片段： ITS（1830F）：5’-AAC AAG GTT TCC GTA GGT GA-3’ ITS（25R）：5’-TAT GCT TAA AYT CAG CGG GT-3’. 核 LEAFY 的第二個 intron 片段： LFY-SF：5’-GAT CTT TAT GAA CAA TGT GG-3’ LFY-SR：5’-GAA ATA CTT GAT TTG TAA CC-3’. （三）聚合酶鏈鎖反應（Polymerase Chain Reaction, PCR） PCR 反應利用 GeneAmp PCR System 9700 的機器進行，本研究選用的兩個片段 PCR 反應溶液及反應條件分別如下： 1、擴增 ITS 片段：每 20µl 的 PCR 反應溶液包含：15.2µl ddH2O、2.0µl 10×緩衝溶液、0.2µl dNTP （5µM）、0.2µl（10µM）引子、酵素 0.2µl（ABgene）、DNA 模板 2.0µl。反應的條件先經梯溫（46℃-56℃）找出最佳黏合溫度（annealing temperature），所測出的反應條件為：. 9.

(10) (1). predenature：94℃，3 分 30 秒。. (2). denature：94℃，30 秒。. (3). annealing：I. taiwanensis、I. sinensis、I. asiatica 皆是 55℃，30 秒； I. sp.（金門），50℃，30 秒；I. japonica，51.6℃，30 秒。. (4). extension：72℃，1 分鐘。. 重複（2）～（4）步驟 35 個 cycles。 (5). final extension：72℃，7 分鐘。. 2、擴增 LEAFY 片段：每 20µl 的 PCR 反應溶液包含：15.2µl ddH2O、2.0µl 10×緩衝溶液、0.2µl dNTP （5µM）、0.2µl（10µM）引子、酵素（Taq polymerase）0.2µl（ABgene）、DNA 模板 2.0µl。反應的條件先經梯溫（46℃-56℃）找出最佳黏合溫度（annealing temperature），所測出的反應條件為： (1). predenature：94℃，4 分鐘。. (2). denature：94℃，1 分鐘。. (3). annealing：45℃，1 分鐘。. (4). extension：72℃，1 分鐘。. 重複（2）～（4）步驟 40 個 cycles。 (5). final extension：72℃，4 分鐘。. 反應後的產物需以電泳分析以確定其有無雜帶及片段大小是否正確，以 2﹪ 的瓊脂膠片於 TBE 緩衝液中進行，電壓 120V 20 分鐘取出，於 UV 燈下觀察照相，檢查有無正確片段大小的產物。. （四）PCR 產物純化 PCR 的產物 DNA 以 Gel Extraction kit（VIOGENE）純化，步驟如下：把先前切下的膠片不含 DNA 的部分盡量切除（以不超過 200mg 為佳），之後置入管柱中，加入 0.5 ml GEX 緩衝溶液後，於 60℃中加熱 10 分鐘，全部溶解後取至 10.

(11) DNA 管柱中，以 13000 rpm 離心 30 秒，倒掉濾液，加入 0.5 ml 清洗緩衝液Ⅰ，再以 13000 rpm 離心 30 秒，再加入 0.7 ml 清洗緩衝液Ⅱ，以 13000 rpm 離心 30 秒，再額外離心 13000 rpm 1 分鐘以除去酒精，最後加入 30µl（先預熱 60℃）的 ddH2O，等 30 秒後以 13000 rpm 離心 1 分鐘，所得即為純化的 DNA 溶液，再以瓊脂膠片（agarous gel）120V 電泳 15 分鐘檢查有無正確片段大小的純化產物。. （五）Cloning 及定序使用 Promega Corporation 的 yT&A 載體進行選殖，將純化後的 DNA 片段取出 1.0 µl，加入 1.0 µl Ligation 緩衝溶液 A、1.0 µl Ligation 緩衝溶液 B、0.3 µl DNA Ligase、0.5 µl yT&A 載體，加水至 10 µl，於 4℃下反應 12 小時，之後取出反應液 2 µl，加入大腸桿菌勝任細胞（Escherichia coli competent cell），於 42℃下反應 45 秒，馬上插入冰上，再加入 160 µl LB 液體培養基，取出 50µl 培養液加入 40µl 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galatopyranoside（X-gal）和 4µl isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside（IPTG），以玻棒塗勻於 LB 固體培養基上，於 37℃下培養 12 小時。以牙籤挑出白色菌落，利用引子 M13R/M13F 進行 PCR 反應，每 10µl 的 PCR 反應溶液包含：8.3 µl ddH2O、1.0 µl 10×緩衝溶液、0.2 µl dNTP（5µM）、0.2 µl （10µM）引子、酵素（Taq polymerase）0.1 µl（ABgene）、菌。反應的條件為： 94℃ 5 分鐘；進行 30 個循環反應：94℃20 秒，55℃20 秒，72℃30 秒，30 次反應結束後，再加上 72℃反應 7 分鐘，使各片段充分延長。反應後產物以 2%的瓊脂膠片於 TBE 緩衝溶液中進行電泳分析以確定轉殖進入的片段大小是否正確，若是片段大小正確，則將該菌落送去定序。二倍體的種類每個個體至少送三個菌落去定序，多倍體的種類每個個體至少送五個菌落進行定序工作。定序工作是委託基隆米克斯（Genomics Bioscience＆ Tech Co., Ltd）生物技術公司以 ABI 自動定序儀進行，並取得序列資料，以備後續分析。 11.

