一、癡呆症：

I. 前言：

一、癡呆症：

失智症又稱癡呆症（ dementia）是一個臨床症候群的統 稱，其中又以發病原因加以分類 ⁽¹⁾ ：1. 多發性腦梗塞癡呆症

（vascular dementia）：由長期高血壓、腦動脈硬化或腦栓 塞導致腦部血液供應不足或中風後使腦神經細胞功能受損 所引起。2. 外傷引發性癡呆症（trauma dementia）：由於 腦部受到外來傷害而直接使神經細胞受到創傷所引起的功 能性退化表現。3. 阿茲海默氏症（Alzheimer’s disease；

AD）：與腦部傷害無關單純為一種老化過程引起的神經功能 退化 ^(2,3) 。

二、阿茲海默氏症：

1. 簡介：

阿茲海默氏症約佔所有癡呆症患者的 50~60% ⁽⁴⁾ 。在美

國，阿茲海默氏症據估計就有超過 400 萬人罹患此病且在成

人死因排名第四位，僅次於心臟病、癌症及腦中風，每年需

花費 1000 億美元以上來照顧這些患者。更令人怵目驚心的

是，若不能即時發展出有效的防治方法，估計全球該病的患

者數在公元 2025 年將突破兩千兩百萬，屆時造成的損失恐

逆的進行 ^(5,6) 。由於初期症狀與伴隨正常老化出現的某些生理 及心理狀況相似，因此不易被診斷出來。通常在發病的初期 患者並不自知，當發覺症狀到就醫診斷確定為阿茲海默氏症 時，其病程可能都已有兩、三年了。

2. 臨床症狀：

此 病 在 臨 床 上 常 見 的 初 期 症 狀 為 記 憶 力 逐 漸 的 衰 退 如：輕微的忘記，東西常找不到或放錯地方，說話前後不太 連貫，而且會重覆某些字眼或動作等。逐漸的，記憶力的減 退越來越嚴重而影響社交生活或工作能力，通常在此時才會 被家屬、親友或同事所注意。並且其判斷能力、抽象思考、

計算能力均會發生障礙，而且個性及舉止上也會有異常的改 變。當症狀越嚴重時，常會因方向感喪失而迷路，甚至晚上 起來上洗手間時，也會因找不到廁所或無法回到自己的臥 房。在情緒方面喜怒哀樂無法正確的表達及突發性的失控，

也會誤認朋友及家人及有妄想或幻想及被害的想法。此時，

不僅無法工作，連生活起居都需人照顧。在後期一直到嚴重

時，會因行動困難最後終於臥病在床。通常自就醫診斷到死

亡時間約五到十年甚至更長，引發死亡的主因為生理病徵所

導致的營養不良及感染併發症如：肺炎、尿道感染… … 等 ^(7,8) 。

Ø Typical occurrence of manifestations of Alzheimer's disease.

（National history of Alzheimer's disease, 1996.）

3. 病理特徵：

阿 茲 海 默 氏 症 又 稱 老 年 痴 呆 症 是 慢 性 腦 神 經 細 胞 退 化

（neuron degenerative disease ）所造成的疾病。在 1907

年由德國的神經病理學家阿茲海默（Alois Alzheimer）首先

發現 ⁽¹⁰⁾ 。在解剖學上，阿茲海默氏症患者與正常人的腦部比

較 下 發 現 幾 項 具 代 表 性 的 特 徵 ⁽⁹⁾ ： 1. 大 腦 萎 縮 （ brain

atrophy） ：在解剖後發現阿茲海默氏症的腦溝較明顯，在神

經細胞的數量上隨著發病時間的增加，細胞減少的數目越明

顯，平均少於同齡對照組約 50% ⁽¹¹⁾ ，神經細胞減少的區域包

含了有海馬迴的 CA1 區、邊緣皮質（Entorhinal cortex）第 2、4 層、相關皮質（Association cortex）第 3、5 層。 （表 一 、 二 ） 2. 神 經 細 胞 內 出 現 許 多 神 經 纖 維 糾 結

（Neurofibrillary tangle；NFT）的現象。3. 神經細胞外出現 許多的老年性斑塊（ Senile plaque；SP）的過量堆積，雖然 在 大 腦 皮 質 也 有 表 現 但 是 最 集 中 的 區 域 是 在 海 馬 迴

