行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
細胞趨電性及其作用機制之探討
Studying the Galvanotaxis Behavior of Cells and the Underlying Mechanism
計畫編號：NSC 90-2214-E-002-001
執行期限：民國 90 年 08 月 01 日起至民國 91 年 07 月 31 日 主持人：謝學真，台灣大學化工系 計畫參與人員：王翔郁、廖婉君，台灣大學化工系 一、中文摘要 細胞受到電場影響而改變其形態或移 動方向的現象稱為趨電性(galvanotaxis)。現 今對趨電性的機制卻尚不明瞭，電場刺激 的功效也未能廣泛應用。本研究選用人類 真 皮 纖 維 母 細 胞 (normal human dermal fibroblast, NHDF)為研究對象，來探討在電 場作用下，不同的生長基質或是不同的抑 制劑處理對 NHDF 趨電性的影響。以不同 基質而言，施加 1V/cm 電場時，NHDF 在 玻璃表面上會朝向正極移動(平均方向指 標為-0.37)且移動速率最慢，約為 4m/h。 在 其 他 四 種 基 質 上 ( 組 織 培 養 用 聚 苯 乙 烯，膠原蛋白，明膠以及幾丁聚醣)，NHDF 的移動方向也朝向正極。其中，在組織培 養用聚苯乙烯上有最明顯的方向性，平均 移動方向指標為-0.51。在這些基質上， NHDF 移動速率大多為 60 m/h 左右。若 以不同的抑制劑處理，當肌動蛋白纖維的 形成、傳統型蛋白激? C(classical protein kinase C, cPKC) 的 活 性 或 活 性 氧 族 群 (reactive oxygen species, ROS)的含量受抑 制時，會使 NHDF 失去在電場中定向移動 的特性，平均方向指標降至-0.07 以下。以 螯合劑螯合胞外鈣離子卻會使 NHDF 定向 移動更明顯的朝向正極，平均移動方向指 標增加為-0.70。而以抑制劑或螯合劑處理 的 NHDF 之移動速率都比未處理組為低。 由實驗結果可知，將 NHDF 培養在適當基 質上可增加其移動速率，在電場中更可將 其有效地導向正極移動。而 NHDF 的趨電 性需要肌動蛋白的參與，以及 cPKC 與 ROS 扮演胞內訊息傳遞角色。若移去胞外鈣離 子會使得 NHDF 胞內鈣離子濃度梯度更加 顯著，使得細胞更一致地朝向正極移動。 關鍵詞：纖維母細胞、趨電性、生長基質、 訊息傳遞 AbstractThe characteristic of a cell that it moves
directionally in an applied electric field (EF) is termed “galvanotaxis”. Though the characteristic is generally taken as a common behavior, the underlying mechanism is not yet clarified. This study investigated the galvanotaxis of normal human fibroblast (NHDF) in an EF and tried to reveal the underlying mechanism through seeding them on different substrata or treating them with several inhibitors separately. NHDF moved toward anode (the average directedness was –0.37) in 1 V/cm EF with a speed of 4 m/h on glass slips (EF controls). NHDF remained their directional migration toward anode on other four substrata (TCPS, collagen, gelatin and chitosan) with speed over 60m/h. NHDF had the largest average directedness of –0.51 on TCPS. Inhibition the formation of F-actin, the classical protein kinase C (cPKCs) and reactive oxygen species (ROS) abolished the directional migration of NHDF in EF on glass slips with average directedness lower than –0.07. But chelating the extracellular calcium ions made NHDF moved more devotedly toward anode with an average directedness of –0.70. The chemical-treated NHDF moved slower than the EF controls with speeds less than 20m/h.
