便利的醣質反應策略製備含b-苷露醣之寡醣體及芳香族立體選擇醣質反應與其應用性

國

立

交

通

大

學

應用化學研究所

博

士

論

文

便利的醣質反應策略製備含β-苷露醣之寡醣體及

芳香族立體選擇醣質反應與其應用性

Convenient Glycosylation Strategy for Preparation of

Oligosaccharides with β-Mannosidic bonds & Stereoselective Aryl

Glycosylations and Its Applications Thereof

研 究 生：張世聖 撰

指導教授：蒙國光教授、李耀坤教授

研 究 生：張世聖 撰

Graduate Student：Shih-Sheng Chang 指導教授：蒙國光教授、李耀坤教授

Thesis advisor：Assist. Prof. Kowk-Kong Tony Mong, Prof. Yaw-Kuen Li

國 立 交 通 大 學 應 用 化 學 研 究 所

博 士 論 文

A Thesis

Submitted to Department of Applied Chemistry College of Science

National Chiao Tung University, Taiwan in partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of

Doctor of Science In Applied Chemistry June 2009

Hsin-chu, Taiwan, Republic of China

中 華 民 國 九 十 八 年 九月

便利的醣質反應策略製備含β-苷露醣之寡醣體及

芳香族立體選擇醣質反應與其應用性

Convenient Glycosylation Strategy for Preparation of

Oligosaccharides with β-Mannosidic bonds & Stereoselective

摘 要

本論文主要分為兩大部份: 1. 本論文第一部份係運用逆加成程序進行一有效力 orthogonal β-苷 露醣質反應。此一新的醣質化反應合成程序，運用已研發有效力 之階段式合成策略，以快速生合成出 N-linked glycproteins 醣蛋白 之核心三醣體 Man-β(1,4)-GlcNAc-β(1,4)-GlcNAc 與沙門氏菌細胞 囊膜之單位三醣體 Man-β(1,4)-Rha-α(1,3)-Gal。 2. 第二部份運用一簡便的三氯乙醯氨絡化物乙醯化基醣予體進行實 用且有效力的控制α-立體選擇性 aromatic 醣質反應。此合成方法 特別對三氯乙醯氨絡化物L-岩藻醣予體與 2-azido-2-deoxy-D-半乳 醣予體更有效獲得主要α-立體選擇性產物，此一合成方法的通用 性 已 加 以 論 證 : (1) 已 生 合 成 獲 得 立 體 專 一 性 化 合 物 4-methylumbelliferyl α-T-antigen 加以論證、(2)有效率的合成出 L -岩藻醣基質小分子庫、(3)使用 L-岩藻醣基質分子庫研究解釋 L -岩藻醣酶的反應機構。

Abstract

The first part of thesis reports the first effective orthogonal β-mannosylation method by adopting an optimized inverse-addition procedure. This new glycosylation procedure enables the development of sequential strategy for synthesis of trisaccharide core of N-linked glycoproteins, Man-β(1,4)-GlcNAc-β(1,4)-GlcNAc and trisaccharide unit of bacterial capsule in Salmonella bacteria, Man-β(1,4)-Rha-α(1,3)-Gal.

The second part of thesis describes a practical and efficient α-selective aromatic glycosylation. The method employs easily available per-O-acetyl glycopyranosyl imidate donors and tedious protecting group manipulations are not required. It is particularly effective for

L-fucopyranosyl and 2-azido-2-deoxy-D-galatosamine donors, glycosylations with which produce exclusive α-selectivity. Practical utilities of this method were demonstrated in: (1) stereoselective synthesis of biological relevant 4-methylumbelliferyl α-T-antigen; (2) efficient synthesis of small libraries of aryl α-L-fucopyranosides and their subsequent use for elucidation of reaction mechanisms of human

謝 誌

博士五年的學習生涯，隨著口試合格與論文完成終於告一段落， 首先要感謝吾師 蒙國光 教授與 李耀坤教授在這五年裏對學生的細 心教導與栽培，一路教導叮嚀學生學習實驗的技巧與專業知識的吸 收，讓學生得已順利穫得博士學位。另外，感謝林俊成 教授、吳東 昆 教授於課業上細心教導學生，讓學生在準備專業領域論文之外學 習到更多的生化與有機合成化學領域的知識。 感謝林俊成 教授、林俊宏 教授、李耀坤 教授與吳東昆 教授於 百忙之中撥空擔任學生博士論文口試委員，由於老師們對論文內容的 建議與指導，讓學生所寫作的論文更具完整專業性，感謝交通大學、 中央研究院、國科會於經費與儀器上的資助。 感謝我的家人給我的鼓勵與關懷，特別感謝吾妻莞勳，總是在背 後支持著我，謝謝妳一路陪我及給我妳全部的愛。 感謝摯愛的父、母親，張均宏先生、黃婞媚女士對我的栽培與養 育在此將本論文完成的所有成就獻給你們。

簡寫表

Ac acetyl Ac2O acetic anhydride Bn benzyl Bz Cp benzoyl cyclopentadienyl DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene DMF N,N-dimethylformamide DMAP DMTP 4-(N,N-dimethylamino)pyridine dimethyl thiophenyl DTBS DTBMP di-(tert-butyl)silylidene acetal di-(tert-butyl) methyl pyridine

Et ethyl Gal Glc HIV galactose Glucose

Human immunodeficiency virus Man mAb mannose mono antibodies Me methyl MS molecular sieve NIS N-iodosuccinimide Ph phenyl

Phth phthaloyl Pyr Piv Pr PMB Ser TBDMS pyridine pivaloyl n-propyl p-methoxy benzyl Serine (tert-butyl)-dimethyl-silylidene acetal TMSOTf STol trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate Thiocresol

TsOH p-toluenesulfonic acid H2O

TES triethylsilane TFA Tf Tf2O trifluoroacetic acid Trifluoromethanesulfonate Trifluoromethanesulfonate anhydride THF tetrahydrofuran

TBAB tetra-n-butylammonium bromide

Thr TTBP Troc Threonine tri-(tert-butyl) pyridine 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl

目 錄

摘 要 I Abstract II 謝 誌 III 簡寫表 IV-V 目 錄 VI-X 第一部份 便利的醣質反應策略製備含β-苷露醣之寡醣體 1 第一章 緒 論 1 1.1 _{前 言} 1 1.2 _研究動機 2 1.3 _{β-鍵結-苷露醣之寡醣體蛋白脂質簡介} 3-7 1.4 _{一鍋化之寡醣體醣質化反應合成簡介} 7-15 1.5 _{β-鍵結-苷露醣之離去官能基合成應用介紹} 15-21 第二章 結果與討論 22 2.1 _{一鍋化醣質反應合成核心三醣體之探討} 22 2.1.1 Sufoxide、thiophenyl 醣體離去基進行一鍋化三醣體 醣質合成反應之運用 22-33 2.1.2 Trichloroacetimidate、2,6-dimethylthiophenyl 醣體離 去基進行一鍋化三醣體醣質合成反應之運用 33-36 2.1.3 運用速率逆加成程序法控制β-苷露醣醣質鍵結之 寡醣體一鍋化合成與應用 37-43 2.2 _{結 論} 44-45 第三章 實驗部份 46 3.1 _一般實驗 46

3.2 _實驗 47 3.2.1 _{一般實驗步驟} 47 3.2.1.1 使用DPSO 進行β-Mannoslyation 47 3.2.1.2 運用 sulfoxides 醣予體額外加入 DPSO 進行一鍋化 三醣體反應 48 3.2.1.3 運用trichloroacetimidate 醣予體使用劑量 TMSOTf 進行β-Mannoslyation 49 3.2.1.4 運用mannosyl acetimidate 醣予體進行階段式醣質 反應合成三醣體 50 3.2.1.5 1,2-trans β-selective 低濃度醣質反應 51

3.2.1.6 運用inverse-addition procedure 製備β-mannosidic bonds 51-52 3.2.1.7 運用階段式醣質反應策略製備含β-mannosidic bonds 之寡醣體 52-53 3.2.1.8 3.2.2.2 去乙縮醛反應步驟 製備單醣體基材反應步驟 53 53-78 第二部份 芳香族立體選擇醣質反應與其應用性 第四章 緒 論 79 4.1 _{前 言} 79 4.1.1 α-L-岩藻醣與 α-L-岩藻醣苷水解酶之重要性簡介 79-80 4.2 _研究動機 80-82 4.3 α-L-岩藻醣苷水解酶之水解反應催化機制簡介 82-84 4.4 _{α-L-岩藻醣及其醣基質之醣質化反應合成簡介} 84-91 第五章 結果與討論 92 5.1 _{制備α-L-岩藻醣基質醣質合成反應之探討} 92-95

5.3 _{4-MU α-T-antigen 之醣質合成反應與應用} 97-98 5.4 _{反應機構推論} 99-100 5.5 _{結 論} 101 第六章 實驗部份 102 6.1 _實驗 102 6.1.1 _一般實驗 102 6.1.2 _{一般實驗步驟} 103-104

6.2 Phenyl 2,3,4-O-triacetyl-L-fucopyranoside 27, 38−44 104-108

6.3 p-Nitrophenyl per-O-acetyl-glycopyranosides 51, 54−57 109-112 6.4 Methylumbelliferyl 3,4,6-tri-O-acetyl-2-azido-2- deoxy-α-D-galactopyranoside 58 112 6.5 4-Methylumbelliferyl 2-azido-4,6-O-benzylidene-2- deoxy-α-D-galactopyranoside 59 113 6.6 4-Methylumbelliferyl 2-azido-4,6-di-O-benzylidene -2-deoxy-3-(2’,3’,4’,6’-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyr anosyl)-α-D-galactopyranoside 60 114

6.7 4-Methylumbelliferyl (4-MU) 2-acetamido-2-deoxy -3-(β-D-galactopyranosyl)-α-D-galactopyranoside 24 115-1116 參考文獻 117-125 附 錄 126-227 圖表流程目錄 圖一 β-鍵結-苷露醣之寡醣體脂質結構 1 圖二 一鍋化 N-linked glycan 三醣體醣質化反應 3