(12) （六）DNA 序列分析與親緣分析 1、序列的整理與校對將定序所得到的 ABI 檔案以 DNASTAR 軟體進行人工判讀及確認，並至 NCBI 資料庫，進行序列的比對（blast），以確認是否為同一類群生物之序列。. 2、序列的排列（alignment）將正確的序列於 BioEdit（Hall, 1999）軟體中，進行比對排列，插入間隙以達最大的相似性及合理性，將排列完成的序列存成 FASTA 檔格式，並利用 DnaSP （version 4.00）（Rozas et al, 2003）軟體轉存成 MEGA 檔、PHYLIP 檔及 NEXUS 檔格式，以備後續分析之用。. 3、序列間隙編碼間隙的處理上，根據 Simmons & Ochoterena（2000）處理間隙的方式，採用保守簡單間隙編碼（coding）的方法，將間隙予以特別編碼。利用 MacClade 軟體（version 4.06）（Maddison et al., 2003），將先前排列好轉存為 NEXUS 檔打開，以目視法將排列好的序列中認為有意義的間隙加以額外編碼，並存成 NEXUS 檔格式，以備後續使用 PAUP 進行最大簡約分析（Maximum Parsimony analysis）。另外，參考 Hoot et al.（2004）處理序列的方式，序列排列上模擬兩可無法判斷間隙該插入何位置較佳時則選擇去除，對於多倍體種類的序列，則仔細檢查有無重組（recombination）序列出現，若同一條序列中出現兩段不同的置換率（substitution rate）則可能為重組序列，因此該序列則予以刪除。. 4、親緣關係樹的建構在親緣關係樹的建構上，本研究分別以距離法（distance-based approach）及 12.

(13) 特徵法（character-based approach）及貝氏估算（Bayesian inference）進行分析建構。在距離法部分，選以鄰接法（neighbor-joining method）用 MEGA 3 軟體（version 3.0）（Kumar et al., 2004）進行分析，再根據 Kimura-2-parameter model 計算兩兩序列間的距離矩陣，建構出鄰近接群（Neighbor-joining）樹，並以 1000 次重複取樣，評估鄰近接群（Neighbor-joining）樹上每一分支的可信度。在特徵法部分，使用最大簡約法（maximum parsimony method，MP）以 PAUP 軟體（version 4.0b10）（Swofford, 2000）進行親緣關係樹（Phylogenetic tree）重建。最大簡約法的分析循分析軟體之預先設定，並事先選用外群。在最佳演化樹的找尋方面，最大簡約法以啟發式搜尋（heuristic search）：100 次重複的 random stepwise addition 進行找尋。由上述方法所推衍的親緣關係樹（phylogenetic tree），其內每個分支（interior branch）的信賴程度以 bootstrap method 進行評估（Felsenstein, 1985），並以 500 次特徵重取，每次特徵重取時，最佳樹的找尋方式以啟發式搜尋進行。在貝氏估算方面，以 Mrbayes 軟體（Version 3.0）（Huelsenbeck and Ronquist, 2001）進行親緣關係樹的重建，在軟體的設定上，先以 Modeltest 找出最適合的模式設定，用 MCMC 方法，經過一千萬步（generations）的搜尋，每一百步作一次記錄，利用 burn in 方法，去除起始搜尋步數，將記錄結果建構親緣關係樹。. 13.

(14) 參、結果一、形態資料檢視金門地區水韭族群的棲地及形態資料，金門太武山的水韭棲地範圍狹小，水位亦淺，該水韭為沈水或露出水面生長；葉 17-25 片叢生為一株，呈螺旋狀排列，長度 9 到 18 公分，具雙分叉形式的根，孢子囊位於葉基部，呈卵形，2╳2-3 mm；球莖約有 30-40％的個體是兩瓣，寬度 4-10mm，60-70％的個體是三瓣，寬度 8-15mm；葉片靠近基部有膜狀邊緣（membranous margins），葉舌基部為三角形，尖端向上延伸出 1-1.5mm。中柱孔道數目為 1，不具周邊纖維束（peripheral fiber），如（圖三）。採製新鮮樣本觀察孢子花紋並製作染色體壓片，大孢子潮濕時為灰色，乾燥時為白色，大小為 250-310µm，在掃瞄式電子顯微鏡下觀察其大孢子為散彎紋（rugulate）（圖四）；小孢子呈灰色，橢圓形，長 24-28µm（圖五），表面為刺紋（echinate），spines 長度約為 1.8-2.0µm。由根尖組織製作的染色體壓片觀察其染色體數目為 2n=22（圖六）。將本次重新檢視金門地區水韭族群所收集的形態資料，與郭（2003）所收集的形態資料互相比對，發現在小孢子花紋、形狀和大小上有些許差異。郭（2003）所收集到的小孢子花紋（圖七），雖同為刺紋，但 spine 突出的長度為 1.7-1.9µm，且尖端較為圓滑，小孢子的形狀是偏圓的橢圓形，小孢子大小為 32-34µm；而本研究所觀察到的小孢子 spine 突出的長度為 1.8-2.0µm，且尖端較為尖刺，形狀為扁圓形，在大小上較小，為 24-28µm。郭（2003）所記錄的金門地區水韭族群形態資料，在小孢子方面，與本研究的結果不一致。推測可能是：此小孢子的變異均存在於金門地區水韭族群內，只是個體間的差異罷了，而此次觀察到的小孢子花紋及大小與 I. taiwanensis 非常相似，因此，郭（2003）所認為兩者在小孢子上的變異可能並不是一個穩定的特徵，在以下形態比對的部分，對於小孢子的特徵將不特別提出討論。 14.

