蛋白質概論

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(1)蛋白質. 《緒論》 1. 蛋白質是細胞的主要有機成份,擔任多種功能,是 最重要的生物大分子 2. 蛋白質是遺傳訊息的表現者 蛋白質體學 (proteomics) - 研究蛋白質的種類、含量變化與分佈等,唯有了解 蛋白質的特性與功能才可能回答有關生命奧秘的問題 - 但未知功能的蛋白質仍佔多數. 1.

(2) 蛋白質的功能. 催化 (~20%) 調節 (14%) 運輸 (5%) 儲存 收縮運動 結構 (5%) 訊息傳遞 保護 其他 (5%) 未知功能 (>40%). 3. 蛋白質是由胺基酸組成的大分子 由20種(目前一說為22種)胺基酸構成,每種胺基酸的 側鏈構造不同 - 極性或親水的(如帶電荷或不帶電具極性的) - 非極性或疏水的 - 有些胺基酸併入蛋白質後可經轉譯後修飾作用*加上 其他官能基,此修飾作用與蛋白質的功能有關,如 凝血因子與膠原蛋白等 蛋白質的大小範圍廣 - 如胰島素含51個胺基酸,細胞色素c含104個胺基酸, 血紅素含574個胺基酸,肌聯蛋白(titin)含26,926個 胺基酸. 2.

(3) 側鏈為疏水, 側鏈為疏水, 非極性. 側鏈為芳香族, 側鏈為芳香族, 疏水 側鏈帶負電荷 側鏈帶正電荷 側鏈不帶電但具極性. 組成蛋白質的20 種胺基酸構造 組成蛋白質的20種胺基酸構造. 特殊胺基酸 特殊胺基酸-- 轉譯後修飾作用. 3.

(4) 4. 蛋白質的分類 依外觀形狀與溶解度 - 球狀蛋白,擔任功能性角色,以酵素最為重要 - 纖維狀蛋白,擔任結構支撐或保護性角色,如皮膚、 韌帶、軟骨等構造的膠原蛋白,蠶絲的絲蛋白與頭髮 的角蛋白等 - 膜蛋白(多為球狀蛋白),形成通道控制物質進出(如 運輸蛋白與離子通道),參與外界訊號的傳遞(如激素 的受體蛋白),參與能量的產生(如細胞呼吸鏈與ATP 合成酶) 依組成 - 簡單蛋白 - 複合蛋白*. 複合蛋白. 脂蛋白 醣蛋白 血基質蛋白 核黃蛋白 金屬蛋白. 4.

(5) 《蛋白質的分離與純化》 1. 蛋白質純化 利用一系列步驟保留特定蛋白質,並將其他蛋白質自 樣品中移除的過程 - 當分析特定蛋白質的結構與功能時,需將此蛋白質 由其存在的環境(如細胞抽取液)中分離出 2. 純化蛋白質的用途 純化所得的蛋白質組成均一,可用於進行活性分析的 生理生化研究、析出晶體的結構研究、工業上固定化 酵素的應用. 3. 蛋白質分離與純化的原理 分離的原理 - 利用蛋白質的分子量大小、帶電特性、溶解度或 蛋白質與特定物質間的吸附作用等 利用分子量大小 - 透析* - 超過濾* - 分子篩或膠體過濾管柱層析*. 5.

(6) 超過濾( 超過濾(ultrafiltration) ultrafiltration). 透析(dialysis) 透析(dialysis) (半透膜) 半透膜). 分子篩(molecular (gel 分子篩(molecular sieve)或膠體過濾 sieve)或膠體過濾(gel filtration)管柱層析 (column chromatography) filtration)管柱層析(column. 6.

(7) 利用帶電特性 - 離子交換管柱層析法* - 等電點焦集* 在特定pH值時,蛋白質所帶的正、負電荷相等,分子 的淨電荷為零,在電場中不移動,此pH值稱為等電點 (pI) - 電泳 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)* 二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2D電泳)* 毛細管電泳. 離子交換(ion 離子交換(ion exchange) 管柱層析. 7.

(8) 等電點交集( 等電點交集(isoelectric focusing). SDS的構造 SDS的構造. ← 蛋白質. 膠體電泳(gel 膠體電泳(gel electrophoresis). SDSSDS-PAGE可用於估測蛋白質分子量 PAGE可用於估測蛋白質分子量. 8.

(9) 依等電點分離. 2D電泳 2D電泳. 依分子量分離. 利用溶解度 - 鹽析法* 利用非專一性的吸附作用 - 活性碳 - 磷酸鈣 利用專一性的吸附作用 - 如抗體與抗原或酵素與受質間專一性的接合特性 - 親和力管柱層析*. 9.

(10) 鹽析法(salting 鹽析法(salting out). 親和力管柱層析 親和基. 10.

