核酸配對錯誤修復系統對未配對重覆序列核酸修復之研究

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告

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※ 核酸配對錯誤修復系統　　　 　　　　※

※　　　對未配對重覆序列核酸修復之研究　　　　　※

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計畫類別：■個別型計畫　　□整合型計畫

計畫編號：NSC　89－2320－B－002－093－

執行期間：88 年 08 月 01 日至 89 年 07 月 31 日

計畫主持人：方偉宏

共同主持人：

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

執行單位：國立台灣大學醫學院醫事技術學系

中　華　民　國　89　年　12　月　31　日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

核酸配對錯誤修復系統對未配對重覆序列核酸修復之研究

Pr epar ation of NSC Pr oject Repor ts

計畫編號：NSC 89-2320-B-002-093

執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 07 月 31 日

主持人：方偉宏 國立台灣大學醫學院醫事技術學系

計畫參與人員 : 黃耀民，王薔惠，王柏堅　台大醫技系碩士班 一、中文摘要 生物體中含有許重覆核酸序列，在遺 傳上並不穩定，很容易形成延伸或是刪 減，由於這類核酸組合模式代表了若干人 類重要遺傳疾病的病源，因此極受重視， 重覆核酸的增生或刪除可以用「複製滑動」 模型來解釋；在核酸複製時新生成的核酸 股與第二段重覆序列形成配對，因而在模 板核酸股(造成刪除)或是新生股(造成延 伸)形成髮夾形環狀構造。由於核酸複製時 的後續股具有強烈的單股核酸性質，因此 更容易形成髮夾結構。為了避免刪除或延 伸突變，修復這類錯誤核酸以維持基因的 恒常性是非常的重要，在細菌中，推測甲 基指引核酸修復系統被推測參與這項修復 反應。 本計畫根據過去研究核酸配對錯誤與 單股核酸環修復的經驗，建立一套實驗系 統，依據「複製滑動」的模型，以人工的 方式將噬菌體M13mp18及其含有重覆序列 的插入衍生物核酸合成滑動髮夾結構的雜 雙股核酸，這種雜雙股核酸包含特定甲基 化修飾，用來測試大腸菌甲基指引修復系 統的反應，被修復的程度可用限制酵素測 定。本計畫以這些反向重覆序列雜雙股核 酸進行試管中核酸修復的實驗，特別是用 核酸配對錯誤修復缺乏的突變菌株進行實 驗，以明確的分析各種基因產物參與反應 的狀態。 結果發現[髮夾]結構的核酸會被大腸 菌細胞萃取物反應，修復的機制與甲基指 引系統無關，髮夾結構有較高比例被移 除；但也有相當比例的填入反應，恢復反 向重復序列的結構。至於是那些酵素參與 此一反應則需要進一步的分析。 關鍵詞：核酸修復，重覆核酸序列，核酸 複製錯誤，核酸配對錯誤修復 Abstract

Tandemly repeated sequences are genetically unstable and subject to expansion or deletion. These

rearrangements are of interest because they represent an important source of human genetic disease.

A model of “replication slippage” was proposed to explain addition or loss of repetitive

sequences during DNA replication; the nascent DNA strand realigns relative to its template at a second repeat, producing a loop in either the template (leading to deletion) or the nascent strand (leading to expansion). Because of its single-stranded nature, hairpin formation may be more efficient on the lagging strand. Repair of such

heterology is important for

maintaining genome integrity. Genetic evidences have shown bacterial

methyl-directed mismatch repair is involved in this activity.

A set of heteroduplexes is designed from bacteriophage M13mp18 and its insertion derivatives. The loop of invert tandem repeats is designed at overlapping restriction enzyme sites. After incubation with

cell free extracts, in vitro repair

levels can be scored by restriction endonuclease analysis.

We found that the slipped replication intermediates can be processed by Escherichia coli cell free

extracts. The repair was independent of methyl-directed pathway. The ‘hairpin’ structure we designed in the substrate was significantly removed in the reaction. However part of the hairpin was filled in and invert repeat sequence was restored. The components involved in this reaction need to be further characterized. The assay system should make it possible to elucidate the mechanism of the reaction. Study of misaligned tandem repeats repair with E.coli and human cell-free

extracts may provide insights into the molecular basis for mutagenic phenomenon in some human genetic diseases.