（hippocampus）以及相鄰的杏仁核（ amygdala）區域聚集 最多 ⁽¹²⁾ 。但此斑塊在腦內的存在是否與神經細胞死有直接的 關係，目前正被許多研究熱烈的討論中。

在高等動物裡海馬迴是學習新事物的中心，它可以接收 各種感官所傳來的訊息並形成短期及長期記憶，而杏仁核掌 控憤怒及恐懼的情緒表現，所以當此區域的神經細胞受損時 會即刻的反應在記憶與情緒上。這可說明了阿茲海默氏症患 者記憶力逐漸減退且情緒改變的症狀。只是引發神經纖維糾 結與老年性斑塊過量堆積的原因至仍無定論，但卻有許多假 說成立；在遺傳學上的研究指出阿茲海默氏症有早發性的家 族性（Family AD）的遺傳傾向約佔 10 %，屬於早發性阿茲 海默氏症多在 50 歲之前即發病。在這些患者的腦部也發現 了 ß -類澱粉蛋白（beta - amyloid protein：簡稱 Aß 蛋白）

的過量表現。

4. 臨床診斷：

阿茲海默氏症的診斷方式，直至目前並無簡便快速的方 法。臨床上常用的標準可分為 DSM-IV 與 NINCDS-ADRDA 二種系統（表三、四），可藉由專業評估的方式來將它與癡 呆症作區別診斷 ⁽¹⁾ 。

5. 阿滋海默氏症的成因與危險因子：

阿茲海默氏症的成因頗為複雜，包含了基因突變、環境 因子與個人習性都可能影響該病的發生及進展。目前的研究 的方向主要以引發病理特徵的因素為主：

（1） 類澱粉蛋白過量堆積所產生的老年性斑塊。

（2） tau 蛋白質磷酸化後所產生神經纖維的糾結表現。

（3） 血管脂化蛋白 E4（ Apolipoprotein E4；APOE4 ）促 進類澱粉蛋白堆積的協同作用 ⁽¹³⁾ 。

（4） 早老素（Presenilin I、II：PS）的過量表現 ⁽¹⁴⁾ 。 不少研究已找出與此病相關之危險因子。目前所公認之 危險因子有三：

(一) 年齡：年齡是罹患阿茲海默氏症主要危險因子，其比例

隨年齡增加而增加，且女性較男性的罹病率為高。根據

統計，在 60-85 歲之間每增加 5 歲，罹患阿茲海默氏症 的人就增加一倍。

(二) 家族史：約百分之五到十的阿茲海默氏症有家族史，如 果直系親屬中有人有此症者，則其得病的機會為一般人 之三倍。

(三) 基 因 突 變 ： 唐 氏 症 候 群 ^(15,16) 、 APP、 APOE 4 ⁽¹³⁾ 、 PS1 ⁽¹⁴⁾ 、PS2 的基因突變都會使得長片段的類澱粉蛋白 1-42、1-43 大量產生而進行堆積 ⁽¹⁵⁾ 。其中若 ß -APP 基 因之胺基酸序列的第 670 位置若發生突變（由 Lys 變 成 Asp），或第 671 位置突變（由 Met 變成 Leu），

會使 ß -APP 容易被 ß 分泌酵素切除而產生 A ß 蛋白；

另外若是第 717 位置突變（由 Val 變成 Phe、Gly 或 Isoleucine），第 692 位置突變（由 Ala 變成 Gly），

或 是 第 693 位 置 突 變 （ 由 Glutamic acid 變 成 Glutamine），都會使 Aß 蛋白產量增加，所以遺傳上 有 ß -APP 基因突變者容易早期罹病。而 PS1 的突變多 在 50 歲之前即發病，佔家族性阿茲海默氏症（familial Alzheimer’s disease; FAD）約 70~80%。（表五）