圖三 Human immunodeficiency virus 6

圖五 Sulfoxide β-鍵結苷露醣體醣質之 反應機構 26 圖六 DPSO β-鍵結苷露醣體醣質之反應機構 26 圖七 防止醣體配位基轉移之反應機構 27 圖八 Globo-H、KH-1 醣類抗原 80 圖九 2-取代基芳香醇化合物分子間氫鍵作用力 95 表一 Crich β-苷露醣醣質反應合成 16 表二 Schmidt β-苷露醣醣質反應合成 17 表三 Seeberger β-苷露醣醣質反應合成 20 表四 Kim β-苷露醣醣質反應合成 21 表五 β-鍵結苷露醣體醣質反應合成運用 24 表六 Sulfoxide agent 之 β-鍵結苷露醣體醣質反應 合成運用 25 表七 路易士酸量控制β-苷露醣鍵結主要產物之 運用 34 表八 速率逆加成程序法控制β-苷露雙醣體醣質 鍵結 37 表九 速率逆加成程序法控制β-苷露雙醣體醣質 鍵結 38 表十 PNP 與 fucopyranosyl imidate 26 醣質合成反 應條件 93

表十一 制備 aryl α-L-fucopyranosides substrates 94

表十二 PNP 與 per-O-acetyl glycosyl imidates 醣質 合成反應

96

流程一 一鍋化高苷露寡醣醣質反應合成 5

流程二 Ag-silicate 五醣體醣質化反應合成 7

流程四 策略 A 一鍋化之反應活性選擇醣質化反 應合成 10 流程五 一鍋化之寡醣體醣質化反應合成策略 B 11 流程六 策略 B 一鍋化之幾何性醣質化反應合成 12 流程七 一鍋化之寡醣體醣質化反應合成策略 C 13 流程八 策略 C 一鍋化之階段性醣質化反應合成 14 流程九 Schmidt 逆加成醣質合成反應機構 18 流程十 Ito β-苷露醣醣質反應合成 19 流程十一 Kim β-苷露醣醣質合成反應機構 21 流程十二 一鍋化醣體之 HPLC-UV 分析數據 28 流程十三 一鍋化醣體之 HPLC-UV 分析數據 29 流程十四 一鍋化三醣體核心結構合成 31 流程十五 一鍋化三醣體結構合成 32 流程十六 DMTP 硫化物離去基防止醣體配位基 轉移 33 流程十七 TMSOTf 酸量控制之一鍋化三醣體醣 質反應合成運用 35 流程十八 TMSOTf 酸量控制之一鍋化三醣體醣 質反應合成運用 36 流程十九 控制速率逆加成程序法之一鍋化三醣 體醣質反應合成運用 39 流程二十 控制速率逆加成程序法之雙醣體醣質 反應合成 40 流程二十一 控制速率逆加成程序法之一鍋化三 醣體醣質反應合成應用 41 流程二十二 速率逆加成-苷露雙醣體合成反應機 構 42

流程二十三 α-L-岩藻醣基質之醣質化反應合成與 應用 82 流程二十四 α-L-岩藻醣苷水解酶反應機制 83 流程二十五 乙醯保護修飾 α-L-岩藻醣基質之醣 質化反應 84 流程二十六 α-L-岩藻醣及其醣基質之 Koenigs-Knorr 醣質化反應 85 流程二十七 α-L-岩藻醣及其醣基質之 Koenigs-Knorr 醣質化反應 86 流程二十八 Koenigs-Knorr 名反應之 1,2 逆式醣質 化反應機制 87 流程二十九 鹵化醣予體之 1,2-順式醣質化反應機 制 88 流程三十 α-L-岩藻醣及其醣基質之硫化物醣予體 醣質化反應 89 流程三十一 硫化物醣予體之醣質化反應機制 90 流程三十二 α-L-岩藻醣之三氯乙醯氨絡化物醣予 體醣質化反應 91 流程三十三 制備 per-O-acetyl L-fucopyranosyl imidate 26 92 流程三十四 4-MU α-T-antigen 之醣質合成反應 ₉₈ 流程三十五 α-selective aromatic 醣質合成反應機 構推論 100

第一部份 便利的醣質反應策略製備含β-苷露醣之寡醣體

第一章 緒論

1.1 前言

近 代 以 有 機 合 成 化 學 的 方 式 ， 生 合 成 出 自 然 界 中 寡 醣 體 (oligosaccharides)的技術已經發展成熟，它是一件艱辛又精細的工 作 。 除 了 要 製 備 出 多 種 化 學 合 成 路 徑 繁 雜 冗 長 的 單 醣 體 基 材 (monosaccharide building blocks)之外，還需要有效控制在醣體間醣質 化反應中立體化學與位向化學(stereo- and regio-selective)的選擇性。 在現今已開發的眾多寡醣體有機化學合成中，仍然缺乏一共通適用而 有效率的醣質化反應合成技術，來應用於自然界中所有種類的寡醣體 合 成 。[1]而 含 有β- 鍵 結 - 苷 露 醣 (β-mannosidic bond containing oligosaccharides)之寡醣體(圖一)合成就是一很好的例子。 Manα1-2Manα1 Manα1 Manα1 6 3 6 _{Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn} 3 Manα1-2Manα1-2Manα1

High mannose type

O HO OH O HO OH NHAc O O HOAcHN OH O O HO HO OH O OH O HO HO OH OH O Pentasacchride core 圖一、 β-鍵結-苷露醣之寡醣體脂質結構

1.2 研究動機

直至目前為止，以有機化學合成技術生合成出含β-鍵結-苷露醣之 寡醣體，所需要克服的難題有以下幾點﹕繁雜冗長的單醣體基材合 成、醣體間醣質化反應立體與位向的控制困難、醣質化逐步反應的純 化不易(glycosylation of stepwise)、最終寡醣體合成產物之去保護基 (deprotection)與水解寡醣體產物純化上困難、雙醣與雙醣體以上之多 醣體鑑定難度。[2]嘗試以一鍋化醣質反應法，解決所面臨的各種問 題、將各醣質化反應條件最優化與縮短製備所需時間，為本主題研究 主軸。 本主題主要之研究設計方向(圖二)，係以寡醣體中具β-鍵結的苷 露醣與 N-乙醯葡萄醣胺(N-acetamido glucosamine)之核心三醣體 (N-linked glycan trisaccharide core)為合成標的物，預先將各單醣體上 -OH 官能基各別修飾成不同種類的保護官能基，以便獲得三醣體後所 需進行的位向選擇性控制，再將各醣體 1-OH 位置修飾成化學活性不 同的離去官能基(leaving group)，利用各醣體間離去基反應活性不同 的特性，設計以一鍋化反應的方式來取代困難又耗時的傳統逐步式醣 質化反應。

O OP P₂O PO P₁O L₁ O PO HO PO L_{2 O} PO HO PO OR

N-glycan trisaccharide core

one pot glycosylation P, P₁, P₂ = protecting group L₁, L₂ = leaving group R = linker PN PN 圖二、一鍋化 N-glycan 三醣體醣質化反應

1.3

β-鍵結-苷露醣之寡醣體蛋白脂質簡介

在過去幾年的研究證據顯示，多醣體蛋白脂質 (N-glycans of glycoproteins) 在生物活性中扮演著非常重要的角色，對增加了解其 生理機能性質規則、分子機制，進而鑑定多醣體蛋白脂質相對重要。 在自然界中醣蛋白質之間，主要以 O-醣基鍵 (O-linked glycosidic) 與氨基酸中的絲氨酸或息寧氨酸 (Threonine) 鍵結，而 N-醣基鍵 (N-linked glycosidic) 則與天門冬氨酸 (Asparagines) 鍵結。[3]

β-鍵結-苷露醣之寡醣脂質蛋白 ；高苷露醣型(High-mannose type)，其五醣核心結構，含括兩個α-鍵結苷露醣、兩個β-鍵結 N-乙醯葡萄醣氨、一個β-鍵結苷露醣等醣體鏈結，這些寡醣經由 N-鍵 結鏈結於蛋白質上(圖一)。

mAb 2G12 (人類單株抗體 2G12)，[4]被發現不尋常的具有辨識 GP120 HIV-1 (Human immunodeficiency virus) 蛋白質上所共軛高苷 露醣叢聚體 (Oligomannose cluster residues) 的能力。[5] Wong 研究 團隊亦以此高苷露寡醣為合成標的物，以醣體活性高低的合成概念進 行一鍋化合成(流程一)(圖三)。[6] 所獲得各類高苷露寡醣類似物再進 行生物活性分析，加以釐清了解 mAb 2G12 抗體對高苷露醣的辨識活 性結構為何。 其合成法運用性缺點；繁雜及耗時的醣體建構積塊修飾合成途 徑、易產生自身縮合旁反應物 (self-condensation)。在我們的一鍋化 實驗設計中，也針對了如何避開發生自身縮合旁反應的發生，及設計 以運用重覆性高醣體中間體當醣體基材進而減少修飾合成步驟，加以 縮短製備單醣體基材所需時間。

O BnO BnO TBDMSO OH STol One-pot self-condensation synthesis O BnO BnO TBDMSO OH O BnO BnO TBDMSO O STol O BnO BnO TBDMSO OH O BnO BnO TBDMSO O O BnO BnO TBDMSO O STol + O HO HO HO OH O HO HO HO O O O HO HO OH O(CH2)5NH2 O HO HO HO O O HO HO HO O O O HO HO OH O(CH2)5NH2 O HO HO HO OH O HO HO HO OH O HO HO HO O O O HO OH O(CH2)5NH2 O HO HO HO OH O HO HO HO O O O HO HO HO O O HO HO HO O O O HO OH O(CH2)5NH2 O HO HO HO OH O HO HO HO O O HO HO HO O O HO HO HO OH O 流程一、一鍋化高苷露寡醣醣質反應合成