Keywords: fibroblast, galvanotaxis,
substratum, signal transduction
二、緣由與目的 近百年來已有許多關於各種細胞受電 場作用的研究，使人們了解有效控制電場 施加的方式及強度，可能對臨床醫學有相 當大的貢獻。目前有關利用電場促進傷口 癒合、殘肢再生 (limb regeneration)、骨質 生成 (osteogenesis)、中樞神經系統復原 (central nervous system repair)，甚至改變胚 胎發展的研究 [1] 一直不斷在進行中。然
而直到現在，有關電場對於細胞的作用機 制尚未完全了解，對於電場刺激的功效也 未能完全控制及應用。本研究由較偏向應 用的觀點出發，選擇尚未用作趨電性研究 的細胞株－人類真皮纖維母細胞 (normal human dermal fibroblasts，簡稱 NHDFs)， 探討在不同基質表面：包括玻璃、組織培 養用聚苯乙烯 (tissue culture polystyrene， TCPS)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)、 以及幾丁聚醣(chitosan)；抑制與細胞移動 相關的分子：F-actin、cPKC、ROS 以及鈣 離子對細胞的趨電行為之影響。期望對於 未來細胞趨電性在臨床醫學上的應用能有 所貢獻。 三、實驗材料與方法 本研究使用正常人類真皮纖維母細胞 (NHDF)進行實驗。培養細胞所用的培養液 為 DMEM，內含 10％血清(FBS)及 1％三合 一抗生素；並添加 25 mM HEPES 以維持培 養液的 pH 值。 細胞移動行為量化是以細胞在兩小時 之間的位移來決定。移動方向由各細胞移 動方向與電場由正到負方向之夾角的餘弦 值 cos 決定，細胞往正極移動則餘弦值為 -1，往負極移動則為 1，而移動方向垂直電 場者為 0。為了解細胞整體移動方向的趨 勢，可將圖中所有細胞的餘弦值取平均， 定 義 為 「 平 均 移 動 方 向 指 標 」 (average directedness，cos/n)，如 Fig. 1 所示。平 均速度則是以實驗進行兩小時後細胞的位 移除以時間來計算。 四、實驗結果 基質材料對 NHDF 趨電性的影響 在 1 V/cm 電場作用下，NHDF 在各基 質表面的移動方向和速度可由 Fig. 2 表示 之。整體而言，在電場作用下，NHDF 在 各基質材料表面的移動皆朝向正極，不過 與玻璃表面比較，各基質之間的平均移動 方向性指標並沒有太大的差異，表示改變 基質對 NHDF 的定向移動影響不大，平均 移動方向指標都在-0.26 到-0.50 之間。對於 NHDF 移動的速度方面，與玻璃表面比較 在其他各種基質上 NHDF 移動速度均加 快，如 Table 1 所示，移動速度由 4 m/h 增加到 27 m/h。 胞內訊息傳遞相關分子所扮演的角色 本部分實驗的結果如 Fig. 3 所示。 NHDF 在 1 V/cm 的電場作用下，朝向正極 移動，平均移動方向性指標為-0.37。將胞 外的鈣離子以 EGTA 螯合之後，NHDF 朝 向正極移動的行為更加明顯，平均移動方 向指標為-0.66。當加入 cytochalasin D 抑制 肌動蛋白 actin 的聚合會使得 NHDF 失去定 向移動的特性，相似的結果也出現在使用 Go6976 抑制 cPKC 的活性或是使用 NAC 抑制 ROS 的實驗組中，平均移動方向指標 都幾乎為 0。由 Table 2 可看出，在移動速 度方面，將胞外鈣離子螯合之後，NHDF 移動速度加快到 8.64 m/h，而其他三種處 理方法會使得 NHDF 移動速度減低到 2.21 m/h 以下。 五、討論 材料表面之粗糙度(roughness)、可濕 性(wettability)以及表面所帶的電性會影響 白蛋白的吸附，而白蛋白的吸附會影響細 胞在材料表面的附著。由 Fig. 4 (來源:88 年度國科會計畫成果)可得知，白蛋白在幾 丁聚醣的表面吸附量最大，將造成與纖維 黏連蛋白的競爭吸附，使得細胞較不易附 著。由先前實驗結果得知，生長在幾丁聚 醣表面的 NHDF 都較不容易附著，所以受 到電場作用時，NHDF 會有較大的移動速 度。 至於與細胞生物相容性良好的膠原蛋 白，會使得生長在其上的 NHDF 會移動得 很快，且都表現出相當良好的趨電性。此 原因可能為，細胞可直接附著於膠原蛋 白，或是與吸附在膠原蛋白表面的纖維黏 連 蛋 白 (fibronectin) 和 透 明 質 蛋 白 (vitronectin)結合[2]；纖維黏連蛋白和透明 質蛋白皆可促進細胞的附著和移動，故生 長在膠原蛋白的細胞，受電場作用時趨電 現象很明顯。另外，有研究指出 [3] 膠原 蛋白內含有一段特別的胺基酸序列，可促 進真皮纖維母細胞胞內鈣離子的濃度，而 鈣離子的濃度正好與細胞的趨電表現相 關。也正因為如此，本實驗選擇用 EGTA 螯合胞外鈣離子來觀察 NHDF 趨電性的改 變，結果與將 NHDF 培養在膠原蛋白上相 似。相關實驗結果指出，有可能是因為電 場刺激 NHDF 使其釋放胞器中的鈣離子， 讓胞內鈣離子濃度增加，所以增加其移動 速度[4]。且鈣離子因為電場作用而堆積在 細胞靠近負極的一端，使得 NHDF 定向移 動更加明顯。 肌動蛋白 actin 的聚合和單體化過程 是細胞移動重要的一環[5]。抑制 F-actin 的