(11) 蛋白質的純化結果. 溶解度 帶電特性 分子大小 專一性的吸附. 《蛋白質的結構》 1. 一級結構 (各)多肽中胺基酸的組成與排列次序* 2. 二級結構 多肽因連接各胺基酸的肽鍵(peptide bond)間產生 氫鍵,而形成重複出現的特殊結構 - α-螺旋,β-褶片 肽鍵的構造與特性 - -Cα-Co-N- Cα- ,具部份雙鍵特性* - 為一平面構造(amide plane, peptide plane),自由旋轉 度為Φ與Ψ. 11.

(12) N端. C端. 多肽的表示方式與方向性 - Serylglycyltyrosylalanylleucine, Serylglycyltyrosylalanylleucine, SerSer-GlyGly-TyrTyr-AlaAla-Leu, Leu, SGYAL. 血紅素 Hemoglobin. 蛋白質四個結構層次的關係. 12.

(13) 兩胺基酸以肽鍵連接. 肽鍵因共振而無法自由旋轉, 部分雙鍵”特性 特性 肽鍵因共振而無法自由旋轉, 具“部分雙鍵. 由Ramachandran plots預測的各種構造 plots預測的各種構造. 實例( 實例(兔的pyruvate 兔的pyruvate kinase), kinase), 排除Gly 排除Gly. 13.

(14) Ramachandran plot* - 甘胺酸(glycine)*與脯胺酸(proline)*為α-螺旋的 破壞者 典型的二級構造 - 由Pauling與Corey提出*,Pauling因而獲得1954年 諾貝爾化學獎 - α-螺旋與β-褶片*的結構特性 特定蛋白質中特定二級構造的含量* - β-轉折*的結構特性. 側鏈為疏水, 側鏈為疏水, 非極性. 側鏈為芳香族, 側鏈為芳香族, 疏水 側鏈帶負電荷 側鏈帶正電荷 側鏈不帶電但具極性. 組成蛋白質的20 種胺基酸構造 組成蛋白質的20種胺基酸構造. 14.

(15) α-螺旋構造(1) 螺旋構造(1). 胺基酸的側鏈 Linus Pauling (1901(1901-1994) - 1954年諾貝爾化學獎 1954年諾貝爾化學獎. Hydrogen bond. Robert Corey (1897(1897-1971) Hydrogen bond. α-螺旋構造(2) 螺旋構造(2). R group (側鏈 (側鏈)) R group ↓. ↙. 15.

(16) 逆向平行. β-褶片構造. 同向平行. R group (側鏈 (側鏈)). ↑. ↓. 16.

(17) β-轉折構造. (較普遍) 較普遍). 超二級構造(supersecondary structures) - 結構模組(motif, fold)或結構區域*,為二級構造 的組合 - 功能區域(domain)*,為具功能性的特定二級構造 的組合 Random coil or unorganized structures - “Random coil is not random!”. 17.

(18) 蛋白質中常見的摺疊模式. 結構模組 結構模組 → 功能區域. 兔的pyruvate 兔的pyruvate kinase的特定功能區域是由數個結構模組組成的 kinase的特定功能區域是由數個結構模組組成的. 球形蛋白具有緊密的構形 - 以人類血清白蛋白(human 以人類血清白蛋白(human serum albumin)為例 albumin)為例 Mr 64.500 kDa, residues in a single chain kDa, 585胺基酸 585胺基酸residues. 18.

(19) 3. 三級結構 指已具有二級構造的多肽,因胺基酸側鏈間的交互 作用而折疊扭轉成特有的緊密立體形狀 4. 四級結構 當具有生物功能的蛋白質*是由兩條或兩條以上的多肽 (次單元)組成時,次單元在立體空間的相互關係 形成四級構造的優點 - 增加結構安定性,遺傳物質能有效利用,形成功能或 活性部位,調節與協同效應. 19.

(20) 四級結構或超分子結構的優點. 5. 超分子結構(supermolecular organization) 細胞內不同的蛋白質(具有三級或四級構造)因行使 功能而產生交互作用的實際狀態 例子 - DNA複製體(replisome) - 蛋白質降解體(proteasome) - 轉錄體(transcriptosome) - 凋亡體(apoptosome) - 發炎體(inflammasome) - ATP合成體(ATP synthasome) - 呼吸體(respirasome). 20.

(21) 6. 維持蛋白質結構的作用力 共價鍵結如一級構造中的肽鍵與三級結構中的雙硫鍵* 非共價作用力如二,三,四級結構中的氫鍵,離子鍵, 凡得瓦爾力與疏水作用 - 皆為弱的作用力,因此大部份蛋白質只能在溫和的 環境(溫度, pH值)中發揮功能 7. 蛋白質的變性(denaturation) 蛋白質因維持結構的作用力受破壞而失去特有的結構 與活性 - 變性通常是蛋白質特有的形狀遭受破壞,因此蛋白質 變性有時是可逆的. 牛胰臟分泌的RNase 由124個胺基酸組成 牛胰臟分泌的RNase由 124個胺基酸組成,, 含有4 含有4個雙硫鍵. 雙硫鍵. 雙硫鍵的形成. 21.