由於阿茲海默氏症目前仍無有效的治療方法及藥物，所

以對於老年化社會除了對於照顧患者的家屬是一項很艱辛

的長期奮鬥之外對於整個社會都是一項龐大的成本。

三、類澱粉蛋白：

1. ß -類澱粉蛋白：

老年性斑主要由 ß -類澱粉蛋白聚集組成。早在 1907 年阿

茲 海 默 博 士 發 表 此 疾 病 之 前 ， 德 國 的 病 理 學 家 Rudolf

Virchow 於 1853 年就已注意到這種特殊的斑塊狀的沉澱

物，並將此類沉澱物命名為類澱粉斑塊。它除了腦部之外也

可在其他的器官如血管、腎臟、尿液… … 中產生堆積，並引

發互不相甘的疾病 ^(18,19) 。於 1984 年 Glenner 和 Wong 於 AD

患 者 腦 膜 血 管 中 發 現 分 子 量 4 kDa 的類 澱 粉 蛋 白 ⁽²⁰⁾ 。

Masker 等人於次年從阿茲海默症患者大腦皮質中的類澱粉

沉積斑塊中純化出類澱粉，發現其序列含有 39 至 43 個氨基

酸且種類有很多，由不同的氨基酸排列所組成。大部份於

CSF 中類澱粉蛋白 1-40：1-42 之比例約為 10：1 ^(21,22) ，造

成阿茲海默氏症老年性斑的聚積核心主要以 1-42、1-43 個

氨基酸排列所組成的類澱粉蛋白片段居多。

Ø Beta-amyloid region of APP, showing the pathologic APP

mutation and secretase cleavage sites. （Physiological Reviews, 2001）

2. ß -類澱粉前驅蛋白：

類澱粉蛋白是由其前驅蛋白經由分泌酵素的切割後所 產生約 4KDa 的蛋白產物

³⁸

，它存在於人體腦脊髓液及血 液中並且可在許多的器官中產生堆積，如血管及腎臟並引發 病症。而在培養狀態的細胞株可以將類澱粉蛋白分泌到培養 基中被測出含量

39,40,41,42

。而其中以 1-40 片段的產量較多，

但 1-42 片段的聚集能力較強也較易聚集形成不溶性老化斑

塊

^43,44

。Kang 等人於 1987 年分離出類澱粉的 cDNA ⁽²³⁾ ，

發現該蛋白乃源自於一含 695 個氨基酸的蛋白質，將之命名 為類澱粉前驅蛋白(beta- amyloid precursor protein，簡稱 ß APP)。在電泳的分析下可發現此群蛋白質聚合物分子量的 分佈約為 110~140 KDa ⁽²⁴⁾ 。APP 為一穿膜蛋白質，存在不 同種類的細胞中，其基因位於第 2l 對染色體上，表現出之初 級 RNA 經由不同的剪接途徑（splicing）產生不同的 mRNA，

並轉譯成不同的蛋白質，主要分為 695、751 及 770 三種不

同長度序列，而在 APP 上可被切割出類澱粉蛋白的序列則

位於 C 端部分，穿含於細胞膜之中。其中 APP 695 大量的 表現於神經細胞上 ⁽²⁵⁾ ，而 751 及 770 雖在神經細胞上也有 表現但主要表現於非神經細胞上佔大多數。而 751 / 770 與 695 之間不同的地方為在胺基酸的組成序列中多了一段 56 個胺基酸組成的片段稱 Kunitz - type of serine protease inhibitor（KPI） ^(26,27) ，在 KPI 的序列上具有參與血液凝集的 重要 XIa 因子的序列。除此之外，APP 也可促進細胞間和細 胞與細胞外基質(extracellular matrix)間交互作用，其亦可促 進神經細胞軸突之延展(neurite extension)，並藉調控胞內鈣 離子的平衡而保護神經細胞 ^(28,29) 。

Ø Structure of APP types，showing some of the major functional

domains. （Alzheimer’s Disease Method and Protocol, 2000）

APP 為穿膜性的蛋白質，絕大部分裸露在細胞外，一 小部分嵌在細胞膜內。而類澱粉蛋白的產生即由切割酵素，

對 APP 序列上作專一性位置的切割後所產生的片段蛋白。

目 前 已 知 的 類 澱 粉 切 割 酵 素 （ Beta Amyloid Cleavage Enzyme; BACE）有 3 種：α、ß 及γ分泌酵素（Secretase） 。 而類澱粉蛋白就是經過 ß -分泌酵素可以切斷連接 671、672 的氨基酸鍵結，及γ分泌酵素對 APP 上 713 附近位置切割 後可產生類澱粉蛋白片段。在酵素對胺基酸序列上切割時，