(15) 將本次檢視金門地區水韭族群的形態資料與東亞地區其他水韭互相比對，比對結果如（表三）。在形態資料比對上，金門地區水韭與 I. taiwanensis 非常相似，唯在球莖瓣數與大孢子大小上有差異：球莖瓣數方面，金門地區水韭同時具有球莖兩辦和三瓣的型式，但 I. taiwanensis 皆為球莖三瓣的型式；大孢子大小方面， I.taiwanensis 比金門地區水韭大；其餘的形態特徵，金門地區水韭與 I. taiwanensis 非常相似。. 二、水韭屬植物的親緣關係（一）ITS 的分析結果 1、序列處理與分析在 ITS 片段部分，總共送了 66 個菌落進行定序工作，將得到的序列進行檢查，扣除基因型（haplotype）相同的序列，可得 33 種基因型（表一）。其中二倍體的種類：I. asiatica 共有三個個體，最後可得五種不同的基因型；I. sp（金門）有五個個體，最後可得十種不同的基因型；I. taiwanensis 有五個個體，最後可得五種不同的基因型。多倍體的種類：I. sinensis var. sinensis 有兩個個體，最後可得五種不同的基因型；I. japonica 有五個個體，最後可得八種不同的基因型。將上述 33 種基因型，合併由 Dr. Sara Hoot 所提供的 14 個基因型，總共 15 個類群， 47 種基因型。序列經排列後全部長度共 678 個鹼基對，若排除間隙和缺漏訊息（missing data）則有 649 個位點，其中包含 533 個無變異位點（invariable sites）與 116 個變異位點（variable sites），變異位點中具有 61 個簡約訊息位點（informative site）。但考慮到間隙訊息漏失的問題，在進行最大簡約法（maximun parsimony method，MP）分析時，參考 Simmons & Ochoterena（2000）處理間隙的方式，將間隙予以特別編碼，處理完參與分析的序列長度為 664 個鹼基對，其中包含 538 個不變位點（invariable sites）與 126 個變異位點（variable sites），變異位點中具有 64 個簡約訊息位點。 15.

(16) 在鹼基組成方面，47 種基因型中平均 A 為 23.3%、C 為 31.9%、G 為 28.9%、 T 為 15.9%，G＋C 含量為 60.5%。進行鹼基取代的飽和程度測試，以成對序列間的鹼基替換（transition）、顛換（transversion）率對 p-distance 之遺傳距離作圖（圖八）。圖中由於橫軸中央部分（遺傳距離 0.04 至 0.05 的範圍）的樣點較少，致使曲線無法清楚的呈現，但仍可看出替換率始終隨遺傳距離的增加而遞增，若在替換率的點上尋求趨勢線，直線的趨勢線，其 R2 可高達 0.9582。而顛換率在遺傳距離較大的部分（遺傳距離大於 0.04），增加趨勢有略呈平緩的現象，此部分主要是在與外群序列間比較時。但若在顛換率的點上尋求趨勢線，直線的趨勢線，其 R2 可高達 0.7756，因此，顛換率也呈隨遺傳距離增加而遞增的情形。此外，遺傳距離較大（遺傳距離 0.04 以上）的部分，其替換率與顛換率間的差距明顯增加。由上述可知，鹼基取代的情形在此未達飽和。. 2、親緣關係樹建構（1）鄰接法（neighbor-joining method，NJ）由 MEGA 中所得到的鹼基 transition/transversion 值為 2.3，因此考慮到鹼基替換和顛換次數不同的情況，在鄰接法方面以 Kimura-2-parameter 模式修正，在間隙和漏失訊息的處理上以 pairwise deletion 的方式來建構親緣關係樹。在鄰接法所建構的親緣關係樹中（圖九），東亞地區的種類並不自成一個單系群（monophyletic group），I.asiatica 的兩個基因型：asiatica14362、asiatica14363 及 I. hypsophila 的兩個基因型：Ihypsophila、hypsophila，分佈在由東亞地區其他種類基因型所形成的大分支（clade）外。這個由多數東亞物種所形成的大分支，具有 95%bootstrap 支持度，但在此大分支內的解析力不夠，對東亞地區物種間的關係未能提供良好的解釋。紐澳地區的種類在上述東亞大分支的外層，也不自成一單系群。I. asiatica 的兩個基因型：asiatica14362、asiatica14363 與 I. hypsophila 的基因型分別形成具 100%及 99%bootstrap 支持度的小分支，為親緣關係樹內群部分最外層的兩 16.