圖三、Human immunodeficiency virus

早期在1982年由Paulsen, H.以”不溶性”銀化物矽膠(Silver silicate) 製備β-苷露醣鍵結主要產物，係利用不溶性銀化鹽類固體表面催化進 行控制β-鍵結苷露醣的立體化學合成，進而合成出寡醣體五醣核心結 構(流程二)。[7] 其合成法運用性缺點；因使用傳統逐步線性合成(linear synthesis) 途徑，每一合成步驟均需要操作繁雜及耗時的中和、純化與鑑定實驗 工作、其條件所獲得β-苷露醣鍵結產物並非唯一產物，在純化及鑑定 上有相當難度。而我們所運用"一鍋化醣質反應合成"與"Crich β-苷露 醣鍵結條件"，可加以改善，期望得到比過往研究更快速、提高β-鍵 結苷露醣體選擇性與產率之合成途徑。

O AllO BnO AllO OBn Br + O O HO OBn N₃ O AllO BnO AllO OBn O O O OBn N₃ Ag-silicated 70% deallylation O BnO BnO BnO OAc Br AgOTf, 82% O O BnO O OBn O O O OBn N₃ O BnO BnO BnO OAc O BnO BnO BnO OAc Manα1 Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ 6 3 Manα1 流程二、Ag-silicate 五醣體醣質化反應合成

1.4 一鍋化階段式之寡醣體醣質化反應合成簡介

一 鍋 化 多 醣 體 醣 質 反 應 合 成 (one-pot in oligosaccharides synthesis)，即階段式(sequential addition)加入經修飾過保護官能基之 單醣體基材於同鍋反應中，進行醣質化反應，其間不需要加以純化醣 鏈結產物直到獲得最終產物才進行耗時純化步驟、亦不必擔心控制醣 體活化中心碳(anomeric activating groups)立體選擇性，此法有如將醣 體固定於聚合物基部合成法(polymer-based synthesis)般性質的有機

化學合成。[8]

程三)：醣體活性反應選擇性醣質化反應合成策略(reactivity-based glycosylation strategy)，其合成特性；運用修飾各類保護官能基團， 其拉電子(electron-withdrawing)能力加以遞減單醣體基材的反應活性 能力，如；Armed-disarmedprotecting group modifications，[9] 保護基 於 2-OR 遞減能力順序: R = -N3＞-O(ClAc)＞-NPhth＞-Bz＞-Bn、 [10] 所有單醣體基材均修飾成 anomeric thio-function 此類離去基團、使用 以親電子前驅物(electrophilic promoters)活化單醣體基材離去基團。 O n(1OR) SPh O SPh (RO2)n HO + reactive thioglycoside

less reactive thioglycoside

activator O n(1OR) O SPh (RO2)n O O SPh (RO3)n HO least reactive thioglycoside O n(1OR) O (RO2)n O O SPh (RO3)n O O n(1OR) O (RO2)n O O (RO3)n O O SPh (RO4)n HO reducing end glycoside O SPh (RO4)n O 流程三、一鍋化之寡醣體醣質化反應合成策略 A 此合成法就是藉由分別修飾醣體上反應活性遞減保護基團(流程 四 ) ，[11]加 以 控 制 單 醣 體 基 材 的 反 應 活 性 能 力 (RRVs) 高 低 ， 以

NIS-TfOH 此類親電子前驅物活化單醣體基材硫化物離去基團，於同 一 鍋 反 應 下 進 行 醣 質 化 反 應 ， 因 為 醣 受 體 本 身 較 低 反 應 活 性 (least-RRVs)，醣受體上離去基團具選舉性的不受前驅物活化，運用 階段性加入醣受體於同鍋反應中重覆進行合成步驟，在多個反應步驟 之間不進行中和與純化的處理，直到獲得最終寡醣體之後再進行中和 與純化步驟。 1998 年 Ley 研究團隊率先分析出，各類不同的修飾保護基之硫 化物醣體相對反應活性數據，[12]Wong 實驗團隊亦於 1999 年開發出

程序控制一鍋化多醣體合成 (Programmable One-Pot Oligosaccharide

Synthesis)，[13]其一鍋化合成方法亦是先行將各類修飾單醣體基材以 高壓液相層析儀(HPLC)進行分析實驗，經計算出紫外線吸收光譜後 (UV)，定義出各類醣體相對反應活性值(RRVs)，當了解各類醣體活 性數據後，進而設計各類醣體依反應活性大小，由高往低進行階段性 加藥一鍋化合成反應，目前該研究團隊發表經分析所獲得的醣體反應 活性數據將近百餘筆之多。

O BnOOBn OBnSTol O O O OBn BnO BnO OH HO OAc NHTroc STol 1) NIS/TfOH (RRV = 1.2 x 104) O O O OBn BnO HO LevO AcO OAc NHTroc OR 2) NIS/TfOH (RRV = 0) O O O OBn BnO O LevO AcO OAc NHTroc OR O O O OAc NHTroc O BnOOBn OBn O OBn BnO BnO O O BnO OBn OBn couple of hours, 44% R = (CH2)5CO2Me 流程四、策略 A 一鍋化之反應活性選擇醣質化反應合成 此依據醣體反應活性大小進行一鍋化醣質反應，其最大缺點在 於；為了將醣體 2-OH、3-OH、4-OH、6-OH 位置，修飾成不同保護 基團以達到控制醣體活性大小，繁雜及耗時的修飾合成途徑，是必然 的、由於進行一鍋化反應，其不單只獲得寡醣體主要產物，該反應含 著少量的未反應醣受體、旁反應副產物與醣體副產物，因此在最終的 純化與鑑定多醣體主要產物實驗時，必需耗時較長的操作時間。 策 略 B( 流 程 五 ) ： 幾 何 性 醣 質 化 反 應 合 成 策 略 (Orthogonal glycosylation strategy)，在上述策略 A，穩定物硫化醣體不是唯一能 運用在一鍋化合成反應中的單醣體。而幾何性醣質化反應合成策略則 是其衍生的另一合成法；運用不同離去基團就必須使用不同前驅物藥

劑，加以控制醣質化選擇性(promoter controlled)、與策略 A 以高反 應活性醣體作一鍋化合成反應起始端相比較，策略 B 則允許以 disarmed-type 醣予體(低反應活性)鏈結 armed-type 醣受體(高反應活 性)進行醣鏈結、運用醣體 6-OH 高反應活性的概念，於一鍋化條件 下控制其醣質化位向鍵結選擇性(regioselectivity)。 O n( 1 OR) F O SPh (RO2)n HO +

B. Orthogonal glycosylation strategy

activator selective for -F O n( 1 OR) O SPh (RO2)n O O F (RO3)n HO O n(1OR) O (RO2)n O O F (RO3)n O O n(1OR) O (RO2)n O O (RO3)n O O (RO4)n HO O (RO4)n O activator selective for -SPh 流程五、一鍋化之寡醣體醣質化反應合成策略 B 1994 年 Takahashi 等研究團隊，發表以一鍋化六步驟合成法而 穫得 Phytoalexin elicitor 的七寡醣體產物(流程六)。[14]其運用了醣體 6-OH 一級醇高反應活性進而控制位向醣質化鏈結、使用不同前驅物 MeOTf 活化醣體，進而控制避開硫化物醣體自身進行縮合反應、運 用了不同離去基團醣體及相對反應活化能力高低不同的前驅物，例 如:DMTST ＞MeOTf 、HfCp2Cl2-AgOTf ＞AgOTf 控制一鍋化醣質

反應。 O Br MBzO MBzO MBzO OMBz (1.16 equiv) O BzO HO BnO SEt HO (1.10 equiv) O PivO BnO BnO SEt BnO (1.80 equiv) 1. AgOTf 3. MeOTf O MBzO MBzO MBzO HO F (1.10 equiv) O BzO HO BnO SPh HO (1.00 equiv) O PivO BnO BnO SPh BnO 2. MeOTf 4. HfCp2Cl/AgOTf 6.DMTST O OMe OAc AcO AcO OH 5. DMTST 24% O MBzO MBzO MBzO OMBz O O BnO O O OP BnO BnOBnO O MBzO MBzO MBzO (1.25 equiv) (6.00 equiv) O BzO O BzO O BnO O O PivO BnO BnO BnO O OMe OAc AcO AcO O

Takahashi's one-pot synthesis of phytoalexin

流程六、策略 B 一鍋化之幾何性醣質化反應合成 此合成策略，其最大缺點在於為了避免自身縮合反應的發生，必 須選擇價格昂貴、選擇性高、高毒性試劑的前驅物進行反應，修飾成 不同保護基團、及離去基團於醣體上，與策略 A 的修飾合成步驟相 比較，其在合成醣中間體時重覆性不高，故合成單醣體基材耗時，純 化與鑑定，必需耗時較長的操作時間。 策 略 C ： 階 段 性 醣 質 化 反 應 合 成 策 略 (iterative glycoslation

strategy) ， 此 法 可 以 回 顧 已 發 表 文 獻 ， Danishefsky’s glycal methodology 、 [15]Gin’s dehydrative glycosylation 、 [16]Yamago selenoglycosylation with bromine 、 [17]Crich’s thioglycosylation

methodology，[18]均是以預先活化(pre-activated)醣予體後，隨著階段 性加入醣受體於一鍋中進行合成 (流程七)。 O n(1OR) SPh O SPh (RO2)_n HO

C.Iterative glycosylation strategy

1) Pre-activate O n(1OR) O SPh (RO2)_n O O SPh (RO3)_n HO O n(1OR) O (RO2)_n O O SPh (RO3)n O O n(1OR) O (RO2)n O O (RO3)_n O O (RO4)_n HO O (RO4)_n O O n(1OR) 2) _{1) Pre-activate} 2) 1) Pre-activate 2) 流程七、一鍋化之寡醣體醣質化反應合成策略 C 利用預先活化醣予體醣上離去基團，先產生高反應性醣體中間體 後，再階段性加入醣受體於同鍋下進行合成，其醣受體具有與起始醣 予體相同 anomeric 離去基團，故可重覆進行預先活化的合成步驟， 於一鍋化條件下，直到產生最終醣鏈結多醣體。 2001 年 Huang et al.已發表文獻，以化學劑量(stoichiometric amount)控制 AgOTf、p-TolSCl 於同鍋反應中形成 p-toluenesulfenyl

triflate，此一較高活性前驅物，進行預先活化 disarmed 醣予體後，再 加入 armed 醣受體進行醣鏈結合成，重覆此步驟後而獲得最終多醣體

主要產物(流程八)。[19]