除了 1-40、1-42 片段之外也會產生其餘的片段。如 APP 若 單被α分泌酵素切割產生 sAPPα與 p10 kDa 的片段，而 p10 又可被γ分泌酵素切割產生 p3 與 p7 片段，其中 p3 為一小 片段的類澱粉蛋白。另外，如 APP 若單被 ß 分泌酵素切割 產生 sAPP ß 與 p12kDa 的片段。 p12 片段也可再次被γ分 泌酵素切割產生類澱粉蛋白與 p7 片段 ^(30,31) 。這些小片段在

Ø Beta-amyloid precursor protein (APP) and its principal metabolic

derivatives. （Physiological Reviews, 2001）

腦中雖無聚集的能力，但可以證明不同型態分泌酵素的切割 活性表現。當 APP 經過 β 與γ分泌

（secretase）的分解 產生各型態的出類澱粉蛋白，其中可溶性的類澱粉蛋白並不 具毒性，必須經聚合形成纖維束（fibril）後對神經細胞才具 有毒性。類澱粉蛋白聚合物存在於腦部時，能活化腦中的微 膠細胞（microglia）及星細胞（astrocyte） ⁽³²⁾ 。此反應中會 釋放多種神經毒素、致發炎物質、一氧化氮、超氧分子等自 由基去攻擊神經細胞 ⁽³³⁾ ，造成傷害。 類澱粉蛋白在阿茲海 默氏症患者腦部中，經由未知的因素協同慢慢的進行堆積而 產生斑塊的表現，而誘導此現象的原因及引發阿茲海默氏症 的病因及其相關的機轉仍需進一步的研究。

Ø Hypothesis of Alzheimer’s disease. （Molecular Medicine Today,

四、細胞老化：

1. 老化：

老化可分為正常性的老化（normal or usual aging）與 病理性老化（pathological aging）二種。正常的老化是指生 理上或心理上沒有罹患明顯的生理疾病，隨著年齡的增長而 逐漸出現的衰退老化現象。而病理性的老化是指受疾病侵害 引發加速老化的過程，此類型與年齡並非完全相關，最典型 的例子就是阿茲海默氏症 ^(34,35) 。

生命年長衰老是緣由於細胞增長分裂到一定代數後，其

增長和分裂速度減慢導致影響正常功能的運作，例如生理上

皮膚老化､臟器衰退… … 等。當細胞在正常的運作下需有養

份的供給以執行細胞功能，在同時與體內環境形成一種平衡

的新陳代謝狀態。當環境改變或是接受了外來的刺激時細胞

會藉由體內調控機轉將蛋白質表現呈現出來。表現出的蛋白

質可以反應在細胞週期（cell cycle）的改變上，哺乳動物的

細胞週期可分為四階段：G1 期（gap 1 phase）、S 期（DNA

replication）、G2（gap 2 phase）、及 M 期（Mitosis），

有些特殊類型的細胞如：纖維母細胞、神經細胞… 會長期處 於靜止狀態，當受到特定的刺激或訊號時才會使細胞週期產 生變動。

當長期處於靜止期的神經細胞的週期產生變動時，可能 使細胞導向凋亡的途徑或是停滯表現出老化的狀態。而週期 的改變即受到許多激

與蛋白質的調控所致。

Ø Cell type and cell cycle G1 arrest.（Handbook of Aging, 1990）

2. p53 與 p21 途徑：

當細胞分裂進行時，為了檢查 DNA 的完整性可將週期 停留在 G1、G2，可避免將不正常的 DNA 複製到子代而造 成突變，而 p53 即扮演了這個檢查者的角色（check point）

(47,48,49,50)

。p53 基因位於第 17 對染色體上於 1979 年被首度 發現，又稱腫瘤抑制基因。其產物為 53KDa 的蛋白質，它 對 於 調 節 細 胞 週 期 的 進 行 與 參 與 細 胞 凋 亡 的 途 徑 非 常 重 要。在正常的人體中 p53 的含量很低，當細胞受到外來物質、