(22) 8. 蛋白質結構與功能的密切關係 由Anfinsen等人以核糖核酸水解酶(RNase)所進行的 一系列實驗證明 - RNase*含124個胺基酸,有4個雙硫鍵,當以還原劑 及尿素處理RNase*時,雙硫鍵被還原,非共價作用力 被破壞 - RNase發生“變性” ,喪失水解RNA的活性 - 當以適當條件移除還原劑及尿素時,RNase的活性 可完全恢復,而重新折疊的RNase,所測得的物理 或化學特性均和原來酵素相同. Anfinsen等人的實驗 Anfinsen等人的實驗. 雙硫鍵的正確配對. 22.

(23) Anfinsen等人的實驗中 - 所有的處理皆不會破壞連接各胺基酸之間的共價鍵 結,即蛋白質的一級構造不受影響 - 因此提出“蛋白質的一級構造決定蛋白質特定的立體 構形”與“蛋白質的功能與其特有的構形有關”的論點 - 確立蛋白質結構與功能的關係,促進以生物分子為 基礎探討演化過程的研究 - Anfinsen等人獲得1972年諾貝爾化學獎. 9. 蛋白質立體構造的摺疊 Anfinsen等人的研究結果提出“All of the information necessary for folding the peptide chain into its “native” structure is contained in the amino acid sequence of the peptide” 蛋白質特有構形的形成* - Levinthal’s paradox (1968年) 假設一蛋白質含有100胺基酸,若每一個胺基酸只 有兩種可能的空間分佈情形,則此蛋白質的構形有 2100個可能性,如測試每一種可能性需10-13秒, 則需4 × 109年,但生理狀況(in vivo)下卻只需~ 5秒. 23.

(24) 自然構形, 自然構形, 原始構形 (native conformation) - dynamic, flexible. 蛋白質的摺疊. 胰凝乳蛋白酶與甘胺酸 胰凝乳蛋白酶與甘胺酸. 摺疊的過程 - 以overall energy minimum為準則* - 摺疊的驅動力(driving force)為亂度(entropy)因素 疏水的胺基酸側鏈分佈 - 漏斗模式(funnel model)* 漏斗為energy landscape (能量圖景,位能鳥瞰) 二級構造 → 功能區域. 24.

(25) 模擬的蛋白質摺疊過程 - 蛋白質villin 片段(36 (36個 個胺基酸) 蛋白質villin片段 胺基酸), 存於小腸的 microvillin lining, 模擬的摺疊過程耗時1 模擬的摺疊過程耗時1 msec. 漏斗模式. 疏水效應. 蛋白質摺疊的油滴模式. 25.

(26) 10. 參與摺疊的蛋白質 蛋白質在合成後,並非皆能及時自發摺疊成正確的 構形,其快速正確的摺疊需許多其他蛋白質的協助 分子伴護蛋白(molecular chaperones) - 伴隨蛋白或伴從蛋白(chaperones, 被動角色)* 會與未摺疊或部份摺疊的蛋白質接合,以避免未摺疊 或部份摺疊的蛋白質黏集而被降解 in vivo 的實驗顯示伴隨蛋白是蛋白質正確摺疊及形成 四級構造所必需,如Hsp70s (熱休克蛋白70) - 伴護蛋白(chaperonins, 主動角色)* 會直接促進蛋白質的摺疊,如Hsp60. 伴隨蛋白協助的摺疊. 伴護蛋白協助的摺疊. 26.

(27) 其他蛋白 - Protein disulfide isomerase (PDI) 雙硫鍵的正確配對 - Peptide proyl cis-trans isomerase (PPI) 脯胺酸. 多肽中含Pro 時, 其肽鍵具有trans 與cis異構形式 多肽中含Pro時 其肽鍵具有trans與 cis異構形式 - Pro為 5 ~ 30% , 其他胺基酸則少於0.1% Pro為cis異構形式的機率為 cis異構形式的機率為5 其他胺基酸則少於0.1%. 11. 與蛋白質摺疊缺失有關的疾病 普昂疾病(the prion disease) - Prion (proteinaceous infectious only) Prusiner獲得1997年諾貝爾生醫獎 纖維囊腫(cystic fibrosis) - Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR),因胺基酸(F508)刪除突變,導致摺疊過程的 中間產物無法自伴隨蛋白脫離,CFTR無法抵達其 最終作用場所 肺氣腫(emphysema) - α1-Antitrypsin 抑制彈力蛋白酶(elastase),彈力蛋白. 27.