(17) 分支。I. asiatica 雖有兩個基因型分佈於非常外層的位置，但 I. asiatica 仍有三個基因型：asiatica14151、asiatica14257、asiatica14256 是併入多數東亞物種所形成的大分支內。. （2）最大簡約法（maximun parsimony method，MP）以最大簡約法分析時，考慮到間隙的問題，根據 Simmons & Ochoterena （2000）處理間隙的方式，將間隙予以特別編碼，編碼完參與分析的序列長度為 644 個鹼基對，其中包含 538 個不變位點（invariable sites）與 126 個變異位點（variable sites），變異位點中具有 64 個簡約訊息位點。總共有 10 個間隙區塊被編碼，其中有 5 個簡約訊息位點。以啟發式搜尋法（heuristic search）進行分析後，共獲得 6 個同等簡約的拓樸（topology），樹長均為 162，以嚴格共識樹（strict consensus tree）呈現（圖十），其 CI（consistency index）值為 0.852，RI（retention index）值為 0.873。在最大簡約法所建構的嚴格共識樹中（圖十），呈現的拓樸（topology）與鄰接樹相似，東亞地區的基因型，除了 I. asiatica 的兩個樣本（asiatica14362、 asiatica14363）及 I. hypsophila 的 Ihypsophila、hypsophila 外，其餘多數東亞的種類形成一個具 91％bootstrap 支持度的大分支，但在此分支內，對於東亞物種間的關係未能提供良好的解釋。 I. hypsophila 和部分的 I. asiatica 序列則與紐澳地區的基因型一起被歸於上述的大分支外，且 I. hypsophila 與部分 I. asiatica 的序列在嚴格共識樹中，被歸於較基部的位置。I. asiatica 雖有兩個基因型分佈於非常外層的位置，但 I. asiatica 仍有三個基因型：asiatica14151、asiatica14257、asiatica14256 是併入多數東亞種類所形成的大分支內。. （3）貝氏估算（Bayesian inference，BI）以先前由 Modeltest 所得到的參數作為進行貝氏估算時的設定，其中 Nst=6， 17.

(18) rates=invgamma，Tem=0.2。在貝氏估算所得的親緣關係樹中（圖十一），呈現的拓樸仍與鄰接法和最大簡約法相似，東亞地區的物種並非一單系群，在此片段上，對東亞物種間的關係無法提供良好的解釋。. （二）LEAFY 的分析結果 1、序列處理與分析在 LEAFY 片段部分，總共送了 60 個菌落進行定序工作，將得到的序列進行檢查，扣除基因型（haplotype）相同的序列，可得 30 種基因型（表二）。其中二倍體的種類：I. asiatica 共有三個個體，最後可得四種不同的基因型；I. sp（金門）有五個個體，最後可得三種不同的基因型；I. taiwanensis 有五個個體，最後可得五種不同的基因型。多倍體的種類：I. sinensis var. sinensis 有兩個個體，最後可得十種不同的基因型；I. japonica 有五個個體，最後可得八種不同的基因型。將上述 30 種基因型，合併由 Dr. Sara Hoot 及 Dr. Carl Taylor 所提供的 32 個基因型，總共 15 個類群，62 種基因型。但經序列檢查後，發現 I. sinensis var. sinensis 有八個基因型為重組序列（表四），此重組序列可能會干擾親緣關係樹的建構，因此予以去除，重組序列的部分將於後段討論時說明。最後參與分析的序列共有 15 個類群，54 種基因型。序列經排列後全長共 890 個鹼基對，若不考慮間隙和缺漏訊息（missing data）則有 560 個位點，其中包含 354 個無變異位點與 206 個變異位點，變異位點中具有 105 個簡約訊息位點。在進行最大簡約法分析時，考慮到間隙訊息漏失的問題，參考 Simmons & Ochoterena（2000）處理間隙的方式，將間隙予以特別編碼，處理完參與分析的序列長度為 604 個鹼基對，其中包含 378 個不變位點與 226 個變異位點，變異位點中具有 117 個簡約訊息位點。在鹼基組成方面，平均 A 為 30.1%、C 為 16.2%、G 為 19.9%、T 為 33.8%， G＋C 含量為 36.9%。將序列進行鹼基取代飽和程度的測試，以成對序列間的鹼基替換、顛換率對 p-distance 之遺傳距離作圖（圖十二）。由圖中可看出替換率 18.