聚合使得 NHDF 在電場中失去特定的移動 方向且移動速度相當緩慢，顯示 F-actin filament 不 僅 影 響 正 常 的 細 胞 移 動 ， 在 NHDF 的趨電性中也相當重要。 許多相關的實驗指出，各種形式的 PKC 對不同細胞的趨電性有不同的影響， 例如：抑制 PKC-使得內皮細胞在體外培 養的情形下無法移動[6]，而人類的神經膠 細胞倚靠 PKC-來傳遞跟細胞移動有關的 訊息[7]。本實驗發現，NHDF 與趨電性相 關的激? 為 PKC-及 PKC-1。另外，與 PKC 有 著 密 切 關 係 的 訊 息 傳 遞 分 子 為 ROS，抑制了 ROS 的活性之後，NHDF 在 電場中也失去了定向移動的能力，且移動 速度也降低。Rosado 指出 hydrogen peroxide (ROS 的一種)可以增加 pancreatic canard cells 中 actin filament 的含量，且跟細胞自 我修復的能力有關[8]。另外，ROS 也會促 進血管內皮細胞的 actin fiber 形成[9 ]。所 以抑制了 ROS，可能使得 NHDF 細胞中的 actin filament 量無法增加，進而造成 NHDF 速度減慢且失去定向移動能力。 六、結論 NHDF 在電場中的趨電性會受到培養 基質不同和許多與細胞移動相關的分子影 響。將 NHDF 培養在常用的基質材料上(包 括 TCPS、膠原蛋白、明膠和幾丁聚醣)都 會 使 得 NHDF 的 移 動 速 度 加 快 ， 但 是 NHDF 移動的方向與控制組(玻璃表面)沒 有太大的差異。而螯合胞外鈣離子會使得 NHDF 移動加快且移動方向更加一致地朝 向正極，原因可能為電場刺激 NHDF 使胞 內鈣離子濃度增加且造成靠近負極一端濃 度較高的濃度梯度。而抑制 F-actin 的生成 使得 NHDF 失去趨電性，顯示 F-actin 為 NHDF 表 現 趨 電 性 過 程 中 重 要 的 cytoskeleton 之一。相似的實驗結果也出現 在抑制了 cPKC 和 ROS 的實驗中，代表這 兩種胞內訊息傳遞物質在 NHDF 的趨電性 中也佔有相當重要的地位。 七、參考文獻
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+
electric field direction-
cathode. toward perfectly migrate Cells : 1 randomly. migrate Cells : 0 anode. toward perfectly migrate Cells : 1 n cos cos ss Directedne Average n
Fig. 1 A drawing outlines the method to quantify the directedness of the average cellular translocation.
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Fig. 2 The average directedness and velocity of NHDF on different substrata in 1 V/cm EF.
Fig. 3 The average directedness and velocity of NHDF under different chemical treatments in 1V/cm EF. Table 1 The average directedness and velocity of NHDF
on different substrata in 1V/cm EF.
Substratum cos/n Average Velocity (m/hr)
Glass (control) -0.37±0.12 3.64±0.26 TCPS -0.50±0.15 16.27±2.18 Collagen -0.26±0.02 22.45±0.88 Gelatin -0.34±0.07 22.24±0.56 Chitosan -0.48±0.01 27.16±0.01
Table 2 The average directedness and velocity of NHDF
under different chemical treatments in 1V/cm EF.
Treatment cos/n Average Velocity (m/hr)
Control -0.37±0.12 3.64±0.26 EGTA -0.66±0.06 8.64±1.04 Cytochalasin D -0.12±0.04 1.12±0.22 Go6976 -0.04±0.04 22.24±0.56 NAC -0.48±0.01 27.16±0.01 Blank TCPS glass colla gen gelatin chito san Fl uo re s c en c e i n te n s ity 0 5 10 15 20 25 30
Fig. 4 Fluorescence intensity of FITC-
conjugated BSA adsorbed on different substrata. Average Directedness (Cosn) -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 control EGTA cytochalasin D Go6976 NAC Average velocity (m/hr) 0 2 4 6 8 10 12 14 Average Directedness (Cosn) -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 glass TCPS collagen gelatin chitosan Average velocity (m/hr) 0 5 10 15 20 25 30