(28) Stained section of cerebral cortex from autopsy of a patient with CC-J disease shows spongiform degeneration. 正常. 異常. The propagation of infectious prion protein Occurs via conversion of normal prion protein (left) to a diseasedisease-causing form (right). 人類PrP 蛋白單體((左)與雙聚體( 人類PrP蛋白單體 與雙聚體(右)形式. 《蛋白質結構與功能關係的研究實例》 1. 肌紅蛋白與血紅素 肌紅蛋白(myoglobin, Mb) - 負責肌肉細胞內O2的輸送與儲存,屬功能性蛋白質, 含153個胺基酸與血基質* - 肌紅蛋白的結構* 由研判X光晶體繞射結果得知,整個分子為球狀, 摺疊十分緊密,其中75%為α-螺旋構造,血基質約 位於分子中心並以所含的Fe+2與O2接合進行輸送及 儲存O2,Kendrew因解出結構的貢獻獲得1962年 諾貝爾化學獎. 28.

(29) 肌紅蛋白( 肌紅蛋白(抹香鯨) 抹香鯨)的三級構造. 血基質, 血基質, 鐵紫素 (heme) heme). Perutz (左 (左, 血紅素) 血紅素)與Kendrew(右 Kendrew(右, 肌紅蛋白) 肌紅蛋白) - 同獲1962 年諾貝爾化學獎 同獲1962年諾貝爾化學獎. 血紅素(hemoglobin, Hb) - 在肺與組織細胞間擔任O2的輸送* - 具有四級構造* 由兩個α次單元與兩個β次單元構成一個四面體的 立體排列,組成的α次單元(含141個胺基酸)與 β次單元(含146個胺基酸)的分子中心,分別含血基質 可與O2接合, Perutz因解出構造而與Kendrew同獲 諾貝爾獎 α次單元與β次單元的結構雖非完全相同但極類似, 且其個別的立體構造也均與肌紅蛋白類似*,顯示 高度相似的立體結構與其同為攜氧蛋白的功能有關. 29.

(30) 肌紅蛋白與血紅素β 肌紅蛋白與血紅素β次單元的三級結構比較. 鯨魚肌紅蛋白與人類血紅素α 鯨魚肌紅蛋白與人類血紅素α次單元與β 次單元與β次單元的胺基酸序列比對 次單元的胺基酸序列比對. 30.

(31) 血紅素具有四級構造對其功能的影響 - 在不同的O2濃度(O2分壓, pO2)下,O2和血紅素的接合 關係呈現“S”型曲線*,而O2和肌紅蛋白間的接合關係 則呈現“雙曲線”型關係 - 血紅素的4個次單元與O2的接合具有正的協同作用, 即O2與任何一個次單元的接合會加速O2與其他次單元 的接合. 雙曲線 “S”型曲線. _________. 31.

(32) - 波爾效應 血紅素與O2的接合亦受到pO2與pH值的影響 pO2愈高,pH值愈高,血紅素被O2飽和(接合)的程度 愈高 在肺部,pO2與pH值均高,大部分血紅素均被O2飽和 在組織,pO2低且pH值因代謝產物及CO2而降低時, 血紅素與O2的接合減弱,因而可因應組織的需求而 釋出O2供利用 相同的條件下,肌紅蛋白不具有四級構造,其對O2 的接合不具協同作用,也不受pO2或pH值的影響. →. pH值對血紅素與 O2接合的影響 pH值對血紅素與O. 32.

(33) - 血紅素與O2的接合另可受2,3-bisphosphoglycerate (2,3-BPG)的調控,對胎兒的發育極為重要 成人的血紅素(HbA, α2β2)分子,2,3-BPG可接合至 β次單元,使得成人血紅素對O2的親和性較低 胎兒血紅素(HbF, α2γ2)分子,無β次單元可與 2,3-BPG可接合,不受2,3-BPG影響,對O2的親和性 較成人血紅素高. 正常人類血液中BPG 的濃度 正常人類血液中BPG的濃度 - ~ 5 mM at sea level - ~ 8 mM at high altitude. →. →. 相同pH 值與2,3 2,3--BPG濃度下 相同pH值與 BPG濃度下,, HbA與 HbA與HbF對氧分壓的飽和曲線 HbF對氧分壓的飽和曲線 2,3O2接合的影響 2,3-BPG對血紅素與 BPG對血紅素與O. 33.

(34) T構形. Positively charged groups ∣ ∣ ↓. BPG與deoxy血紅素的接合 Binding pocket disappears. R構形. 2. 與血紅素相關的疾病 鐮形細胞貧血症(sickle-cell anemia)* - 由Pauling於1949年提出的“molecular disease” - Sickle-cell hemoglobin (HbS),其β次單元的Glu6 (側鏈帶負電)置換為Val6 (側鏈為疏水) 地中海型貧血症(thalassemias) - α-thalassemias (甲型, β4或γ4),其α次單元有缺失 - β-thalassemias (乙型),其β次單元有缺失. 34.

(35) 表面疏水的區塊. 溶解度差. 正常與鐮形細胞貧血症患者的紅血球 正常與鐮形細胞貧血症患者的紅血球. 鐮形細胞貧血症患者紅血球內的血紅素. 3. 角蛋白,膠原蛋白與絲纖維蛋白 均為扮演結構功能的纖維狀蛋白,通常由規則性的 二級結構組合形成特殊的構造 - 具有強韌與穩定的特性,符合擔任保護與支撐的功能 角蛋白 - 由兩股α-螺旋相互纏繞形成coiled coils*,其一級 結構具有(a-b-c-d-e-f-g)n的序列,其中a與d為非極性 胺基酸 - 頭髮的構造* 共價的cross-links - 燙髮(permanent wave)的原理與所含的半胱胺酸 (具有-SH官能基)有關. 35.