輻射或自由基的影響，使 DNA 受損時才會促使 p53 蛋白質 大量表現，進而讓週期停於 G0/G1 期並進行修補的工作。

當 DNA 無法修復完全時，則促使細胞走向凋亡以維持 衡定狀態。而 p53 蛋白質所主導的功能有以下幾種：

1. 刺激 p21 基因發生變動：p21 為推動細胞週期前進的 CDK

（cyclin dependent kinase）之抑制性蛋白，當 p21 被活 化時可以由抑制 CDK 使細胞週期停滯於 G1 ^(53,54) 。 2. 刺激 DNA 修補基因表現：當 DNA 受損時會引發 p53 表

現增加，阻止細胞進入 S 期並同時促進修補 DNA 的基因

產生變動，將不正常的 DNA 在複製之前進行修復，但其

機轉至今仍不清楚。

3. 刺激 Bax 基因的表現：當受損的 DNA 無法進行修補時，

p53 可 促 進 其 下 游 之 一 的 bax 表 現 導 致 ”細 胞 凋 亡 ”

（Apoptosis），使已產生變異且無法修復的細胞死亡。

若已產生變異的細胞無法走向凋亡，則會帶著變異的 DNA 進行複製藉由細胞分裂將錯誤的訊息傳遞到子代而產 生許多的疾病，癌症就是一種典型的疾病。p53 的存在可使 細胞的複製錯誤減低，並選擇性的將已失去功能的細胞自然 的進行淘汰，維護正常的生理功能。

Ø The p53 pathway.（Mol. Cell. Biochem, 1998.）

p53 之所以可以調節細胞週期進行的原因，是藉由促進 其下游 CDK 的抑制性蛋白 p21 蛋白質表現的緣故。在目前 的研究中指出當細胞老化時，會減弱或無法進行正常的訊息 傳導、新陳代謝… … 進而表現於生理上產生病徵。在 DNA 損害及老化表現的細胞中，p21 的過量的表現可促使細胞週 期停滯，而引發了相關的疾病如：動脈硬化症、阿茲海默氏 症、類澱粉沉積症、及關節炎等。所以在老化發生的過程中，

當 DNA 受到損害時可促使 p53 蛋白質表現上升，而引發下 游 p21 增加，同時使得細胞週期停滯於 G1 導致影響正常功 能而表現出老化現象。

Ø The p21 pathway. （Molecular Biology 3th.）

五、研究目的：

雖然引發阿滋海默氏症神經老化性表現的原因目前仍 無定論。但是綜合以上所述，我們可知類澱粉蛋白所堆積的 老年性斑塊為阿茲海默氏症的病理特徵，但類澱粉蛋白的存 在是否與神經細胞的老化過程有關目前仍未被探討。

所以我們藉由體外初代培養胚胎大白鼠海馬迴神經細

胞添加 10µM 澱粉蛋白 1-42 及以去血清方式刺激永久表現

APP ₆₉₅ 細胞株後，觀察澱粉蛋白的存在是否會影響神經細胞

中可調節細胞週期的 p53 與 p21 蛋白質。以能更深入了解類

澱粉蛋白對神經細胞老化的影響，並有助於對阿茲海默氏症

的治療。

II. 材料：

1. 細胞來源與處理：

（1）SD 大白鼠海馬迴神經細胞初代培養（SD primary hippocampus neuron cell culture）：

以體外大白鼠海馬迴神經細胞初代培養模式為材料進

行實驗 ^(56,57,58) 。取懷孕第 18 天之 SD 大白鼠，施以頸椎分

離後快速取出胚胎，移於解剖顯微鏡下分離大腦及海馬迴並 置於 HBSS buffer（Gibco）中臥於冰上。將海馬迴及腦膜完 全分離後以電動吸管以沖吸的方式利用 HBSS buffer 打散海 馬迴組織後，將細胞懸浮液以 70μM 過濾篩（Faclone）過 濾。過濾後之細胞懸浮液再以 1500 rpm 離心 5 分鐘後以初 次培養基內含：DMEM medium（Gibco） 、2% B-27（Gibco） 、 10% 馬 血 清 （ Hyclone ）、 1% Penicillin / Streptomycin