Keywords: DNA mismatch repair, tandem

repeats, DNA replication error, 二、緣由與目的 近年來有許多遺傳疾病在分子生物學 研究下，發現與異常的核酸複製或基因重組 有關，特別是若干疾病細胞產生重覆核甘序 列多樣化（repetitive sequence polymorphism）的病例， (Caskey, 1992; Kuhl, 1993; Nelson, 1993; Wells, 1993; Eichler, 1994; Monckton, 1995; Sutherland, 1995)，在病人的發病基因遺 傳有不穩定的重覆核甘酸的現象, 這些與 疾病相關的重覆基因, 可能位於基因內或 是在基因的5'端或3'端不被轉錄的區域; 而病人發病時則合併有重覆核甘酸大量的 增長的現象。另外在遺傳性非多息肉直腸癌 (Hereditary Non-polyposis Colon Cancer, HNPCC) 病人的腫瘤中，也發現微衛星核酸 有重覆核甘序列小量增長或變短的情形 (Aaltonen et al., 1993; Thibodeau et

al., 1993; Wooster, 1994)。 目前我們對於這類重覆核酸序列的增 長、變短多樣化等突變現象的分子基礎並不 清楚,根據推測可能是因為重覆核酸序列本 身的結構易於滑動，使得核酸在複製的過程 中產生插入或刪減的情形，(Kunkel, 1993; Nelson, 1993; Wells, 1993)。 正常的細胞在進行核酸複製時，一旦 發生核酸插入或刪減，細胞內的修復系統 會將其認出而予以修復，若是修復機能無 法發揮功能，則很容易產生核酸多樣化的 情形(Kunkel, 1993)，在HNPCC的病例中, 的確發現自病人所分離的癌細胞，參與核 酸配對錯誤修復的基因產生突變(Fisher et al., 1993)，而癌細胞所發展出來的組 織培養也缺乏試管中核酸配對錯誤修復能 力(Parsons et al., 1993)。經過家族遺 傳分析之後，發現這些核酸配對錯誤修復 蛋白基因的缺陷，會提高癌症的好發率， 因此核酸配對錯誤修復系統的研究，有助 於我們對這類癌症的起因的了解。 重覆序列核酸在遺傳上不穩定，很容 易形成延伸或刪減，而這一類的重新組合 模式又代表了若干人類重要遺傳疾病的病 源，因此引起高度的重視(Richards and Sutherland, 1992)。雖然重覆序列的延伸及 刪減的過程在理論上是相似的，然而形成 刪減的機制受到較多的分子研究。在大腸 菌中，許多研究發現了造成刪減的若干因 素，一般而言，在重覆序列中相似度增加 會使刪除機率增加，雖然牽涉到核酸的相 似度，然而參與相同基因重組的recA 與刪 減的現象無關，對於一段重覆序列單元而 言，最接近的重覆序列的單元要比遠端的 單元易於被刪減。 Streisinger 等人 (1966)曾提出了 一個「複製滑動」的模型，用來解釋非常 短的重復序列增加或是減少，造成frame shift 突變的的情形。這個模型也延伸解 釋了大腸菌及人類遠端重覆序列重組的現 象，新生成的核酸股與第二段重覆序列形 成配對，因而在模板核酸股(造成刪除)或 是新生股(造成延伸)形成環狀構造。理論 上，核酸複製時的排列錯誤特別與反向重 覆(invert repeat)結構的刪減有關，因為 相距較遠的的核酸序列可能需要形成髮夾