(36) 頭髮的構造. 頭髮的橫切面. 燙髮的生化基礎. 膠原蛋白 - 基本構造為特殊的三股螺旋狀構造* - 甘胺酸(Gly)含量佔1/3且富含脯胺酸(Pro) - 一級構造具有Gly-X-Y序列,其中X為Pro,Y為Pro 或Hyp (Gly佔35%,Pro或Hyp佔21%) Hyp為Pro經轉譯後修飾作用加上-OH - 修飾的酵素活性仰賴維生素C (抗壞血酸),維生素C 嚴重缺乏會導致壞血病(scurvy) Ehlers-Danlos syndrome - 甘胺酸置換成側鏈較大的胺基酸,三股螺旋狀構造 不穩定,與習慣性脫臼有關. 36.

(37) 甘胺酸. ↙. 膠原蛋白纖維的結構. 膠原蛋白的結構. 絲纖維蛋白 - 為β-褶片構造,層層相疊* - 富含甘胺酸與甲胺酸(Ala),且每兩個胺基酸就有 一個甘胺酸出現 纖維狀蛋白因具有特殊的一級結構(特定的胺基酸組成 與排列)而形成特殊的結構,再次驗證Anfinsen等人對 蛋白質結構的形成與結構功能關係的論點. 37.

(38) 絲的構造. 絲纖維蛋白為層層β 絲纖維蛋白為層層β-褶片相疊的 構造, 與甲胺酸Ala Ala 構造, 富含甘胺酸Gly 富含甘胺酸Gly與甲胺酸. 《蛋白質構形的變化》 1. 蛋白質的構形變化 蛋白質分子為dynamic 以球狀蛋白為例 - 分子振動,如胺基酸側鏈的擺動*等微小的變化, 有如“breathe”般 - 構形變化(conformational change)*,較顯著,與 蛋白質的活性有關 2. 蛋白質構形變化的例子 酵素與受質,血紅素與O2 肌肉收縮時肌凝蛋白與肌動蛋白,Ca+2的角色. 38.

(39) 3. 氧的接合蛋白 肌紅蛋白(Mb)與血紅素(Hb) - O2的接合部位為鐵紫素或血基質(heme, Fe+2) - 血基質與O2接合的能力受蛋白質結構影響 游離的血基質,CO的接合: O2的接合 = 25,000 : 1 肌紅蛋白與血紅素*,CO的接合: O2的接合 = 200 : 1. 39.

(40) 血基質. 肌紅蛋白. Protoporphyrin IX. 肌紅蛋白. 游離的血基質 游離的血基質. Distal. Proximal. 血紅素中的血基質 血紅素中的血基質. 40.

(41) 肌紅蛋白與血紅素的功能受結構影響 - 生物功能* 肌紅蛋白負責O2的儲存,血紅素負責O2的輸送 - 結構* 肌紅蛋白具有三級構造,血紅素具有四級構造(α2β2) - 與O2的接合* 肌紅蛋白無協同性(雙曲線) ,血紅素具協同性 (“S”形曲線) 肌紅蛋白不受調節,血紅素受調節. ↑ ________ ↓. 41.

(42) 血紅素的構形變化* - T構形(T state, tensed或taut) 分子結構較緊縮,不接氧的形式(deoxy form), 對O2的親和力弱 - R構形(R state, relaxed) 分子結構較膨鬆,接氧的形式(oxy form), 對O2的親和力強. 不接氧. T構形. 接氧. R構形. 42.

(43) Porphyrin is slightly Puckered, heme iron protrude on His F8 side. Heme assumes a more Planar conformation, shift the position of His F8 and F helix. 血紅素接O 血紅素接O2時血基質鄰近區域構形的改變. 血紅素為異位蛋白(allosteric protein) - Allos (希臘文意為other),Stereos (希臘文意為shape) - 活性部位 血紅素接O2的部位,相當於酵素接受質的部位, 與O2的接合有協同性 - 調節部位 調節劑的接合部位 阻礙劑,如2,3-BPG、H+、CO2等 活化劑. 43.

(44) 《蛋白質結構的測定與預測》 1. 蛋白質的一級構造決定其立體構造,而蛋白質的立體 構造與其生物功能關係密切,因此研究蛋白質的功能 需了解蛋白質的一級構造 2. 蛋白質一級構造的測定 求出多肽中胺基酸的組成與排列次序 - 胺基酸的組成分析 蛋白質經酸水解*後,再利用由1972年諾貝爾化學獎 得主Stein & Moore所開發的胺基酸分析儀分析組成, 胺基酸組成可提供的資訊*. 蛋白質的酸水解. 44.