(19) 隨遺傳距離增加而直線遞增，其直線的趨勢線 R2 值為 0.9756；而顛換率亦是隨遺傳距離增加而遞增，且遺傳距離越大遞增趨勢有增快的情形，其直線的趨勢線 R2 值為 0.9465，綜合上述，鹼基的取代情形在此未達飽和。. 2、親緣關係樹建構（1）鄰接法（neighbor-joining method，NJ）利用 MEGA 軟體計算鹼基 transition/transversion 值為 2.1，因此考慮到鹼基替換和顛換次數不同的情況，在鄰接法方面以 Kimura-2-parameter 模式修正，在間隙和漏失訊息的處理上以 pairwise deletion 的方式來進行親緣關係樹的重建。在鄰接法所建構的親緣關係樹中（圖十三），東亞地區水韭屬植物並沒有形成一單系群，新幾內亞的 I. habbemensis 和東亞地區的多數種類（除了 I. hypsophila）形成一個具 100%bootstrap 支持度的大分支。在此大分支內，東亞地區的歸群關係，大致可以分成三大類。第一類為：I. taiwanensis 的七個基因型和金門地區的三個基因型以及四個 I. sinensis var. sinensis 的基因型形成一個具 96％bootstrap 支持度的分支，在這個分支中，三個金門地區的序列再形成一個具 65％bootstrap 支持度的分支。第二類為：I. sinensis var. sinensis 有四個基因型 sinensisT1312、 sinensisT1296、sinensis1294、sinensisT1315 與 I. yunguiensis 的三個基因型 yunguiensis 132、yunguiensisT1306、yunguiensisT1307 形成一個具 94％bootstrap 支持度的分支。第三類為：I. asiatica 與 I. japonica 這兩個物種的基因型彼此混雜形成三個分支，分別具 85%及兩個低於 50%以下 bootstrap 支持度，在這三個分支中，皆可見同時具有 I. asiatica 及 I. japonica 的基因型。紐澳地區的種類歸群於上述大分支外，形成一個具 86％bootstrap 支持度的分支，但東亞地區的 I. hypsophila 在整個親緣關係樹上位於最外層的位置。綜合上述，東亞和紐澳地區水韭屬植物無法在親緣關係樹上各自歸群成獨立兩分支。 19.

(20) （2）最大簡約法（maximun parsimony method，MP）進行最大簡約法分析時，考慮間隙的問題，根據 Simmons & Ochoterena （2000）處理間隙的方式，將間隙予以特別編碼，編碼完參與分析的序列長度為 604 個鹼基對，其中包含 378 個不變位點與 226 個變異位點，變異位點中具有 117 個簡約訊息位點。共有 21 個間隙區塊被編碼，其中有 12 個簡約訊息位點。另外有四個區域，分別是 74 bp、7 bp、36 bp、21 bp 是序列排列模擬兩可的部分直接被刪除而不加以編碼（Hoot and Douglas, 1998）。採用啟發式搜尋進行分析後，共獲得 6 個同等簡約的拓樸，樹長均為 772，以嚴格共識樹呈現（圖十四），其 CI 值為 0.841，RI 值為 0.904。在最大簡約法所建構的嚴格共識樹中（圖十四），呈現的結果與鄰接樹相似，東亞地區水韭屬植物並非一單系群，除了 I. hypsophila 外，其餘東亞地區的種類與新幾內亞的 I. habbemensis 形成一個具 100%bootstrap 高支持度的大分支。此大分支內的歸群關係，大致上可分成三類歸群，第一類歸群：I. taiwanensis 的基因型和金門地區的基因型以及四個 I. sinensis var. sinensis 的基因型形成了一個具 87 ％bootstrap 支持度的大分支，在此大分支內，三個金門地區的序列形成一個具 65％bootstrap 支持度的小分支。第二類歸群：四個 I. sinensis var. sinensis 的基因型和 I. yunguiensis 的序列形成一個具 82％bootstrap 支持度的分支。第三類歸群：I. japonica 和 I. asiatica 這兩個種類的基因型彼此混雜，形成三個分支，於此三分支中皆同時具有 I. asiatica 與 I. japonica 這兩個種類的基因型，三個分支的 bootstrap 支持度分別是 55％、97％、72％。此外，尚有兩個 I. japonica 的基因型在上述的三個分支外。紐澳地區的種類在此形成一個具 92%bootstrap 支持度的分支，I. hypsophila 在整個親緣關係樹內群部分最外層的位置。綜合上述，東亞和紐澳地區水韭屬植物無法在親緣關係樹上各自歸群成獨立兩分支。 20.

(21) （3）貝氏估算（Bayesian inference，BI）以 modeltest 找出最適合的條件參數，再以此參數作為進行貝氏估算時的設定依據，本次的設定是 Nst=6，rates=invgamma，Tem=0.2。在貝氏估算中呈現的是無根（unrooted）的樹型圖（圖十五），但仍可由拓樸中的歸群關係得到與最大簡約樹非常相似的結果。東亞地區水韭屬植物並非一單系群，此區物種間的歸群結果也與最大簡約樹的三大類歸群關係相同，且至少具有 82%以上的機率。另外，I. hypsophila 在整個親緣關係樹內群部分最外層的位置，東亞和紐澳地區水韭屬植物無法在親緣關係樹上各自歸群成獨立兩分支。. （4）遺傳距離頻率估算利用 LEAFY 片段的結果，在由最大簡約法所建構之樹形圖中，對於每一分支內的每個物種各挑選一個基因型為代表，與紐澳地區的種類，進行種間遺傳距離的估算，將得到的遺傳距離換算成頻率作圖（圖十六）。可發現東亞地區水韭屬植物的遺傳距離集中在 0.01，紐澳地區則在 0.05-0.07 出現較高的頻率，由此可知，紐澳地區具有較高的遺傳距離，而東亞地區的遺傳距離偏低。. 21.