TolSCl

-60oC

5 min 15 min 15 min 5 min RT -60oC TolSCl (0.9 equiv) (0.9 equiv) (1.0 equiv) 15 min C (1.1 equiv) 5 min RT O BzO _OBz BzO BzO STol A O OBn HO BnO PhthN STol O BnO BnO BnO OH OPentyl B C O BzO _OBz BzO BzO O OBn O BnO PhthN O BnO BnO BnO O OPentyl 54% B A 流程八、策略 C 一鍋化之階段性醣質化反應合成 階 段 性 醣 質 化 反 應 合 成 策 略 ； 其 運 用 性 優 點 為 不 需 要 考 慮 armed-disarmed 單醣體基材，因反應活性的高低，所產生的合成設計 難度、單醣體基材所使用的修飾基團因不必考慮醣體活性也較一致 性，以達到減少去保護基團合成步驟，此法在多醣體一鍋化合成的運 用性很高。 其運用性缺點:在進行階段性醣質化反應合成前必需釐清各醣質 化反應步驟，尋找出最適當反應條件，再進行一鍋化合成，耗時較長、 在 某 些 醣 受 體 發 現 無 法 進 行 醣 質 化 反 應 、 在 某 些 條 件 下 存 在 著 aglycon transfer 副反應的發生。

以上三種策略雖然所使用的方式不同，但程序都以"一鍋化"為基 礎設計寡醣體醣質化合成，其總括優點為將不易在自然界中取得之寡 醣體量產化、減少繁雜醣質化有機合成反應過程中所需藥劑與有毒溶 劑、縮短寡醣體醣質化反應及純化所需時間、增加因過多中和純化步 驟所損失的寡醣體合成產率。

1.5

β-鍵結-苷露醣之離去官能基合成應用介紹

1988 年 David Crich 研究團隊研發出一β-苷露醣醣質反應合成 法，係將苷露醣體 1-OH 修飾成硫化離去官能基、氧硫化離去官能基 或溴化離去官能基，以 Tf2O、DTBMP、BSP 或 AgOTf、DTBMP 等 活性前驅物，於超低溫條件下預先活化苷醣予體醣上離去基團，而產 生α-glycosyl triflate 中間體後，再階段性加入醣受體於同鍋下進行雙 分子親核(S N2)醣質反應合成，進而獲得高β-鍵結選擇性之苷露醣體 (流程七)。其主要β-立體控制關鍵在於將苷露醣體上 4-OH 與 6-OH 以 benzylidene acetal 保護官能基固定住，使苷露醣體組態

(conformation)於反應過程中傾向於 CCIP (close contact ion pairs)中 間體、於超低溫下進行實驗，如此一來更容易控制苷露醣體立體位向 組態(表一)。[18]

表一、 Crich β-苷露醣醣質反應合成 O OMe O O Ph MeO STol O O OMe O O Ph MeO Br O OMe O O Ph MeO STol Tf2O, DTBMP or PhSOTf, DTBMP AgOTf, DTBMP PhSOTf, DTBMP O OMe O O Ph MeO OTf β-mannoside formation

Entry Glycosyl donor Glycosyl acceptor Yield(%) α/β ratio 1 O OBn O O Ph BnO STol O HO O O OMe 95 >1/25 2 O OBn O O Ph BnO STol O O O OH O O 95 >1/25 3 Ph _OO OBnO BnO STol O OH O O Ph BnO OMe 97 1/18 4 O OBn O O Ph BnO STol O O OBn OH N3 85 1/5.1 5 O OTBDMS O O Ph BnO SEt O HO O O OMe 80 1/10 此β-苷露醣醣質反應合成缺點﹔醣質反應活化前驅物在活化離 去基後，會產生大量親電子旁反應物(electrophilic side products)、而 在 1-OH 修飾成硫化離去官能基之單醣受體，在某些醣體則會產生硫 化轉移旁反應物(aglycon transfer side product)。

4,6-O-benzylidene acetal 的合成方法，將苷露單醣體將 1-OH 位置製備 成 1-O-trichloroacetimidate 離去基，以催化量的路易士酸(Lewis acid) TMSOTf 與各類醣受體於超低溫下進行逆加成(inverse addition)醣質

反應合成，進而獲得β-苷露醣雙醣體主要產物(表二)。[2j] Schmidt 開發的合成反應優點具有﹔僅需使用微量活化前驅物即 可活化 trichloroacetimidate 離去基、反應所需時間短、反應所需使用 藥劑種類少，使得醣質旁反應物減低，價格亦經濟。 表二、Schmidt β-苷露醣醣質反應合成 O OBn O O Ph AllO S(O)Et O OBn O O Ph AllO OR HOR (2 equiv) DTBMP (2 equiv) Tf2O (1 equiv) -78~0oC O OBn O O Ph AllO HOR TMSOTf (cat.) O(NH)CCl3

Entry Glycosyl Donor Glycosyl acceptor Yield (%) α/β ratio

1 Ph _OO OBnO AllO R1, 2 R1 =O(C=NH)CCl3 R2 = (S=O)Et O HO OBn BnO OTDS NDMM R1 = 71 R2 = 18 1/3.6 1/2.7 2 O OBn O O Ph AllO R1, 2 O O O OH O O R1 = 59 R2 = 59 　β only 　β only 3 Ph _OO OBnO AllO R1, 2 O HO AcO AcO OMe AcO R1 = 72 　β only 4 O OBn O O Ph AllO R1, 2 O O O OH O O R1 = 88 R2 = 36 1/2.1 1/3.6 5 Ph _OO OBnO AllO R1, 2 HO CO2Me NHZ R1 = 71 1/8

O OBn O O Ph AllO cat TMSOTf β-anomer α/β-anomeric mixture inverse addition of donor Cl3C O NHTMS SSIP CCIP O OBn O O Ph AllO oxocarbenium ion R OH O OBn O O Ph AllO OR' R' = C(=NH)CCl₃ OTf− + R OH H+ OTf− H+

activation of imidate donor

流程九、 Schmidt 逆加成醣質合成反應機構

Schmidt 方 法 的 速 率 逆 加 成 醣 質 反 應 機 構 ( 流 程 九 ) 首 先 為 1-O-trichloroacetimidate 苷露醣予體被催化量之路易士酸 TMSOTf (cat.)進行活化後而形成 oxocarbenium ion 苷露醣中間體，進而與 triflate anion 再形成 closed contact ion-pair(CCIP)、solvent separated ion-pair (SSIP)，所活化產生之苷露醣中間體再與醣受體進行醣質反 應合成，反應同時所產生的酸性質子(acidic proton)則重新再進入活 化 醣 予 體 的 醣 質 反 應 循 環 中 ， 以 控 制 速 率 逆 加 成 合 成 法 活 化 1-O-trichloroacetimidate 苷露醣予體可以防止過多的 oxocarbenium ion 苷露醣中間體形成，儘管只使用催化量路易士酸活化前驅物也能提供

足夠之 triflate anion 使得 oxocarbenium ion 苷露醣中間體再繼續形成 CCIP 中間體或 SSIP 中間體，進而壓制住α/β anomer 混合醣體的生 成，提高β-anomer 雙醣體的獲得。

2000 年 Yukishige Ito 研究團隊開發了一β-苷露醣鏈結合成法，分 子內醣配基傳遞合成(intramolecular aglycon delivery)係將苷露醣體 2-OH 修飾成 PMB-此類 acetal 的官能基，再以 DDQ 進行氧化反應將 醣受體鍵結在 2-O-官能基團上，再以路易士酸 MeOTf 與 DTBMP 於 低溫至加熱的方式進行分子內醣配基傳遞合成，進而穫得β-苷露醣鏈 結主要產物(流程十)。[20] Ito 研究團隊近年也陸續開發出不同 2-O-acetal 之官能基，亦應用於寡醣體的合成策略中。 O O O O OMe SMe Me3SiO i_Pr 2 Si Pr2i Si O O OMP OBn HO BnO NPhth DDQ O O O O OMe SMe Me3SiO i_Pr 2 Si Pr2i Si O _O OMP OBn O BnO NPhth H O O O OH HO i_Pr 2 Si Pr2i Si O O OMP OBn O BnO NPhth 流程十、Ito β-苷露醣醣質反應合成

2008 年 Peter H. Seeberger 研究團隊亦發表了以 1-O-carboxy

benzyl 離去基與 Tf2O、DTBMP 於低溫下進行苷露醣醣質反應，進而

此合成法亦是利用 Tf2O 活化 1-O-carboxy benzyl 後，醣受體鍵結 於 1-O-carboxy benzyl 官能基上，同時醣受體於β-位向進行分子內醣 鍵結於苷露醣上，此合成法有別於分子內醣配基傳遞合成法(表三)。 [21] 表三、β-苷露醣醣質反應合成 O O O Ph OBn BnO O CO2H O O O Ph OBn BnO Nu Nucleophile Tf2O (1 equiv) DTBMP (2 equiv) -60oC~rt Donor

Entry Nucleophile Yield(%) α/β ratio

1 _O O PMBO O Ph OH OAll 81 β only 2 HOAcO O BnO OMe BnO 85 1/10 3 _HOHO O AcO NHZ O(CH2)3CH=CH2 82 1/4.5

Kwan Soo Kim 研發團隊於 2006 年亦發表了一β-苷露醣鏈結合成 法(流程十一)，主要是將 1-OH 修飾成 4-pentenoate 離去基，以 PhSeOTf 為活性前驅物將苷露醣體 1-O-pentenoate 活化，在將醣受體 階段性加入反應中使醣受體與 1-O-OTf 醣予體中間產物進行醣質合

表四、Kim β-苷露醣醣質反應合成 O O O Ph OBn BnO O O PhSeOTf, TTBP -78o to 0oC + ROH Ph _OO O OBn BnO OR

