行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
研究砷對潛伏性孢疹病毒基因調控之影響(2/3)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2320-B-006-038-執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學生物化學科（所） 計畫主持人： 吳華林 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公開查詢中
華
民
國 92 年 5 月 23 日
一、中文摘要
EB 病毒主要感染並潛伏在人體的淋巴細胞(lymphoid cell)與表皮細胞 (epithelial cell)，其藉由再活化的過程產生大量病毒，可能感染並導致 Burkitt's lymphoma、B-cell lymphoproliferative syndromes 及鼻咽癌等多種癌症。由於砷已 知會造成多種淋巴癌細胞的凋亡，因此本研究探討砷對 EB 病毒在其感染潛伏的 B 淋巴癌細胞 P3HR1 中再活化的影響。以 histone deacetylase 抑制劑 trichostatin A (TSA)處理 P3HR1 細胞，48 小時之後可明顯觀察到 EB 病毒前早期基因 BZLF 及 BRLF 的產物 Zta 與 Rta 增加，表示 TSA 會促進 P3HR1 細胞內潛伏的 EB 病毒進 行再活化。若在低細胞毒性的三價砷離子存在下，則 TSA 所誘發的 Zta 與 Rta 增加會隨砷離子處理的濃度增加而明顯降低。此外，TSA 誘發 EB 病毒再活化的 晚期基因 EA-D 亦會被砷的處理所抑制。此結果顯示低劑量的砷離子具有抑制 EB 病毒再活化的能力。我們接著研究砷對 BZLF 基因啟動子的影響，結果發現 砷也會抑制 TSA 活化 BZLF 基因啟動子，表示砷可能藉由抑制 BZLF 基因啟動 子，進而減少 Zta 蛋白的表現，及其對下游基因的調控而抑制病毒再活化。在砷 與 TSA 的研究中，發現 TSA 促進 histone acetylation 的作用並不會受砷的影響， 顯示砷可能是透過其他機轉來抑制 TSA 刺激病毒再活化。經由 BZLF 基因啟動 子系列截短的實驗，發現在啟動子-240 到-103 的 DNA 序列可能是砷影響 TSA 作用的重要片段，我們將再進一步確定砷可能影響 TSA 作用的 DNA 片段極可能 的轉錄因子。在此研究中，我們發現低劑量的砷可以抑制 B 淋巴癌細胞 P3HR1 細胞中 TSA 誘發 EB 病毒再活化基因 BZLF、BRLF 及 EA-D 的表現，亦抑制 BZLF 基因啟動子的活化，而砷的作用可能與 TSA 的抑制 histone acetylation 作用無關， 其真正的機轉仍待更進一步的探討。
二、計畫緣由與目的
Epstein-Barr virus (EBV)孢疹病毒感染與許多的人類疾病有關，包括 Burkitt's lymphoma、B-cell lymphoproliferative syndromes、Hodgkin's disease、鼻咽癌、T 細胞淋巴瘤(T-cell lymphomas)等(1, 2)。EB 病毒感染人體後，會持續潛伏在淋巴 細胞(lymphoid cell)與表皮細胞(epithelial cell)，以及出現再活化的現象(3)。EB 病 毒的再活化可能會使得病毒大量產生，進而感染其他的組織，導致更嚴重的危害 (3)，例如 Burkitt's lymphoma、B-cell lymphoproliferative syndromes 及鼻咽癌等多 種癌症(4-7)。
EBV 病毒可透過前早期基因 BZLF1 的表現，促使在潛伏感染細胞內的病毒 產生再活化的現象(8-14)。BZLF1 基因的產物(Zta)亦具有轉活化子(transactivator) 的特性，可以自我活化 BZLF1 基因的啟動子，並活化另一前早期基因 BRLF1 的 啟動子(15)。BRLF1 基因的表現也會促使病毒的再活化，其產物 Rta 蛋白可以再 回饋活化 BZLF1 基因的啟動子(16-18)。因此，EBV 病毒可藉由 Zta 與 Rta 的表 現及相互調控，再活化其他下游基因，並啟動一連串基因的表現，而使 EBV 病 毒由潛伏狀態轉向再活化狀態。