(22) 肆、討論一、ITS 片段的協同演化與問題由 ITS 片段所得的親緣關係樹中皆可發現，I. asiatica 有兩個基因型被分到最外層的位置，但 I. asiatica 其餘三種基因型則是與多數東亞的種類歸群在一起，此一現象並未在 LEAFY 的片段中看到相同的情況。針對 I. asiatica 有兩個基因型被歸群到最外層位置，本研究提出以下的解釋：ITS 片段雖然在核內具有很多重複序列（copies），但這些重複序列間會進行協同演化（concerted evolution），在不同的重複序列中各自累積較顯著的變異，再藉由高頻率的互換（crossing over）或基因轉變（gene conversion）逐漸變成相同型式的序列而同源化（Ainouche and Bayer, 1997），藉此協同演化的過程可逐漸消除因複製（duplicate）而產生的 paralogous sequence。因此，ITS 片段常被用於研究親緣關係歷史、探討多倍體的祖先種、基因體間的關係、漸滲回交（introgression）等演化上的問題（Bailey et al., 2002；Wissenmann, 2002）。關於此片段使用上的困擾也陸續被提出來，ITS 片段在使用上的問題，主要有以下三點：第一，有越來越多的文獻去探討關於這些重複序列間，是否到達完全同源化的問題。當重複序列間未達完全同源化，則於我們分析的序列中可能同時存在著 orthologous 和 paralogous 序列，會影響親緣關係的分析，混淆物種的分歧事件。因此，錯誤的評價 orthologous 和 paralogous 序列，會造成親緣關係的不一致（Wendel and Doyle, 1998）。第二，於雜交後當經歷不同程度的基因重組，也會造成出現較歧異的 ITS 序列；由於在雜交種裡，基因重組（recombination）事件非常普遍，因此重組的發生也可用來解釋此類較歧異的 ITS 序列（Barkman and Simpson, 2002）。第三，ITS 的重複序列可能在演化的過程中出現沒有功能的僞基因（pseudogenes），此類僞基因會有較低的二級結構穩定性及 GC 含量，在保守區會有較高的取代率，也會干擾親緣關係分析的結果。檢視此次 ITS 片段，其 GC 含量為 60.5％，低於一般期望的 70-73％（Buckler and Holtsford, 1996），. 22.

(23) 因此，不排除有此可能性。由於在 LEAFY 片段中並未見到有被歸群到外層的 I. asiatica 基因型，在 ITS 片段進行 Cloning 送菌落去定序的結果，可發現二倍體的種類 I. asiatica 與 I. sp （金門），均可得到超過個體數目的基因型，亦即一個個體可能有兩種以上的基因型出現；而多倍體的種類，同樣也可得到相當多型的基因型。因此，本研究認為造成上述結果的可能原因是：在本次分析的序列中可能同時存在著 paralogous 和 orthologous 的序列，而在水韭屬的植物中雜交事件相當的頻繁，這些多倍體的種類可能存在著雜交後又重組過的序列，再加上本次序列的 GC 含量偏低，可能也存在著偽基因的影響，這三個因素導致在親緣關係樹上看到較歧異的 I. asiatica 基因型出現。由 Hoot et al.（2001）與未發表的結果（圖一、圖二），可發現以 ITS 片段建構全世界水韭屬植物的親緣關係樹，均可獲得良好的解析。但本研究中利用 ITS 片段，對東亞地區水韭屬植物建構親緣關係樹，卻無法對東亞地區種類間的關係提供良好的解析。推測原因為：第一，本研究的 ITS 序列，受到上述關於 ITS 協同演化、重組與偽基因討論的影響，使得親緣關係樹無法提供良好的解析；第二，東亞地區水韭屬植物彼此間可能是較近緣的種類，由遺傳距離的估算（圖十六），可發現東亞地區水韭屬植物的遺傳距離偏低，而 ITS 片段在此累積的變異量可能不足以將此近緣種間的關係釐清。上述兩點都有可能是此片段無法作為本研究良好分子遺傳標記的因素。因此，關於金門地區水韭族群的分類地位與東亞類群間的關係，以下主要以 LEAFY 片段的結果進行探討。. 二、金門地區水韭族群分類地位探討在形態資料的比對中（表三），金門地區水韭族群與 I. taiwanensis 最為相似，唯在球莖瓣數及大孢子大小上有穩定差異。在 LEAFY 片段上，由三種方式所得的結果差異不大，金門地區的基因型均與 I. taiwanensis 及部分 I. sinensis var. sinensis 的序列形成一個具 87％以上 bootstrap 支持度的大分支，其中金門地區的 23.