Entry Glycosyl acceptor Yield(%) α/β

1 _O O BnO O Ph OH OMe 90 1/17 2 _HOBnO O BnO N3 OTBDMS 87 β only 3 _HOBnO O BnO OMe BnO 85 β only 4 _BnOHO O BnO OMe BnO 89 β only 5 O O O OH O O 82 β only 6 _BnO O BnO HO OBn OMe 89 β only 7 _HO O BzO BzO OBz OMe 87 β only 8 _BzO O BzO HO OBz OMe 90 β only O O O Ph OBn BnO O O PhSeOTf TTBP O O O Ph OBn BnO O O SePh OTf O O SePh O O O Ph OBn BnO OTf O O O Ph OBn BnO OTf O O O Ph OBn BnO OR HOR 流程十一、Kim β-苷露醣醣質合成反應機構

第二章 結果與討論

2.1 一鍋化醣質反應合成 N-linked 核心三醣體之探討

2.1.1 Sulfoxide、thioglycoside 醣體離去基進行一鍋化三醣

體醣質合成反應之運用

本實驗以寡醣蛋白脂質的五醣核心結構為標的，以"一鍋化"合成 法為主要合成路徑(圖四)。又以兩個 鍵結乙醯葡萄醣氨、一個 β-鍵結苷露醣等鏈結三醣體進行合成研究為首要工作，其關鍵性合成控 制部份為 β-鍵結苷露醣鏈結，所採用的條件為 Crich 實驗團隊所發 表，[18] 在低溫下以TTBP[23]具立體障礙去質子鹼(deprotonation base) 與 Tf2O 以先行活化醣予體後，再加入醣受體進行醣質化反應，生成 具β-鍵結苷露醣鏈結主要醣體產物。 O HO OH O HO OH NHAc O O HOAcHN OH O O HO HO OH O HO O HO HO OH OH O O HO OH O HO OH NHAc O O HOAcHN OH O OH HO 圖四、寡醣五醣體核心結構

首先修飾合成製備出，氧化硫醣予體1、硫化物醣受體 2，此兩 種單醣體基材(表五)。利用氧化硫醣予體 1 較高反應之化學性質，於 −78℃下分別加入 DTBMP 或 TTBP 或 DPSO 進行活化而產生-OTf 苷 露醣中間體，再加入醣受體 2 進行 β-鏈結反應 6 小時後，將反應以弱 鹼中和、有機溶劑分液萃取，最終以管柱層析法進行純化，獲得雙醣 體3 與硫化苷露醣旁反應產物 4。由表五實驗結果中得知，當加入 TTBP 與 DPSO 藥劑時，會增加β-苷露雙醣體 3 的立體選擇性與產率、 減少硫化苷露旁反應物4。 我們試著設計在進行β-苷露醣醣質合成反應時(表六)，加入 DPSO、DBZSO、DNDPSO、TMU 等氧硫化物藥劑，藉實驗觀察在 不同拉推電子性的氧硫化物藥劑是否會影響β-立體位向選擇性，由表 六實驗結果獲知，在加入DPSO 氧硫化物藥劑時β-立體位向選擇性是 最佳的反應條件。 由(圖五、六) Sulfoxide 與 DPSO 苷露醣質化反應機構，說明了 增加β-苷露醣雙醣產物的主要合成途徑、如何避免獲得 aglycon transfer 旁反應物，係運用苯環硫化基的立體障礙與醣予受體的 arm-disarm 電子性來加以控制防止獲得 aglycon transfer 副反應物(圖 七)。

表五、 β-鍵結苷露醣體醣質反應合成運用 O HO AcO TrocHN STol OBn O OBn O O Ph PMBO STol O O AcO TrocHN STol OBn O OBn O O Ph PMBO Tf2O(1.2 equiv), DTBMP or TTBP, DPSO, DCM (50mM), 4A MS -78oC, 10min O OBn O O Ph PMBO STol 1 2 O + 3 4 DCM (0.25 M), -78oC~-40oC 1-6h 1.2 equiv 1.0 equiv DTBMP = 2,6-di-tert-butyl-4-methylpyridine TTBP = 2,6-di-tert-butylpyridine

DPSO = diphenyl sulfoxide

DTBMP (equiv) TTBP (equiv) DPSO(equiv) 3,4 Yield(%) α/βa

2.4 3 = 50, 4 = 20 1/4

-- 2.4 3 = 55, 4 = 10 1/6

-- 2.4 1.2 3 = 50, 4 = 10 1/10 -- 2.4 3.6 3 = 50, 4 = 10 β only a : α/β anomer ratio define with HPLC

表六、Sulfoxide molecules 之β-鍵結苷露醣體醣質反應合成運用 O OBn O O Ph PMBO S(O)Tol O OBn O O Ph PMBO O O AcO TrocHN OBn HO O AcO TrocHN OBn STol STol 1.5 equiv Tf2O (1.5 equiv) TTBP (3.0 equiv)

sulfoxide agent (4.5 equiv) -78oC 10 min -78oC 30 min 1.0 equiv -78~-40oC 6 h

DPSO = diphenyl sulfoxide DBZSO = dibenzoyl sulfoxide DPNPSO = dinitro-diphenyl sulfoxide TMU = N,N,N,N-tetra-methylurea 1 2 3 Sulfoxide agent 3, Yield(%) α/βa _Sulfoxide agent 3, Yield(%) α/βa nil 55 1/6 DNDPSO n.d. n.d.

DPSO 55 β only TMU n.d. n.d.

DBZSO 25 β only −−− −−− −−−

O S Tol S OTf O O F₃C O S OTf Tol OTf O O OTf low temp. S OTf Tol O STol O O STol OTf

aglycon transfer product

Nu SN2-like O Nu β-form product R1 R2 O O R2 STol 圖五、Sulfoxide β-鍵結苷露醣體醣質之反應機構 O S Tol S OTf O O F₃C O S OTf Tol OTf O O O low temp. OTf S Ph Ph SPh Ph Sulfonium ion Nu O Nu β-form product S OTf Tol O O 圖六、DPSO β-鍵結苷露醣體醣質之反應機構

O O S Ph Ph Sulfonium ion O S O O STol R1 R2 R1 R2 O armed O S Tol disarmed O O STol armed disarmed OTf O armed O TolS disarmed OTf + S Tol OTf 圖七、防止醣體配位基轉移之反應機構 設計將氧化硫苯甲基葡萄醣予體c (armed)、硫化物乙醯基葡萄 醣予體d (disarmed)、TTBP 去質子鹼 a，以定量甲苯 b 為標準指示， 將此四種化合物混合後(pre-mixture)，先進行高壓液相層析儀定量分 析實驗，獲得預混合高壓液相層析儀滯留時間 (HPLC retention time)、紫外線光吸收光譜定量分析數據後，於−78˚C 下再加入 Tf2O 前驅物進行活化，反應 10 分鐘後再進行高壓液相層析儀定量分析實 驗，獲得活化混合後 HPLC 數據 (流程十二)。由此兩數據對照後， 在此−78˚C 溫度下使用 Tf2O 前驅物進行活化，硫化物乙醯基葡萄醣 予體d 不會參與反應，此結果顯示可利用此一特性，設計氧化硫、硫

化物醣體的一鍋化合成反應。 O OAc AcO AcO OAc STol O OBn BnO BnO OBn STol O a = TTBP, b = Toluene c d a c b d premix injected to HPLC -78oC Tf₂O activated-premix injected to HPLC 10min HPLC Detector

HPLC analysis (Mightysil normal phase column 4.6-250; Elution mixture: hexane/EtOAc from 90/10 to 80/20 over 30 min at 1.0 mLmin-1.

Uv Area Ratio (%) a/c/d = 75 / 5 / 95

流程十二、一鍋化醣體之HPLC-UV 分析數據 Pre-mixture Activated-Premix a _b c d b a c d

O OBn BnO BnO OBn STol O OBn BnO BnO OBn STol O c d a c b d premix injected to HPLC -78oC Tf₂O activated-premix injected to HPLC 10min HPLC Detector a = TTBP, b = Toluene

HPLC analysis (Mightysil normal phase column 4.6-250; Elution mixture: hexane/EtOAc from 90/10 to 80/20 over 30 min at 1.0 mLmin-1

Uv Area Ratio, a/c/d (%) = 79 / 6 / 27

流程十三、一鍋化醣體之HPLC-UV 分析數據 Pre-mixture Activated-Premix a b d c a b d _c

同 時 亦 設 計 另 一 實 驗 ， 首 先 將 氧 化 硫 苯 甲 基 葡 萄 醣 予 體 c

(armed)、硫化物苯甲基葡萄醣予體 d (armed)、TTBP 去質子鹼 a，以

定量甲苯b 為標準指示，將此四種化合物混合後，先進行高壓液相層 析儀定量分析實驗，獲得預混合高壓液相層析儀保留時間、紫外線光 吸收光譜定量分析數據後，於−78˚C 下再加入 Tf2O 前驅物進行活化， 反應 10 分鐘後再進行高壓液相層析儀定量分析實驗，獲得活化混合 後HPLC 數據(流程十三)。由此兩數據對照後，在此−78˚C 溫度下使 用 Tf2O 前驅物進行活化，硫化物苯甲基葡萄醣予體 d 會參與反應， 此結果顯示無法以此種修飾硫化物苯甲基醣體，設計醣體的一鍋化合 成反應。 由先前所設計的實驗得知其一鍋化醣質反應合成三醣體之可行 性後，先行修飾合成製備出，氧化硫醣予體 1、硫化物醣體 2、乙醯 葡萄糖氨受體5，此三種醣體建構積塊(流程十四)。利用氧化硫醣予 體 1 較高反應之化學性質，於−78˚C 分別加入 Tf2O、TTBP、DPSO 先行活化，再加入低反應化學性醣體 2 進行 β-鏈結反應 6 小時後，將 溫度升高至−60˚C 同時加入乙醯葡萄糖氨受體 5，於 10 分鐘之後再加 入Tf2O、DPSO，進行 β-鏈結反應 16 小時，將反應以溶水弱鹼中和、 有機溶劑分液萃取，最終以管柱層析法進行純化，獲得20%兩步反應 產率三醣體6。