(hairpin)結構，以便形成滑動排列錯誤。 由於核酸複製時的後續股(lagging strand)較多單股核酸的性質，因此可能更 容易形成髮夾結構。 最近一項研究以包含不同形式的反 向重覆序列的核酸，在大腸菌中進行測 試，發現具有甲基指引修復能力的大腸菌 菌種，可以抑制不完美同質重覆序列的刪 除(Lovett and Feschenko, 1996)，這項 結果推測所有刪減的過程中，都經過了雜 雙股的中間產物，而這個雜雙股則是由每 一個重覆序列的單股所形成。而核酸配對 錯誤修復系統對於重覆序列刪除的影響， 也結論出大部分的核酸刪減現象都在核酸 複製後立即發生。 各種生物都有修復系統，針對核酸在 複製或基因重組時所產生的錯誤進行修 復，其中被研究得最透徹的，要算是大腸 菌中的甲基指引核酸配對錯誤修復系統 （Methyl-directed mismatch repair)， 這個系統是一項核酸複製後的除錯修復機 制(Review, Modrich, 1987, 1989, 1991, 1996), 其修復過程牽涉到修復蛋白 MutS 識別錯配的位置,再加上 MutL蛋白共同活 化內切脢 MutH, 這些蛋白的共同作用下 可以在尚未甲基化的新生核酸(GATC)序列 上,產生一個與配對錯誤相關的股裂 (nick), 接下來由外切核酸脢將含有錯誤 配對的核酸水解, 最後再由複製用核酸聚 合脢合成正確的核酸以完成修復的工作。 本實驗室最近的研究顯示，細菌系統 除了可以修復鹼基配對錯誤以外，還可以 有效的修復1 到 5個鹼基的單股未配對核 配環，而對６個鹼基以上更大的核酸環修 復的能力就大為降低(Fang, 1997)。然而 依據Lovett等人(1996)的推測，大型核酸 環中如果包含了重覆序列，則又會引起甲 基指引修復的反應，同時可以避免刪減突 變的發生，這個重要的論點尚未經由實驗 證實，本計畫是希望根據過去研究核酸配 對錯誤與單股核酸環修復的經驗（Fang and Modrich 1993, Fang, 1997)，建立一 套實驗系統，依據「複製滑動」的模型， 以人工合成重覆序列刪除時可能產生的中 間產物，進行核酸修復的實驗，方法是將 噬菌體M13mp18及其含有重覆序列的插入 衍生物核酸，合成滑動髮夾結構的雜雙股 核酸，由於大腸菌甲基指引鹼基配對錯誤 修復統需要特定的甲基化 GATC 位置指導 修復，因此核酸進行不同的甲基化的標 記，以提供修復系統所需要的指引，用來 測試大腸菌甲基指引修復系統的反應，被 修復的程度可用限制酵素測定。用這些雜 雙股核酸進行大腸菌萃取液的試管中研 究，以界定修復活性所需要的因子及系統 的專一性，同時還可以探討細菌中是否有 其它的活性參與反應；在對細菌的修復機 制充份了解之後，進一步對人類細胞萃取 液進行研究分析。 由於人類的修復系統與細菌類似，在 進行人類細胞的研究之前，大腸菌的核酸 修復研究將可建立一個經濟的實驗模式， 配合研究大腸菌核酸修復的機制，發展出 成熟的材料及方法之後, 可進一步提供深 入檢視一些人類傳傳疾病的分子基礎。 三、結果與討論 為了證明核酸配對錯誤修復系統是否 對反向重覆序列所產生的髮夾結構進行修 復，我們設計了完整配對的髮夾結構與含 有一個各種配對錯誤，或是兩個配對錯誤 的髮夾結構（如表一），以此雜雙股核酸進 行大腸菌的試管中反應，發現髮夾結構無 論是否含有配對錯誤的鹼基，都可以被修 復，我們另以核酸配對錯誤修復系統缺乏 (mutS)的細菌萃取液進行實驗，發現仍然 保有修復的能力，由此可知，在大腸菌中 有一個可以處理反向重覆序列產生髮夾結 構的機制，而這個機制與配對錯誤修復系 統不同。而從文獻中查閱，並沒有發現類 似的報導，因此我們所觀察到的現象是一 個新的發現。 然而實驗結果有幾個問題尚待解答， 我們所觀察的反應，被處理過的髮夾結構 中，有三分之二是髮夾被移除，而有三分 之一則是髮夾結構被解開補入，而被移除 或是被補入的反應到底是同一個機制或是 不同的機制尚待解釋。另外修復反應的範 圍有多大，這一點牽涉到反應專一性的問 題。值得進一步的研究。 表一、修復反應中含 20fmol 反應物，修復 結果以百分比表示。

菌種 髮夾結構 NM522(wildtype) 移除/填入 RK1517(mutS) 移除/填入 hTA 30.6/25.2 30.1/14.9 hAC 46.9/25.8 47.1/16.7 hAC-AC 20.3/15.3 23.5/7.3 hGG 22.4/24.7 21.6/19.2 hCT 41.8/13.7 44.5/10.9 hCC 24.9/13.5 24.1/11.3 hGT 31.3/28.0 35.9/25.3 hAA 17.4/3.5 20.9/6 hTT 22.6/6.1 29.7/4.6 四、計畫成果自評 本研究的前半部在設計雜雙股核酸的 部分與原計畫完全相符、達成預期目標， 以細菌萃取液進行反應也成功的測出活 性，而且是一個新發現的活性。但是反應 的專一性部分仍需要進一步步的分析，才 能達到發表的標準。 五、參考文獻

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