(24) 基因型又自成一個 65％以上 bootstrap 支持度的小分支。顯示在 LEAFY 的片段上，這三個類群的序列較相近，但金門地區水韭的染色體數目是 2n=22，與 I. sinensis var. sinensis 是四倍體（2n=44），明顯地不同，而 I. taiwanensis 的染色體數目與金門地區族群均為 2n=22，兩者的染色體數目相同，形態上又較為相似。因此重新檢視金門地區水韭的序列，發現此區的三個基因型一致地在第 133 位點上與 I. taiwanensis 的序列有差異（圖十七）。參考 Takamiya et al.（1996）對 I. sinensis 2n=44 和 2n=66 分類處理的方式，2n=44 和 2n=66 兩者在孢子花紋上無法分辨，僅可由小孢子大小來分辨，因此，Takamiya et al.將之處理為變種。形態上，金門地區水韭與 I. taiwanensis 非常相似，僅在球莖瓣數與大孢子大小有差異，在 LEAFY 片段上第 133 個位點一致地不同，綜合形態與分子上的結果，建議將金門地區水韭視為 I. taiwanensis 的變種。金門地區水韭族群在形態上與 I. taiwanensis 有些許的差異，推測金門地區水韭可能的來源為：金門地區水韭與 I. taiwanensis 來自共同的祖先，後來因水鳥的傳播分處不同的棲地環境；金門地區水韭的棲地是裸露的花崗岩塊，底質土壤較少，棲地溫度較高；而 I. taiwanensis 的棲地夢幻湖則是土壤與水分均較充足的環境，溫度上較金門地區低；兩者在不同的棲地環境中，逐漸適應當地而慢慢分歧，致使今日可觀察到在形態上有些微差異。另一種可能是金門地區水韭族群是 I. taiwanensis 經水鳥或人為等因素攜至金門，偶然地帶入某些球莖兩辦的突變種與球莖三瓣的種類，在創始者效應（founder effect）的作用下，這些偶然帶入的種類開始自行繁衍，加上棲地環境不同，致使今日形態上可同時觀察到具有球莖兩辦或三瓣的情形，與大孢子大小上的差異。. 三、東亞與紐澳地區水韭屬植物的親緣關係本研究以 LEAFY 片段，利用三種方式建構親緣關係樹，所得的結果，皆支持東亞地區水韭屬植物並非一單系群，東亞和紐澳地區水韭屬植物無法在親緣關係樹上各自歸群成獨立兩分支。 24.

(25) 在 Hoot et al.（2001）的研究中，利用核 ITS 及葉綠體 atpB-rbcL spacer 片段建構全世界水韭屬植物的親緣關係樹，曾發現東亞地區水韭屬植物與紐澳地區呈姊妹群關係（圖一），因此將這兩區的水韭屬植物歸為 Australasian Clade。在 Dr. Sara Hoot 最近尚未發表的研究結果中，同樣也以核 ITS 片段建構全世界水韭屬植物的親緣關係樹（圖二），發現東亞地區水韭屬植物並非單系群，且與紐澳地區的關係非常接近，東亞與紐澳地區水韭屬植物無法在親緣關係樹上各自歸群成獨立兩分支。本研究以 LEAFY 片段，針對東亞和紐澳地區水韭屬植物所建構的親緣關係樹也支持上述 Dr. Sara Hoot 尚未發表的結果。東亞和紐澳地區在地理位置上並不接近，為何兩區的親緣關係會如此接近，以下將進行探討。由之前的文獻記載可知，水韭屬植物的傳播（dispersal）可能有兩種方式：第一種為漂浮的葉片經由水流的攜帶而傳播（Small and Hickey, 1997）；第二種藉由水鳥南北半球間的遷徙而攜帶孢子（Taylor and Hickey, 1992）。在 Liu et al.（2004）針對大陸地區水韭屬植物地理分佈的研究裡，發現在大陸地區二倍體的種類多是位於高海拔的位置，而多倍體的種類則在低海拔的位置出現。因此，Liu et al.（2004）認為會造成如此分佈的可能原因，除了多倍體與二倍體種類對環境的適應能力不同外，猜測在高海拔地區的二倍體種類因水流攜帶漂浮的葉片至低海拔地區後發生雜交，產生低海拔地區的多倍體種類。而東亞與紐澳地區在地理位置上相差甚遠，不太可能藉由水流傳播而互相交流，造成兩區親緣關係較為接近，比較可能的原因應是水鳥南北半球遷徙而攜帶孢子所致。. 四、I. sinensis var. sinensis 的雜交親本探討 Taylor et al.（2004）針對大陸地區水韭屬植物的研究中，提出 I. sinensis var. sinensis 可能是異源多倍體的假說，而 I. taiwanensis 和 I. yunguiensis 的祖先可能是其雜交親本。Takamiya（2001）在觀察東亞這一群水韭屬植物孢子花紋時，也發現 I. taiwanensis 和 I. sinensis var. sinensis 的大孢子花紋類似，推測兩者在親緣 25.

(26) 關係上可能較為接近。本研究增加東亞地區種類的收集，以 LEAFY 片段進行分析，建構出的親緣關係樹（圖九、十、十一），可很清楚的看到 I. sinensis var. sinensis 的基因型分為兩種型式，其中一種與 I. taiwanensis 歸群在一起；另一型則與 I. yunguiensis 歸群，也支持 Taylor et al.（2004）所提出的假說：I. sinensis var. sinensis 應是異源多倍體，其親本為 I. taiwanensis 與 I. yunguiensis 的祖先。 I. sinensis var. sinensis 在此原本有 16 種基因型，但最後在上述結果分析時，只有八種基因型進行分析，其餘八種經序列檢查後判定為重組序列予以刪除，以下將說明此過程並討論：先以這 16 種基因型與其他種類的基因型，一起進行鄰接法、最大簡約法、貝氏估算的分析（圖十八、十九、二十），在這三種分析方法所得的親緣關係樹中，皆可發現 I. sinensis var. sinensis 這個種類的序列有四個歸群，可分成四種型式。其中一種型式與 I. taiwanensis 歸在同一分支，另一種型式則與 I. yunguiensis 較為相近，此外尚有兩型的基因型不在上述兩分支內。根據先前 Taylor（2004）的假說，推測這兩型不歸在兩親本分支內的基因型可能為重組序列，而 Chiang et al.（2001）對秋海棠屬所做的研究中也提出，存在兩親本以外的基因型可能是重組造成。因此，重新去檢視 I. sinensis var. sinensis 的序列（表四），發現上述這兩型不在親本分支內的基因型，在序列中均同時具有部分與 I. taiwanensis 或 I. yunguiensis 相同的區段，即（表四）中的 sinensis1293、 sinensisT1318、132532、sinensis255、sinensis149、sinensis254、sinensisT1291、 sinensisT1292，是屬於重組的序列，再此可證明於 I. taiwanensis 與 I. yunguiensis 間的確存在著雜交的事件。Harris and Crandall（2000）提出此重組序列的存在可能會造成在建構親緣關係樹時的干擾，導致錯誤的結果。在本研究中，對照有無將重組序列拿掉的樹形圖，均可發現若加入重組序列一起進行分析時，則 I. sinensis var. sinensis 除了與兩親本歸群的關係外，尚會出現這些重組序列獨自形成其他分支而造成干擾，因此本研究在進行結果分析與討論時將上述八個重組序列予以去除。. 26.