O HO AcO TrocHN OBn O OBn O O Ph PMBO STol O O O AcO TrocHN OBn O OBn O O Ph PMBO STol O Tf₂O (1.2 equiv) TTBP (2.4 equiv) DPSO (3.6 equiv) O HO BnO N₃ OBn O BnO N₃ O(CH2)6Cl OBn 1 2 5 1 -78oC 10 min 2 -60oC 6 hr 5 10 min 16 hr

6, 20% over two steps

Tf2O (1.2equiv) DPSO (1.2 equiv) 1.2 equiv 1.0 equiv 1.5 equiv O(CH2)6Cl 流程十四、 一鍋化三醣體核心結構合成 此一鍋化合成法構想源自於 Wong 實驗團隊所開發的"程序控制

一 鍋 化 多 醣 體 合 成 "(Programmable One-Pot Oligosaccharide

Synthesis)，[13]其將各類修飾醣體基材以高壓液相層析儀 (HPLC) 進

行實驗，經計算出紫外線吸收光譜後 (UV)，定義出各類醣體相對反 應活性 (RRVs)，當了解各類醣體活性數據後，進而設計各類醣體由 高往低進行階段性加藥一鍋化反應。

受體9，此三種單醣基材(流程十五)。利用氧化硫醣予體 7 較高反應 之化學性質，於−78˚C 下分別加入 Tf2O、TTBP、DPSO 先行活化， 再加入醣體8 進行 β-鏈結反應 1 小時後，將溫度升高至−60˚C 同時加 入半乳糖氨受體9，於 10 分鐘之後再加入 Tf2O、DPSO，進行α-鏈結 反應 16 小時，將反應以弱鹼中和、有機溶劑分液萃取、最終以管柱 層析法進行純化，獲得30%產率三醣體 10。 O OBn O O Ph BnO STol O Tf₂O (1.2 equiv) TTBP (2.4 equiv) DPSO (3.6 equiv) 7 8 9 7 -78oC 10 min 8 -60oC 1 hr 9 10 min 16 h

10, 30%, over two steps

HO O O O STol O O HO OBn O Cl O Ph O O O O O O O O O Ph O OBn Cl OBn BnO Ph O O Tf₂O ( 1.2 equiv) DPSO (1.2 equiv) 1.2 equiv 1.0 equiv 1.5 equiv

10

流程十五、 一鍋化三醣體結構合成

醣體10，實驗中我們發現在使用 Crich β-苷露醣醣質反應合成法中，

所投入大量 TTBP、Tf2O、DPSO 藥劑而產生大量親電子性副反應物

(electeophile side products)為影響產率原因之一、而產生醣體配位基 轉移副反應物(aglycon transfers side products)為影響產率原因之二。

2.1.2 Trichloroacetimidate、2,6-dimethylthiophenyl 醣體離

去基進行一鍋化三醣體醣質合成反應之運用

2006 年 J. C. Gildersleeve 研究團隊發表一防止醣配位基轉移旁反 應(aglycon transfer side products)的合成方法(流程十六)，[24]

係將具立體障礙之苯環硫化物 (2,6-dimethylthiophenyl) 修飾於醣受 O N₃ AcO OAc Br OAc O O O Ph OBz SDMP HO + AgOTf, DTBMP DCM, -60 to 0oC O O O Ph OBz SDMP O O OAc AcO AcO N₃ O OH HO OH R O O OH HO HO N₃ O N₃ AcO OAc O OAc NH CCl₃ O BzO BzO OBz SDMP OH + TMSOTf, ether -20 to 0oC O N₃ AcO OAc _OAc O BzO BzO OBz SDMP O DMP =Me Me 流程十六、 DMTP 硫化物離去基防止醣體配位基轉移 體1-OH 位置上，利用離去基的立體障礙來避免產生醣配位基轉移旁

反應，而我們也使用了此一合成法，修飾了幾種將使用於一鍋化醣質 反應之醣受體上。 運用 Schmidt 的合成法製備出 1-O-trichloroacetimidate 苷露醣予 體 11 與運用 2,6-dimethylthiophenyl 離去基製備雙甲基硫化葡萄醣胺 醣受體 12(表七)，分別以不同劑量之路易士酸 TMSOTf 於-70˚C 下 進行β-苷露醣醣質反應合成而獲得雙醣體 13，由表七實驗結果得知當 隨著增加 TMSOTf 酸量時，亦增加了苷露醣β-立體位向的選擇性， 同時也有效防止醣體配位基轉移旁反應物的產生。 表七、 路易士酸量控制β-苷露醣鍵結主要產物之運用 O BnO O O Ph OBn O(C=NH)CCl3 O BnO N3 HO OBn DMTP + TMSOTf , CH₂Cl₂, 4AMS-AW -70oC, 1~2h O BnO O O Ph OBn O BnO N3 O OBn DMTP 11 12 13 DMTP = 2,6-dimethylthiophenyl TMSOTf (equiv) DCM (Mm) Recovered acceptor (%) 13, Yield (%) α/βa 0.1 80 15 65 1/1.2 1.0 10 10 35 1/6.7 1.0 80 5 75 1/5.5 2.5 80 5 70 1/5

a : α/β anomer ratio define with HPLC

應上(流程十七)，首先將苷露醣予體 11 與葡萄醣胺醣受體 12，於 -70˚C 下降溫 10 分鐘，再加入與醣予體 11 等 mole 數量之路易士酸 TMSOTf(1.5 equiv)，於-70˚C 下反應兩小時，同鍋反應中再加入葡 萄醣胺醣受體5，於低溫下使用本實驗室所開發的低濃度醣質化反應 進行β-醣體鍵結而獲得兩步反應產率 45% 三醣體 14。 1.0 equiv O BnO N3 HO OBn DMTP O BnO N₃ HO OBn O(CH₂)₆Cl O BnO O O Ph OBn O BnO N3 O OBn O O BnO N3 OBn O(CH₂)₆Cl O BnO O O Ph OBn O(C=O)CCl₃ 1.5 equiv TMSOTf (1.5eq) NIS (1.5eq) DCM/MeCN/EtCN (1:2:1, 10mM) 11 12 5 1.2 equiv 11 + 12 10 min -70oC TMSOTf (1.5 equiv) 2 h -70oC 5 -70oC 4 h 10 min

14 45%, over two steps

14

流程十七、 TMSOTf 酸量控制之一鍋化三醣體醣質反應合成運用

於三醣體 10 合成反應上亦使用當量 TMSOTf 控制β-苷露醣鍵結

立體選擇性，一鍋化合成方式下分別將醣體基材 11、15 於-70˚C 加

體基材9 再加入 TMSOTf (1.5 equiv)、NIS(1.2 equiv)，待溫度升高 制-20˚C 行α-鍵結反應 4 小時，將反應以弱鹼中和、有機溶劑分液萃 取、最終以管柱層析法進行純化，獲得兩步反應 35% 產率三醣體 10 (流程十八)。 O BnO O O Ph OBn O(C=NH)CCl₃ 1.5equiv 1.0 equiv O HO O O DMTP O O O Ph HO OBn O(CH2)3Cl 1.2 equiv O O O Ph O OBn O Cl O BnO O O Ph OBn O O O O

10 35%, over two steps

11 ₁₅ 9 11 + 15 -70 o_C 10 min TMSOTf ( 1.5 equiv) -70oC 1 h 9 -40oC 10min TMSOTf (1.5 equiv) NIS ( 1.5 equiv) -20oC 4 h 流程十八、 TMSOTf 酸量控制之一鍋化三醣體醣質反應合成運用

2.1.3 運用速率逆加成程序法控制

β-苷露醣醣質鍵結之寡

醣體一鍋化合成與應用

2000 年 Richard R. Schmidt 研究團隊已發表文獻中，[2j]使用了逆加 成法進行β-苷露醣醣質反應鍵結，而獲得高β-立體選擇性的苷露醣雙 醣體，在我們重複該合成條件實驗中發現改變加入醣予體速率，苷露 醣雙醣體之β-立體選擇性亦會隨著醣予體加入速率不同而有所改變 (表八)。 表八、 速率逆加成程序法控制β-苷露雙醣體醣質鍵結 TMSOTf (cat) O OBn O STol O NHTroc O O Ph PMBO AcO OBn inverse addition 3 O O O Ph PMBO O STol HO NHTroc AcO OBn 16 2 + O OBn O(C=NH)CCl₃ O O Ph PMBO 4 R = α-STol 17 R = β-NH(C=O)CCl3 -50oC, CH2Cl2 R Addition rate of 0.25 M of 16 mLmin-1 3, Yield (%), α/βa 4, Yield (%) 17, Yield (%) NAb 48, 1/2 20 0 0.2c 65, 1/9.5 5 10 0.07 47, 1/4.5 20 10 0.035 40, 1/4.5 20 10

a: α/β-anomeric ratios were determined by HPLC analysis b: Conventional addition procedure was adopted.

c: Glycosylation experiment was repeated twice and same α/β anomeric ratios were obtained.

我們亦使用二級醇單醣受體基材18、一級醇單醣受體基材 19 與 苷露醣單醣予體基材11 以控制速率逆加成進行β-苷露醣醣質反應鍵 結(表九)，由表五實驗結果得知二級醇單醣受體基材18 在以控制速 率逆加成法進行實驗後有明顯增加β-苷露雙醣體 20，而在一級醇單 表九、 速率逆加成程序法控制β-苷露雙醣體醣質鍵結 O OMe HO BnO BnO OBn 18 O O O O O OH 19 or TMSOTf (cat) O OBn O OMe O BnO O O Ph BnO BnO OBn inverse addition 20 11 R = (C=NH)CCl3 + O OBn OR O O Ph BnO O O O O O O O OBn O O Ph BnO or 21 -50oC, CH₂Cl₂ Addition rate of 0.25 M of 11 mLmin-1 Glycosyl acceptor Disaccharide yield (%), α/βa NAb 18 20 = 88, 1/2 0.2 18 20 = 85, 1/10 0.07 18 20 = 85, 1/8 NAb 18 20 = 88, 1/2 0.4 19 19 = 92, 1/2.3 0.14 19 19 = 87, 1/2.3 NAb 19 19 = 50, 2/1

a: α/β-anomeric ratios were determined by HPLC analysis b: Conventional addition procedure was adopted.

c: BF3.Et2O (1 mol equiv) was used for activating imidate donor 10.