（Gibco）、0.5mM glutamate（Sigma）均勻沖散細胞。

均勻沖散初次培養基內細胞懸浮液後取 150µl 加入細胞

染劑 150µl Tryphen blue（Gibco）並混合均勻，靜置 1 分鐘

後以毛細管將細胞液注入細胞計數器中在顯微鏡下觀察計

數。其判別方法為核內染上色為死細胞，核發亮代表活細胞 為條件下共計數四個視野求其平均值代入公式：

每 ml 之細胞數為：count ×2×10 ⁴

計算出所需細胞數並培養於已 coating Poly-D-Lysin

（Sigma）之培養皿上。於 4 小時後觀察細胞狀況並更換培 養基（為除去 10%HS 之初代培養基） ，於 37℃、5%CO ₂ 條 件 之 培 養 箱 中 生 長 。 第 三 天 再 次 更 換 培 養 基 （ 為 除 去 10%HS 及 2%B-27 之初代培養基）後於第四日加藥進行實 驗。將神經細胞培養 1×10 ⁷ / ml 細胞於 10cm 培養皿或 4×10 ⁵ / ml 細胞於 3.5 cm 培養皿後，於 6、12、24、48 及 72 小時 加入 10µM ß -amyloid（1-42）後觀察細胞變化。

（2）CHO cell line：

中國倉鼠卵巢細胞株（Chinese hamster ovary cell line）

以 DMEM 培養基內含 10%FBS 培養於 37℃，5% CO ₂ 狀態。

將細胞於 80%培養密度時，以去血清之培養基培養 24 小時

後再以加入含 10% FBS 培養基觀察 6、12、24、48 及 72

小時後觀察細胞變化。

（3）APP cell line：

為 CHO 細胞株轉入永久表現 APP ₆₉₅ 基因（wide type）

之細胞株。以 DMEM 培養基內含 10%FBS，G418 選擇下培 養於 37℃，5% CO ₂ 狀態。將細胞於 80%培養密度時以去血 清之培養基培養 24 小時後，再以加入正常之培養基觀察 6、

12、24、48 及 72 小時後細胞變化。

（4）ß - Amyloid（1-42）前處理：

此實驗所採用之 ß -amyloid（Calbiochem

）為 1-42 片段。將 ß -amyloid（1-42）溶於無菌水後，置於 37℃、5 天，使其老化產生聚集性蛋白質後以 10µM 為投與濃度。

2. 儀器：

a. 震盪器。

b. 照相式光學顯微鏡（Olympus，Japan） 。 c. FREEMAX Imago Pro Plus 影像處理軟體。

d. NIH Image Analysis 影像處理軟體。

e. 離心機【Microfuge

R】 （Beckman，USA）。

f. 真空乾燥機【Savant

R】 （USA）。

g. Spectrophotometer（Beckman， USA） 。 h. Bio-red miniprepare gel system（ USA） 。 i. Bio-red wet-transfer system（ USA） 。

j. Map-II gel electrophoresis system（Japan） 。 k. Flowcytometry（5400，Beckman，USA） 。

3. 試藥：

a. 30%H ₂ O ₂ （Merk，USA）。

b. Alchol（Merk， USA） 。

c. Hematoxylin（ Merk， USA） 。 d. DAB（Sigma，USA） 。

e. 10X PBS（ pH=7.4； 2.74g NaH ₂ PO ₄ .H ₂ O， 15.22g Na ₂ HPO ₄ .12H ₂ O，85g NaCl 溶於 1000ml 水中） 。 f. Isopropranol GR（Merk， USA） 。

g. Agarose（Gibco，USA） 。

h. 100bp DNA ladder（Gibco，USA） 。

i. MBI protein marker（ MBI， USA） 。 j. Ethidium Bromide（10mg/ml） 。 k. ECL-plus（ENE， USA） 。

l. Film（Bio-max，Kodak） 。 m. 顯影、定影劑（Kodak） 。

n. 化學組織免疫染色試劑組（Vector，USA） 。 o. 細胞凋亡偵測試劑組：( Cashmere , U.S.A ) p. P53 抗體（Santa-Cruz： Do-1 1:1000） 。 q. P21 抗體（Santa-Cruz：F-5 1:1000） 。