(27) 五、I. japonica 與 I. asiatica 的歸群探討 Takamiya et al.（1994）年針對日本境內的幾種水韭，進行形態及染色體數目的比較，發現 I. asiatica 與 I. japonica 形態上有許多差異，I. asiatica 的大孢子花紋是刺紋，但東亞地區其他種類的大孢子花紋並無刺紋的型式，反而是北美洲的 I. echinospora 種複合群大孢子花紋是刺紋的型式，所以推測 I. asiatica 與 I. japonica 的親緣關係應該不相近。此外，Liu et al.（2004）根據 Takamiya et al.（1994）研究的結果與 Grauvogel-Stamm and Lugardon（2001）化石上的發現，推測 I. asiatica 可能是東亞與北美洲地區水韭屬植物間關連，很重要的連結（intermediate）種類。本研究以 LEAFY 片段建構的親緣關係樹中，I. japonica 和 I. asiatica 的基因型皆彼此混雜，形成三個分支。此外，I. asiatica 也與東亞地區多數種類歸群在一起，並沒有與外群的 I. echinospora 在親緣關係樹上較為接近。因此，本研究的結果並不支持 Takamiya et al.（1994）與 Liu et al.（2004）對 I. asiatica 的推測，在 LEAFY 片段上，I. asiatica 與 I. japonica 的親緣關係較為接近。. 27.

(28) 伍、結論 1、核 ribosomal ITS 片段，對於東亞種類間的關係無法提供良好的解析力，在本研究中不是一個好的分子遺傳標記。 2、由形態比較與 LEAFY 片段的結果，建議將金門地區水韭族群處理為 I. taiwanensis 的變種。 3、東亞與紐澳地區水韭屬植物的親緣關係非常相近，兩地區的水韭屬植物無法在親緣關係樹上各自歸群成獨立兩分支。 4、LEAFY 片段的結果支持 Taylor et al.（2004）所提出的假說：I. sinensis var. sinensis 可能是異源多倍體，其親本為 I. taiwanensis 與 I. yunguiensis。 5、LEAFY 片段的結果不支持 Takamiya et al.（1994）與 Liu et al.（2004）的推論；本研究中發現，I. asiatica 應與 I. japonica 的關係較近。. 28.

(29) 陸、參考文獻 1、郭章儀，2003。金門地區水韭之形態與生態調查研究。國立台灣師範大學碩士論文。 2、黃鈞蕙，2002。台灣水韭棲地之生態因子及其族群遺傳之研究。國立台灣師範大學碩士論文。國立台灣師範大學碩士論文。 3、劉星、王勇、王青鋒、郭友好，2002。中國水韭屬植物的染色體數目及其分類學意義。植物分類學報。 4、邱明成，2001。台灣水韭棲地及其復育策略之研究。國立台灣師範大學碩士論文。 5、Alvarez, I., J. F. Wendel, 2003. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molecular Phylogenetics And Evolution 29: 417-434. 6、Ainouche, M. L. and R. J. Bayer, 1997. On the origins of the tetraploid Bromus species（section Bromus, Poaceae）：Insights from the internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA. Genome 40：730-743. 7、Bailey, C. D., C. E. Hughes, S. A. Harris and T. G. Carr, 2002. Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism ：Paralogy and pseudogenes. Unpublished manuscript. 8、Buckler, E. S. and T. P. Holtsford, 1996. Zea ribosomal repeat evolution and substitution patterns. Molecular Biology Evolution 13：623-632. 9、Campbell, C. S., M. F. Wojciechowski, B. G. Baldwin, L. A. Alice, and M. J. Donoghue, 1997. Persistent nuclear ribosomal DNA sequence polymorphism in the Amelanchier agamic complex（Rosaceae）. Molecular Biology and Evolution 14：81-90. 10、Chiang, T. T., K. H. Hong and C. I. Peng, 2001. Experimental hybridization reveals biased inheritance of the internal transcribed spacer of the nuclear ribosomal DNA in Begonia. ╳. taipeiensis. Journal of Plant Research 114：. 29.

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