醣受體基材19 以控制速率逆加成法進行實驗後無明顯增加β-苷露雙 醣體21，而在使用 BF3．Et2O 作活性前驅物時，實驗結果增加α-苷

露雙醣體21。

以速率逆加成程序合成法加以控制β-醣體鍵結進而運用在一鍋

化三醣體醣質反應上(流程十九)，首先將葡萄醣胺受體2 與催化量之

路易士酸TMSOTf (cat)於-50℃下降溫 10 分鐘，再以 0.2 mLmin-1

速率控制加入苷露醣予體16，於-50℃下反應兩小時後，以弱鹼中和、 O OBn O O Ph PMBO O(C=NH)CCl3 O HO N₃ BnO OBn O(CH2)6Cl O STol HO NHTroc AcO OBn work up and dry

16 1.5 equiv 2 1.0 equiv 5 1.2 equiv 5 2 + TMSOTf (cat) _{- 50}o_{C, CH} 2Cl2 0.2 mLmin-1 inverse-addition 16

TMSOTf (ca.) NIS ( 1.2 equiv) CH₂Cl₂ (50 mM) - 20oC~rt, CH₂Cl₂ O OBn HO HO PMBO O O N₃ BnO OBn O(CH₂)₆Cl O O TrocHN AcO OBn 6 22 90% AcOH_(aq) 60oC, 1h

40%, over three steps

22

流程十九、控制速率逆加成程序法之一鍋化三醣體醣質反應合成運用

鍋反應中再加入葡萄醣胺醣受體5，於-20℃下加入 TMSOTf (cat.)、 NIS (1.2 equiv)進行β-醣體鍵結而獲得三醣體 13，再以弱鹼中和、過 濾分子篩(molecular sieve)、分液漏斗粹取除水、真空乾燥後，再加 入少量 90% 冰醋酸水溶液加熱一小時後，減壓蒸餾除去冰醋酸水溶 液再以中壓液相層析管柱(MPLC)進行純化分離，獲得三步反應 40% 產率三醣體22。 另外亦是以速率逆加成程序合成法加以控制合成β-苷露醣體鍵 結雙醣體 23 (流程二十)，首先將 2,6 雙甲基硫化(DMTP)鼠李醣

(L-rhamanopyranoside)受體 15 與催化量之路易士酸 TMSOTf (cat.)於

-50℃下降溫 10 分鐘，再以 0.4 mLmin-1速率控制加入苷露醣予體11， 於-50℃下反應 1 小時後，以弱鹼中和、過濾分子篩(molecular sieve)、 分液漏斗萃取除水、真空乾燥後，以中壓液相層析管柱(MPLC)進行 純化分離，獲得90% 產率雙醣體 23。 O OBn O O Ph BnO O(C=O)CCl₃ 11 15 23, 90% HO O O O DMTP O O O O O DMTP OBn BnO Ph O O 1.5 equiv 1.0 equiv + TMSOTf (ca.) - 50o_{C, CH} 2Cl2 (50mM) 0.4 mLmin-1 inverse-addition 流程二十、 控制速率逆加成程序法之雙醣體醣質反應合成

同時亦以速率逆加成程序合成法運用在一鍋化三醣體10 合成反應 上(流程二十一)，首先將 2,6 雙甲基硫化鼠李醣受體 15 與催化量之 路易士酸TMSOTf(ca.)於-50˚C 下降溫 10 分鐘，再以 0.4 mLmin-1 O OBn O O Ph BnO O(C=NH)CCl3 11 15 9

10, 70%, over two steps

HO O O O DMTP O O HO OBn O Cl O Ph O O O O O O O O O Ph O OBn Cl OBn BnO Ph O O

1.2 equiv 1.0 equiv 1.2 equiv

work up and dry under vacuo

9 15 + TMSOTf (cat) - 50oC, CH₂Cl₂ 0.4 mLmin-1 inverse-addition 11 TMSOTf (cat) NIS ( 1.2 equiv) CH₂Cl₂ (50 mM) - 20oC, CH₂Cl₂ 10 流程二十一、一鍋化三醣體醣質反應合成應用 速率控制加入苷露醣予體11，於-50˚C 下反應一小時後，以弱鹼中 和、過濾分子篩(molecular sieve)、分液漏斗萃取除水、真空乾燥後， 同鍋反應中再加入葡萄醣胺醣受體9，於-20˚C 下加入 TMSOTf (cat.)、NIS (1.2 equiv)進行α-醣體鍵結而穫得三醣體 10，再以弱鹼

中和、過濾分子篩 (molecular sieve)、分液漏斗萃取除水、真空乾燥 後，再以中壓液相層析管柱 (MPLC)進行純化分離，獲得兩步反應 70%產率三醣體 10。 由速率逆加成醣質反應實驗結果解釋β-苷露醣體合成時之反應機 構(流程二十二)，首先1-O-trichloroacetimidate 苷露醣予體被催化量 O OBn O O Ph PMBO cat TMSOTf O OBn O O Ph PMBO OTf α-mannosyl triflate R OH H+ β-anomer α/β-anomeric mixture inverse addition of donor β-anomer Cl₃C O NHTMS SSIP CCIP O OBn O O Ph PMBO oxocarbenium ion R OH O OBn O O Ph PMBO OR' R' = C(=NH)CCl₃ OTf− + R OH H+ OTf− H+

activation of imidate donor

Cl₃C O

NH₂ or

流程二十二、 速率逆加成-苷露雙醣體合成反應機構

中間體，進而與triflate anion 再形成 closed comtact ion-pair(CCIP)、 slovent separated ion-pair(SSIP)與α-mannosyl triflate，所活化產生之苷 露醣中間體再與醣受體進行醣質反應合成，反應同時所產生的酸性質 子(acidic proton)則重新再進入活化醣予體的醣質反應循環中，以控

制速率逆加成合成法活化 1-O-trichloroacetimidate 苷露醣予體可以防

止過多的oxocarbenium ion 苷露醣中間體形成，儘管只使用催化量路

易士酸活化前驅物也能提供足夠之 triflate anion 使得 oxocarbenium

ion 苷露醣中間體再繼續形成 CCIP 中間體或 SSIP 中間體，進而壓制 住α/β anomer 混合醣體的生成，提高β-anomer 雙醣體的穫得，在實 驗結果中我們也發現反應活性較低的二級醇醣受體的β-醣體立體選 擇性比反應活性較高的一級醇醣受體更來的顯著，高反應活性一級醇 醣受體容易與trifalte anion 產生競爭於 oxocarbenium ion 苷露醣中間 體上，結果生成α-雙醣體主要產物。

結論

1. 首先我們重複實驗 Crich 所研發的氧硫化離去基苷露醣予體合成 法，在實驗中我們也針對一系列氧硫化物藥劑對β-苷露醣體鍵結 進行了醣質反應合成實驗，由實驗結果發現DPSO 氧硫化藥劑的 參與對β-苷露醣體鍵結比率有顯著的增加，進而將其設計運用在 一鍋化三醣體醣質反應上，但由於所投入大量TTBP、Tf2O、DPSO

等藥劑而產生大量親電子性旁反應物(electeophilic side products) 與硫化離去基醣受體會產生醣體配位基轉移旁反應物(aglycon transfers side products)，使得一鍋化三醣體醣質反應最終獲得的 產率過低。 2. 在釐清了產生醣體配位基轉移旁反應物的反應機構之後，製備出 以立體障礙防止醣體配位基轉移旁反應物生成的 2,6 雙甲基硫化 離 去 基 (2,6-dimethylthiophenyl) 醣 受 體 再 與 1-O-trichloroacetimidate 醣予體以等莫耳量路易士酸 TMSOTf 提高 β-苷露醣體鍵結選擇性，實驗結果發現成功防止了醣體配位基轉 移旁反應物的生成，但在一鍋化三醣體醣質反應中卻因使用過量 的酸使得三醣體產率不高，同時也會破壞苷露醣體3-O-PMB 保護 基的修飾，無法進行苷露醣體位向選擇性(regioselectivity)的設

計。 3. 在重複 Richard R. Schmidt 所研發的逆加成法進行β-苷露醣質反應 合成時，實驗中發現改變加入醣予體速率，苷露醣雙醣體之β-立 體選擇性亦會隨著醣予體加入速率不同而有所改變而獲得高β-立 體選擇性的苷露醣雙醣體之後，再進行一系列不同速率逆加成程 序實驗，將最優化速率逆加成條件運用於一鍋化三醣體醣質反應 合成上，在實驗中使用催化量路易士酸並使用控制速率逆加成醣 質反應合成法而獲得高產率與減少旁反應物的產生，我們相信控 制速率逆加成醣質反應合成法在寡醣體合成領域中應該有更廣大 的應用性與便利性。

第三章 實驗部份

3.1 General experimental

Chemicals used in this investigation were purchased as ACS reagent grade from commercial venders and used without further purification. CH2Cl2 (from Mallinckrodt), MeOH and CH3CN (from J.T. Baker) were distilled over calcium hydride. Anhydrous DMF (100 mL from J.T. Baker) was treated with activated molecular sieves before use. Addition rate of mannosyl imidate donor was controlled by syringe pump from SAGE instruments model 341B. Progress of reaction was monitored with thin-layer chromatography (TLC) on silica gel F-254 plate and visualized with UV (254 nm) illumination and/or by staining with p-anisaldehyde staining reagent. Optical rotations of compounds were measured by JASCO DIP-1000 polarimeter at 27˚C. Flash column chromatography was performed on either 70-230 mesh size or 230-400 silica gel obtained from E. Merck. Elution over 230-400 silica gel was done with medium pressure liquid chromatography (MPLC) driven by BÜCHI 688 model pump. 1H and 13C NMR spectra were recorded with respective 300 MHz and 75 MHz spectrometers by either Brüker or Varian Unity-300 NMR spectroscopy. Chemical shift (

δ

ppm) was calibrated against the residual proton signal and the 13C signal of deuterated chloroform (CDCl3). Coupling constant(s) in hertz (Hz) were calculated from differences in chemical shifts derived from 1H NMR spectra. α/β-Anomer ratios of glycosylation isomers were determined by HPLC analysis, which was

performed on Mightysil Si 60 250-4.6 normal phase column with EtOAc/CH2C2/hexane gradient elution. HPLC elution was achieved by Hitachi L-2130 gradient pump at 0.8 mL/min and eluted compounds were detected with Hitachi L-2300 UV detector.