(45) 9.55%. 胺基酸的組成分析. 1.18%. 胺基酸的組成分析: 胺基酸的組成分析: Frequencies of various amino acids in proteins 數據來自超過10 萬個蛋白質的胺基酸組成 胺基酸組成,, 共約4 數據來自超過10萬個蛋白質的 共約4千萬個胺基酸( 千萬個胺基酸(the SWISSSWISSPROT protein knowledgebase) knowledgebase). 細胞色素 c: 50/104 (48% (48%)) Chymotrypsin: Chymotrypsin: 126/245 (51% (51%)) Aliphatic, Aromatic 疏水性. 45.

(46) - 胺基酸的排列順序 利用胺基酸定序儀取得,Sanger*因決定胰島素分子 的構造並提出分析蛋白質一級構造的方法,而獲得 1958年諾貝爾化學獎(Sanger因提出分析DNA序列的 方法於1980年再獲得諾貝爾化學獎) 現今,大多數蛋白質的胺基酸序列可由基因的核苷酸 序列推知,但一級構造的分析對研究蛋白質是否具有 轉譯後的修飾作用仍深具價值. 46.

(47) 牛胰島素的定序 - 耗時約10年, 使用約100克的蛋白質. Frederick Sanger (1918~) - 1958年諾貝爾化學獎(蛋白質定序) - 1980年諾貝爾化學獎(DNA定序). 蛋白質定序步驟* - 蛋白質純化 - 次單元的分離 - N端與C端胺基酸的定性 - 將多肽鏈分割成小片段 - 胺基酸自動定序 - 序列重組 - 雙硫鍵定位*. 47.

(48) 蛋白質雙硫鍵的破壞. N端胺基酸定性 FDNB. 胺基酸定序反應. PITC. 48.

(49) 專一性, 專一性, 可預測. Edman降解反應 Edman降解反應. 49.

(50) 蛋白質定序過程. 雙硫鍵的定位 - Diagonal electrophoresis (對角線電泳) 對角線電泳). 50.

(51) 其他定序方法 - 質譜分析法(mass spectrometry)* 蛋白質離子化,片段依質量電荷比分離(電場) Fenn與Tanaka同獲2002年諾貝爾化學獎 - 生物資訊學 3. 二級、三級與四級結構的研究 利用物理的方法 - 利用蛋白質分子對偏極光的轉向能力*或核磁共振* 的原理,估測二級構造中α-螺旋或β-褶片的含量 - 利用X光繞射法*研究蛋白質結晶的構造,取得 蛋白質的三級與四級結構等. 蛋白質的電噴灑質譜分析. (1) A Protein solution is dispersed into charged droplets by passage through a needle under a highhigh-voltage electric field (2) The droplets evaporate and ions enter the mass spectrometer for m/Z measurement. 51.

(52) 蛋白質的質譜分析圖譜. The spectrum generated and a computercomputer-generated transformation of the spectrum. 串聯的質譜分析. 52.

(53) CD光譜分析 CD光譜分析 Standard. γ. β α. 2D核磁共振圖譜 2D核磁共振圖譜. OneOne-dimensional NMR spectrum of a globin from a marine blood worm. 53.

(54) X光晶體繞射法. 以X光晶體繞射法研究 抹香鯨肌紅蛋白結構的過程. 4. 蛋白質結構的預測 Anfinsen等人的實驗證明“蛋白質的一級構造決定其 立體結構”,而蛋白質的立體結構又與其功能息息相關 - 如能由蛋白質的一級構造預測蛋白質的立體結構, 蛋白質體計劃的研究將大大加速 二級構造的預測 - 目前多以分析已知結構的蛋白質中,各類二級構造 所出現的胺基酸種類為準* 由Chou與Fasman於1974年提出,對每一種胺基酸 出現在各類二級構造中的相對頻率給予特定數值(如 Pα, Pβ, Pt),經計算後可預測蛋白質的二級構造, 此法經已知結構的蛋白質研究與預測結果比對驗證, 其準確性可達95%以上. 54.

(55) 特定胺基酸出現在三種常見二級結構的相對機率. 55.

(56) 三級構造的預測 - 較為複雜,目前仍仰賴計算機龐大的資料存取與計算 能力(computer-based calculation, 以energy minimum 為原則),配合進一步分析已知結構的蛋白質中不同 層級的細部構造(knowledge-based method, database),尚未能精準有效的預測結果 - 其他方法. 《蛋白質的結構與演化》 1. 分析不同蛋白質的胺基酸序列,可推斷蛋白質是否為 同源蛋白,源自同一祖先 2. 以肌紅蛋白與血紅素的研究為例 肌紅蛋白的結構與血紅素的α次單元或β次單元的 結構均非常類似,且同樣具有攜氧的功能,極可能 源自於一個共同的祖先 (一個原始的球蛋白)*. 56.