r. Alpha- tubulin 抗體（Santa-Cruz：1:1000） 。

s. Anti-mouse HRP 二次抗體（Santa-Cruz 1:1000） 。 t. TTBS（

liter

）。

u. Running buffer（Tris 9g、Glycin 43.2g 、10% SDS 30ml dilute to 3 liter） 。

v. Transfer buffer （ Tris 36.36g 、 Glycin 43.26g 、

Methanol 600ml dilute to 3 liter） 。

III. 方法：

1. 免疫組織化學染色（ Immunohistochemical stain） ：

將第 4 天初代培養海馬迴神經細胞移除培養基後以 PBS 沖洗 5 分鐘 3 次。將細胞以 4% paraformadehyde 浸漬固定 10 分鐘後以 PBS 沖洗 3 次，細胞浸置於 3%H ₂ O ₂ 十分鐘以 去除內生性因子。加入阻斷試劑(Blocking agent)於室溫下反 應 30 分鐘，以防止非特異性結合降低偽陽性；相對於對照 組，實驗組加 NSE-? (neuron specific enolase – ? primary antibody；1:1000) 抗體，於室溫下反應 1 小時，以 PBS 清 洗 5 分鐘 3 次後。加入二次抗體(secondary antibody)室溫反 應 1 小時，加入標誌試劑（labeling reagent：streptavidin / peroxidase complex）室溫下反應一小時。以 PBS 清洗 5 分鐘 3 次後以 DAB 溶液（DAB 0.05g、30% H ₂ O ₂ 67μl 溶 於 100ml 1X PB buffer）呈色 5 分鐘後以水清洗停止反應。

以 Hematoxylin 做核染色並將結果以 Image Plus 影像系統 分析。

2. 初代培養海馬迴細胞生存率( Tryphan blue 染色法)：

初代培養海馬迴神經細胞添加類澱粉蛋白 6、12、24、

48、72 小時後移除培養基。以 0.5% Trypsin/EDTA（Sigma）

將細胞剝離後，加入含 10 % 胎牛血清之培養基中止反應。

將細胞懸浮液移入離心管中，1500 rpm 離心 5 分鐘。以 PBS 均勻沖散初次培養基內細胞懸浮液後取 150µl 加入細胞染劑 150µl Tryphen blue（Gibco）並混合均勻，靜置 1 分鐘後以 毛細管將細胞液注入細胞計數器中。於顯微鏡下以核內染上 色為死細胞，核發亮代表活細胞為條件下觀察計數。

3. 細胞凋亡之偵測 ( TUNEL-like 偵測法 )

初代培養海馬迴神經細胞添加類澱粉蛋白 6、12、24、

48、72 小時後移除培養基。以 4 % paraformadehyde 浸漬 固定細胞 10 分鐘，加入 Proteinase K 於室溫中放置 20 分 鐘，再浸置於 3% H ₂ O ₂ 中 5 分鐘以去除內生性因子之干擾。

之後加入已配置的 TdT Equilibration Buffer，放置 30 分鐘；

後去除 TdT Equilibration Buffer，加入含 TdT 酵素的反應混

合試劑於 37℃反應 90 分鐘。接著加入 Stop Solution 反應 5

分鐘，加入 Blocking Buffer10 分鐘，拭乾後加入 Conjugate

Buffer，反應 30 分鐘後，以 DAB 呈色 10 分鐘，methyl green 作背景染色後脫水，並於光學顯微鏡下觀察並照相。

4. DNA Fragementation：

將細胞剝離後，以 1500rpm 離心 5mins，吸除上清液並

將細胞彈散。以 PBS 清洗二次後，吸除上清液，加入 0.5ml lysis buffer （ 20mMTris-HCl pH=7.4 、 10mM EDTA 、 0.2%Triton-X 100）後靜置於冰上 10mins。13000 rpm 離心 10mins。取上清液，加入 10 µl Proteinase K 與 5 µl RNase 置於 50℃ 24hrs。加入 1ml（phenol：chloroform：isopanyl Alcohol = 25：24：1）振動均勻。13000rpm 離心 10mins。