3.2 Experimental

3.2.1 General procedure

3.2.1.1 A.

β-Mannoslyation with additive of DPSO using

sulfoxide donor

To the solution of sulfoxide donor 1 (102 mg, 0.20 mmol), TTBP (102 mg, 0.41 mmol), DPSO (124 mg, 0.61 mmol) and Tf2O (33 µL, 0.2 mmol) were dissolved in CH2Cl2 (4 mL) under N2 at -78˚C stirred 10 min, and then was added slowly the solution of glycoside accepoter 2 (100 mg, 0.17 mmol) in CH2Cl2 (1mL), at -78 to -60˚C under N2 stirred 1 to 6 h. Upon completion of β-mannosylation as judged by TLC, the reaction was quenched with addition of few drops of satd. NaHCO3, The resulting solution was then filtered through celite, and filtrate was washed with water (20 mL × 2), brine (20 mL × 1), dried (MgSO4), filtered, and then concentrated for column chromatography purification (Elution: EtOAc/hexane = 1:4) furnishing tolyl 3-O-acetyl-6-O-benzyl-2-

deoxy-4-O-(2-O-benzyl-4,6-O-benzylidene-3-O-p-methoxybenzyl-D-man nopyranosyl)-2-(trichloroethyloxycarbamyl)-1-thio-β-D-glucopyranoside

methoxybenzyl-1-thio-α-D-mannopyranoside 4 (10 mg, 10%).

3.2.1.2 B. One-pot glycosylation of trisaccharide with

addition of DPSO using sulfoxide donor

To the solution of sulfoxide donor 1 (102 mg, 0.20 mmol) or 7 (220 mg, 0.38 mmol), TTBP (102 mg, 0.41 mmol for 1; 190 mg, 0.77 mmol for 7), DPSO (124 mg, 0.61 mmol for 1; 233 mg, 1.15 mmol for 7) and Tf2O (33 µL, 0.2 mmol for 1; 63 µL, 0.38 mmol for 7) were dissolved in CH2Cl2 (4 mL for 1; 8 mL for 7, 50 mM) under N2 at -78˚C stirred 10 min, and then was added slowly the solution of glycoside accepoter 2 (100 mg, 0.17 mmol) or 8 (100 mg, 0.32 mmol) in CH2Cl2 (1mL for 2; 2 mL for 8), at -78 to -60˚C under N2 stirred 1 to 6 h. and then were added acceptor 5 (130 mg, 0.26 mmol) or 9 (210 mg, 0.48 mmol)、DPSO (40 mg, 0.2 mmol for 1; 78 mg, 0.38 mmol for 7) and Tf2O (33 µL, 0.2 mmol for 1; 63 µL, 0.38 mmol for 7) at -60˚C stirred 16 h.Upon completion of glycosylation as judged by TLC, the reaction was quenched with addition of few drops of satd. NaHCO3, The resulting solution was then filtered through celite, and filtrate was washed with water (20 mL × 2), brine (20 mL × 1), dried (MgSO4), filtered, and then concentrated for purification with medium pressure liquid chromatography over silica gel (230-400 mesh) (Elution: EtOAc/hexane = 1:4) to furnishing 6-chlorohexyl 3,6-di-O-benzyl-2-azido-2-deoxy-4-O-[3-O-acetyl-6-O-benzyl-2-(trichlor oethyloxycarbamyl)-4-O-(2-O-benzyl-4,6-O-benzylidene-3-O-p-methoxy

benzyl-β-D-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-β-D-glucopyranoside

6 (50 mg, 20% over two steps) or (3-chloropropyl) 2-O-benzyl-4,6-O-

benzylidene-[2,3-O-isopropylidene-4-O-(2,3-di-O-benzyl-4,6-O-benzylid ene-β-D-mannopyranosyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-galactopyranoside 10 (104 mg, 30% over two steps).

3.2.1.3 C.

β-Mannoslyation with molar equivalent of

TMSOTf using trichloroacetimidate donor

To the solution of mannosyl imidate 11 (178 mg, 0.3 mmol) and

acceptor 12 (100 mg, 0.2 mmol)were dissolved in CH2Cl2 (4 mL) at -70˚C under N2 stirred 10 min, and then was added TMSOTf (5 µL, 0.03 mmol) stirred 2 h. Upon completion of β-mannosylation as judged by TLC, the reaction was quenched with addition of few drops of satd. NaHCO3, The resulting solution was then filtered through celite, and filtrate was washed with water (20 mL × 2), brine (20 mL × 1), dried (MgSO4), filtered, and then concentrated for column chromatography purification (Elution: EtOAc/hexane = 1:8) furnishing (2,6-dimethylphenyl) 2-azido-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-4-O-(2,3-di-O-

benzyl-4,6-O-benzylidene-D-mannopyranosyl)-1-thio-β-D-glucopyranosi

3.2.1.4 D. One-pot glycosylation of trisaccharide with

equivalent of TMSOTf using trichloroacetimidate donor

To the solution of mannosyl imidate 11 (178 mg, 0.3 mmol for 12; 264 mg, 0.46 mmol for 15) and acceptor 12 (100 mg, 0.2 mmol) or acceptor 15 (100 mg, 0.31 mmol) were dissolved in CH2Cl2 (4 mL) at -70˚C under N2 stirred 10 min, and then was added TMSOTf (5 µL, 0.03 mmol) stirred 1 to 2 h, and then were added acceptor 5 (121 mg, 0.24 mmol, using procedure E) or acceptor 9 (162 mg, 0.37 mmol), TMSOTf (5 µL, 0.03 mmol) and NIS (68 mg, 0.3 mmol) at -40 to -20˚C stirred 4 h. Upon completion of glycosylation as judged by TLC, the reaction was quenched by addition of few drops of satd. NaHCO3 and small pieces of solid Na2S2O3 followed by vigorously stirring for ca. 30 min. The resulting solution was then filtered through celite, and filtrate was washed with water (20 mL × 2), brine (20 mL × 1), dried (MgSO4), filtered, and then concentrated for purification with medium pressure liquid chromatography over silica gel (230-400 mesh) Elution: EtOAc/hexane = 1:4 or 1:8) furnishing (1-chlorohexyl) 2-azido-3,6-di-O-benzyl-2-

deoxy-4-O-[2-azido-3,6-di-O-(2,3-di-O-benzyl-2-deoxy-4-O-(2,3-di-O-b enzyl-4,6-O-benzylidene-D-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-β-D-g

lucopyranoside 14 (117 mg, 45% over two steps) or (3-chloropropyl) 2-O-benzyl-4,6-O-benzylidene-[2,3-O-isopropylidene-4-O-(2,3-di-O-ben zyl-4,6-O-benzylidene-β-D-mannopyranosyl)-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D

3.2.1.5 E. Low concentration 1,2-trans

β-selective

glycosylation

To the solution of thioglycoside donor (1.0 mol equiv) and acceptor (2.0 mol equiv) were dissolved in CH2Cl2/MeCN/EtCN (1:2:1, 10 mM), and suspended 4 Ǻ MS (500 mg) into the solution of mixture under N2 at -70˚C after stirred 10 min, were added NIS (1.2 mol equiv) and TMSOTf (0.15 mol equiv) stirred 4 h. Upon completion of glycosylation as judged by TLC, the reaction was quenched by addition of few drops of satd. NaHCO3 and small pieces of solid Na2S2O3 followed by vigorously stirring for ca. 30 min. The resulting solution was then filtered through celite, and filtrate was washed with water (20 mL × 2), brine (20 mL × 1), dried (MgSO4), filtered, and then concentrated for purification with chromatography to obtain products

3.2.1.6 F. Rate dependent inverse-addition procedure for

preparation of disaccharide thioglycoside

Mixture of acceptor (1.0 mol equiv) and 4 Ǻ MS-AW (300 mg) in CH2Cl2 (50 mM) were stirred in 50 mL pear-shaped RB flask (flask A) for 10 min at bath temperature -50 ˚C under N2, which was followed by treatment with trimethlsilyl trifluoromethanesulfonate (TMSOTf) (0.1 mol equiv). After then, D-mannosyl imidate donor (1.5 mol equiv)

(for 2 or 18); 0.4 or 0.14 (for 19, 15) mLmin-1. Upon completion of glycosylation, the reaction was quenched with addition of few drops of Et3N. The resulting mixture was filtered over celite, and the filtrate was then concentrated for medium pressure liquid chromatography

purification over silica gel (230-400 mesh ) (Elution: EtOAc/hexane + % CH2Cl2) to yield disaccharide 3, 20, 21 or 23.

3.2.1.7 G. Preparation of trisaccharide with sequential

glycosylation approach

Mixture of acceptor (1.0 mol equiv) and 4 Ǻ MS-AW (300 mg) in

CH2Cl2 (50 mM) was stirred in 50 mL of pear-shaped RB flask for 10 min at -50 ˚C under N2, to which was added TMSOTf(0.1 mol equiv). To the mixture of acceptor and TMSOTf, 0.25 M of D-mannosyl imidate donor (1.5 mol equiv) was added via calibrated syringe pump at 0.2 (for 2) or 0.4 (for 15) mLmin-1. Upon completion of glycosylation, the reaction was quenched with addition of few drops of Et3N, and the mixture was filtered through celite. The filtrate was then washed with water (20 mL × 1), brine (20 mL × 1), dried over MgSO4, filtered, and concentrated to give crude disaccharide. After drying under vacuo for couple of hours, crude disaccharide, was dissolved in CH2Cl2 (50 mM), to which were added acceptor 5 or 15 (1.2 mol equiv) and 4 Ǻ MS-AW (500 mg) at -20˚C for 10 min under N2. After then, the mixture was treated with NIS (1.2 mol equiv) and TMSOTf(0.1 mol equiv), the resulting mixture was stirred from -40˚C to rt for 16 h under N2. Upon completion of