(57) 肌紅蛋白與血紅素的α 肌紅蛋白與血紅素的α次單元或β 次單元或β次單元的胺基酸序列比較. 肌紅蛋白與血紅素的α 肌紅蛋白與血紅素的α次單元及β 次單元及β次單元極可能 源自一個共同的祖先 - α次單元與β 個胺基酸中有64 64個相同 個相同 次單元與β次單元約140 次單元約140個胺基酸中有 - 肌紅蛋白與α 個胺基酸相同 肌紅蛋白與α次單元有38 次單元有38個胺基酸相同. 肌紅蛋白與血紅素的α 肌紅蛋白與血紅素的α次單元或β 次單元或β次單元的立體結構比較. 57.

(58) 3. 以細胞色素c的研究為例 比較不同來源的細胞色素c的胺基酸序列,說明蛋白質 的結構研究對建立演化關係的重要性 - 細胞色素c是粒線體電子傳遞鏈的成分,對細胞的 存活極為重要 - 分析得自麵包酵母及人類等40多種不同來源的細胞 色素c ,雖然其蛋白質一級構造不盡相同但卻有令人 訝異的相似處 細胞色素c平均含有104個胺基酸,其中有28個完全 相同*,目前已知此28個胺基酸和細胞色素c的功能 有密切的關係,只要任一個胺基酸被其他種類的 胺基酸取代時皆會影響細胞色素c的功能. 不同物種間細胞色素c 不同物種間細胞色素c胺基酸序列差異的程度比較. 58.

(59) 當比較不同物種的細胞色素c的胺基酸序列,發現不同 物種間的序列差異程度與其親緣關係有一定的比例 關係* - 如人的細胞色素c胺基酸序列與黑猩猩的完全相同, 與其他哺乳類有10個胺基酸的差異,與爬蟲類有14個 差異,與魚類、軟體動物、昆蟲與酵母或高等植物則 分別有18個、29個、31個與40個以上的差異 - 由分析細胞色素c的胺基酸序列差異所建構的“演化樹” (phylogenetic tree, 系統發生樹)與使用傳統方法所建立 的演化關係極為符合* - 衍生出利用分析特定蛋白質的胺基酸序列以建構 演化關係的分子演化學. 由分析細胞色素c 由分析細胞色素c建構的演化樹. 59.

(60) 《蛋白質與其它分子的交互作用》 1. 蛋白質表現生物功能時需與其它分子接合,此接合 通常是緊密、專一、且會形成複合體,如調控基因 表現的核酸蛋白或細胞辨識的醣蛋白與細胞膜上的 脂蛋白等 此接合雖然與細胞的繁殖、生長與發育等不同生理作用 有關,但其間的交互作用與專一辨識過程均十分相似 - 與特定蛋白質產生專一性接合的分子稱為親和基 (ligand),如酵素的受質、產物、輔因子、阻害劑 或活化劑,甚至運輸蛋白所輸送的物質等. 2. 親和基的接合作用 蛋白質與其親和基的接合通常具有專一性 - 專一性來自兩者構造的互補與兩者接合後可產生 新的安定作用力 蛋白質與親和基的接合多經由非共價的作用力,為一 可逆的過程 每個蛋白質與親和基的接合可發生在分子內的一個或 多個部位 - 多個部位中,與同一種親和基接合的能力可能相同 或不同,因此可產生接合協同性,此種關係稱為 同質性效應,如血紅素與O2的接合. 60.

(61) 一個蛋白質分子內也可有不同種類的親和基接合部位 - 不同親和基接合部位在親和基接合時會有相互溝通 (cross-talk)的特性,此種關係稱為異質性效應,如 血紅素與O2的接合受2,3-BPG與波爾效應的影響. 3. 異位效應 (allostery) 蛋白質的不同部位之間的相互影響 - 異位效應為具有四級結構的蛋白質所特有 - 具有四級結構的蛋白質含有不同的次單元 催化或活性次單元,是受質或反應物接合的部位 調節次單元,是調節物接合的部位 - 當兩種不同親和基接合部位因親和基接合而引發構形 改變,進而彼此溝通,血紅素攜氧特性與影響其攜氧 能力的因子研究為此效應的最佳例子. 61.

(62) 《蛋白質活性的調節》 1. 影響蛋白質活性的因子除了溫度、pH值、受質、 輔因子或調節劑濃度等外,尚有三個較為重要的機制 2. 切除活化作用* 如消化酵素、凝血因子與一些激素 - 通常合成時是不具活性的先質(precursors),當需要 時會因一小段肽鏈被切除而具有活性 切除活化作用為一不可逆的調節方法. 胰蛋白酶. 腸道生肽脢. 胰凝乳脢原的切除活化. 62.