加入等量的 isopropanol 及 1 µl glycogen，-20℃放置隔夜。

將 sample 回溫後，13000rpm 離心 10mins 去上清液、加入

1ml 絕對酒精後，13000rpm 離心 10mins 去上清液。加入

1ml 70%酒精後，13000rpm 離心 10mins。去上清液後冷凍

乾燥，將所抽取之 DNA 以 DDW 溶解後注入 1.5% agarose

待 DNA 分離後，以 Ethidium Bromide 染色並於 UV 下觀察。

5. 西方轉漬法（Western blotting） : (A) 蛋白質萃取：

細胞以 PBS 沖洗 3 次後置於冰上以 0.1%SDS 刮取細 胞，保存於-80℃。

(B) 蛋白質定量法（Bradford protein assay）：

甲、 標準曲線製作：

將已知濃度之標準蛋白質溶液 1mg/ml Bovine Serum Albumin（BSA）依序稀釋等倍濃度分別為：0、50、100、

200、400 µg/µl ，由其中各取 20µl 加入 1ml 已 5 倍稀釋的 蛋白質染劑（Bio-red）中混合均勻靜置反應 10 分鐘。利用 分光光度計 595 波長檢測吸光值，再利用線性迴歸畫出標準 曲線（r ² > 0.99） 。

乙、 檢體蛋白質定量：

將萃取之蛋白質檢體置於冰水上，以超音波震動 20 秒 後立刻移於冰上靜置 20 秒，重複四次後置入沸水 5 分鐘，

快速移於冰上。取上述經沸水處理後的蛋白質 20µl 加入 1ml

已 5 倍稀釋的蛋白質染劑（Bio-red）中混合均勻靜置反應

10 分鐘。利用分光光度計 595 波長檢測吸光值，再代入標

準曲線中求出檢體的蛋白質濃度。將檢體蛋白質分裝 100µg / tube 以 Savant

濃縮乾燥後保存於-80℃。

(C) 蛋白質電泳（protein electrophoresis） ：

將已製備 7~10%的 separating gel 注入玻璃夾層中後，

上 層 加 水 以 維 持 平 衡 ， 約 20 分 鐘 凝 膠 。 將 水 倒 掉 加 入 stacking gel 插上 comb，待膠凝固後將 comb 移除加入 running buffer 至覆蓋過膠。注入 5µl marker（MBI） 及 20~30ug/ well 之檢體蛋白質。通入電流 70 伏特 2.5 小時。

(D) 蛋白質轉漬（transfer） ：

於電泳結束後將已分離之蛋白質膠體取出，並截去上 層 stacking gel。依正極至負極方向依序疊放：海綿、3M paper、蛋白質膠、已用甲醇溼潤的 PVDF 轉漬膜、3M paper 及海綿，將其組合完成後將以轉漬盒夾緊放入充滿轉漬緩衝 液之轉漬盒中（Bio-red），置於 4℃，以 100 伏特轉漬 1 小 時。轉漬完成後，取出轉漬膜並於右上方截去一角以作標 示，再將轉漬膜浸置於 5 % 脫脂奶/ TTBS 室溫震搖 1 小時。

(E) 蛋白質偵測（ Immunoblotting） ：

將 Blocking 完成之轉漬膜浸於一次抗體溶液中置於 4℃

震搖 overnight。以 TTBS 溶液沖洗轉漬膜 10 分鐘三次。加 入接有 HRP 標誌之二次抗體後置於室溫下震搖 1 小時以 上。以 TTBS 溶液沖洗轉漬膜 10 分鐘三次。加入 ECL 螢光 反應劑反應一分鐘，以 X 光片感光呈像，經顯影、定影後將 底片晾乾，以 NIH Image analysis 影像系統分析。

6. 以流氏細胞儀偵測細胞週期：

以 0.5% Trypsin/EDTA（Sigma）將細胞剝離，加入含 10%胎牛血清之培養基中止反應。將細胞懸浮液移入離心管 中， 1500 rpm 離心 5 分鐘。去上清液，加入 5ml PBS 彈散 細胞團塊後 1500 rpm 離心 5 分鐘，將上清液移除。逐滴加 入 70%EtOH（Merk）並振搖細胞懸浮液避免細胞形成團塊 至總量為 3ml。移置於-20℃保存隔夜。取出檢體， 1500 rpm 離心 5 分鐘。上清液移除後加入 5ml PBS 1500 rpm 離心 5 分鐘。移除上清液，加入 1ml Popidium Iodine stain sol’n

（PI），須避光並於 1 小時內上機。