(63) 血液凝固反應. B型血友病. A型血友病. 凝血酶原. 凝血酶 血纖維蛋白. 血纖維蛋白原. 3. 異位調節作用 為多種代謝路徑中調節酵素或異位酵素的活性調控 方式 - 如代謝路徑的終產物之回饋抑制調控* - 當調節劑與蛋白質的調節部位接合後,引發該部位 的構型發生變化,此變化因四級結構中不同次單元 的相互接觸而傳達到催化部位,因而改變催化部位 的特性,使蛋白質的活性改變* 以酵素為例,較普遍的是改變酵素對受質的親和力, 少數是改變酵素的催化效率. 63.

(64) 阻害劑. 異白胺酸合成的回饋抑制調控. 調節部位. 催化部位 活化劑 阻害劑. 異位蛋白與調節劑接合後改變蛋白質( 異位蛋白與調節劑接合後改變蛋白質(酵素) 酵素)的活性. 64.

(65) 4. 共價修飾作用 肝糖代謝的調控為最佳例子* 蛋白質因特定胺基酸接上特定的化學基團後而改變其 活性,此修飾作用屬共價鍵結的形成,因此活性變化 之間需其他酵素的參與* - 此機制通常是細胞代謝受激素調節的方式,有訊號 放大的效果. 肝糖磷解酶. 肝糖合成酶. 65.

(66) Amplification of signal. 磷酸化. 磷酸化. 藉由蛋白質激酶與蛋白質磷酸水解酶調控蛋白質活性 藉由蛋白質激酶與蛋白質磷酸水解酶調控蛋白質活性. 5. 其他機制 與其他蛋白質的接合作用 - 如蛋白質激酶A (protein kinase A, PKA)*與調節 次單元的接合 - 受Ca2+調控的蛋白質或酵素,如調鈣蛋白(calmodulin) 蛋白質的分佈(compartmentation或localization) - 如葡萄糖運輸蛋白受胰島素的影響. 66.

(67) 蛋白質激酶A 蛋白質激酶A的活化. 《蛋白質的新陳代謝》 1. 細胞內蛋白質的新陳代謝(分解) 蛋白質雖有驚人的特性,卻非“長生不老”,蛋白質隨著 “年紀”的增長,會累積多種發生的化學反應而造成生物 活性的喪失 - 如胺基酸支鏈的硫原子氧化,天門冬醯胺酸與麩醯 胺酸的側鏈去醯胺作用,碳的異構化作用,胺基與 葡萄糖間非酵素的反應(最普遍)等 - 不正常或老化的蛋白質需持續被分解移除. 67.

(68) 2. 細胞內特定蛋白質的量維持動態平衡的狀態 蛋白質持續地被製造與被分解 - 蛋白質持續地被分解除了是一般的新陳代謝代,也可 移除外來的蛋白質及對環境的調適(如因應養份不足與 不同發育階段的需求等) 3. 影響蛋白質分解速率的因子 蛋白質分解(水解)的過程 - 需要能量,具有一級反應的動力特性,被分解的 蛋白質分子是隨機選取 正常細胞內不同的蛋白質有不同的分解速率 - 蛋白質的半生期(half-life)較短者,細胞內分解的速率 較快. - 半生期較短的蛋白質通常分子量較大,具有酸性pI 值,在細胞的新陳代謝中擔任關鍵的調節角色*,在 試管內對熱或蛋白酶的實驗處理較敏感 近年的研究發現蛋白質N端的胺基酸種類及特定序列 (PEST)的數目與蛋白質的半生期有密切關係 - N端的胺基酸種類 穩定(半生期>20小時)者為Met、Ser、Gly、Ala、 Thr、 Val,不穩定(半生期7~30分鐘)者為Arg、Lys、 Asp、Leu、Phe,高度不穩定(半生期2~3分鐘)者為 Ile、Glu、Pro、Tyr、Gln - PEST (Pro、Glu、Ser、Thr)序列. 68.

(69) 哺乳類細胞內蛋白質的半生期 酵素或蛋白質種類. 半生期(hr) 半生期(hr). c-myc, c-fos, p53 oncogene products RNA polymerase I Tyrosine aminotransferase Deoxythymine kinase Phosphoenolpyruvate carboxykinase Aldolase Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Lactate dehydrogenase (isozyme 5) Cytochrome c. 0.5 1.3 2.0 2.6 5.0 118 130 144 150. 4. 蛋白質降解的機制 細胞內蛋白質的降解主要經由兩個途徑 - 溶體或溶酶體系統,負責代謝外來或不正常的蛋白質 - 細胞液的蛋白質降解體(proteasome)系統,負責代謝 一般正常蛋白質 蛋白質降解體媒介的蛋白質水解(proteasomemediated proteolysis) - Ciechanover, Hershko與Rose因其貢獻同獲2004年 諾貝爾化學獎 - 泛素(ubiquitin)標記的蛋白質(ubiqutination)被26S 蛋白質降解體*辨識並分解,需ATP及多種蛋白質 (酵素E1, E2, E3)參與蛋白質的降解. 69.

(70) 26S蛋白質降解體 的構造 26S蛋白質降解體的構造. 蛋白質降解體系統的蛋白質水解. 70.

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數據

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參考文獻

相關主題 : 蛋白質概論