砷是廣泛存在於地球的金屬，長期暴露在高砷的環境中，對於人體有相當大 的危害(149)。在台灣，長期飲用含高砷飲水的居民，可能導致烏腳病、血管疾 病及癌症較高的罹患率(19-22)。在實驗室的研究，發現砷暴露會使細胞的 DNA 受損，並會造成染色體的異常及不穩定(23-26)，以及細胞轉型及癌化的現象 (27,28)。最近砷被用來治療急性前骨髓性白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)，其會促使此種不正常增值之淋巴球凋亡(apoptosis)(29)。此外，砷亦會促 進其他類型淋巴癌細胞的凋亡(30)。
在本計畫中，以 EB 病毒感染之 B 淋巴癌細胞 P3HR1 為對象，探討砷對此 細胞的作用及病毒再活化的影響。我們發現砷在低細胞毒性的狀態下，會抑制 trichostatin A(TSA)所誘發的 EB 病毒前早期基因 Zta、Rta 及早期基因蛋白 EA-D 的表現，顯示砷可能會抑制 TSA 所誘導之 EB 病毒再活化。
三、結果與討論
具 EB 病毒感染潛伏之 Burkitt’s lymphoma B 淋巴癌細胞 P3HR1，以 300 nM 的 TSA 處理 48 小時後，以 lysis buffer(50 mM Tris-Cl pH 8.0, 130mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% NP-40 )溶解，再以 10000 rpm 離心 15 分鐘，收集上清液（此 為細胞溶解物）進行電泳實驗，接著以 Zta、Rta 及 EA-D 等蛋白的抗體進行西 方墨點實驗來分析細胞中這些病毒再活化蛋白質的變化。結果發現 TSA 會造成 P3HR1 細胞中的 Zta、Rta 及 EA-D 等蛋白量增加，表示 TSA 的處理會導致 P3HR1 細胞中 EB 病毒的再活化（圖一）。若以不同劑量的 Na2AsO3與 TSA 共同處理 P3HR1 細胞，發現 TSA 所誘發的 Zta、Rta 及 EA-D 等蛋白表現增加會被此三價
砷離子抑制，而抑制的程度會隨砷離子處理的劑量提高而增加（圖一）。為確定
此抑制現象是否與砷離子所造成的細胞毒性有關，分別收集不同劑量之砷離子及 TSA 處理之細胞，以 0.05% trypan blue 染色方法檢測死亡細胞之比例，結果發現 砷離子 4µM 與 TSA 共同處理 48 小時的情況下，細胞仍有 90％以上的存活率， 顯示砷離子導致的病毒再活化蛋白表現抑制現象，並不是砷離子造成細胞死亡而 造成的結果。此實驗結果表示三價砷離子可能具有抑制 EB 病毒再活化的功能。 為了解砷是如何抑制 EB 病毒的再活化，我們研究砷對病毒再活化過程中最 起始相關之基因 BZLF 的表現。由於 BZLF 基因表現的產物 Zta 蛋白已知會被砷 抑制，因此測試調控 BZLF 基因表現的啟動子是否也受砷離子的影響。我們先將 BZLF 基因啟動子接在螢光脢報告基因之前，藉由偵測螢光脢的活性變化可反映 出啟動子的活性變化。將此構築好之報告基因系統載體以電擊法（960 µF, 200V） 送入 P3HR1 細胞內，再將細胞平均分至所需之實驗組，最後分別以不同劑量的 砷離子與 TSA 處理 24 小時後，分析螢光脢的活性。結果與病毒再活化蛋白表現 的數據一致，TSA 可以活化 BZLF 基因啟動子的活性，而砷離子的存在會抑制此 活化現象，且砷處理的劑量越高，抑制效果越明顯（圖二）。這顯示病毒再活化 過程中，起始的 BZLF 基因表現就被砷離子抑制，致使下游之相關基因表現也都 隨之降低。
接著我們探討砷離子是否直接影響 TSA 的作用而產生抑制效果。發現 TSA 確會誘使 P3HR1 細胞之 histone H3 及 H4 保持 acelylation 的狀態，但砷離子卻不 會改變此現象（圖三），表示砷離子不會影響 TSA 抑制 histone deacetylase 的作 用。這顯示砷是透過其他的機轉來抑制 TSA 誘發病毒再活化。
由於砷離子可以抑制 TSA 對 BZLF 基因啟動子的活化作用，所以再深入的 探討啟動子中是否有特定的 DNA 序列及相對應的轉錄因子會受砷及 TSA 的影 響。我們將系列截短之啟動子構築於螢光脢報告基因載體，送入細胞後再分別處 理 TSA 及不同劑量之砷離子。結果發現在-240 到-103 的 DNA 片段可能是 TSA
調控的主要區域，而砷離子也可能是透過該區域而影響 TSA 的作用（圖四）。根
據文獻指出，這一段 DNA 序列包含有 ZIA、ZIB、ZIC、ZIIA 及 ZIIIA 等已知之 病毒再活化相關轉錄因子的結合位置，我們計畫在這些區域分別製造突變以破壞 轉錄因子的結合位置，以更進一步瞭解 TSA 及砷離子可能的作用機轉。 從上述的研究發現，TSA 會誘發 P3HR1 細胞中 EB 病毒再活化相關基因的 表現，而砷離子的存在會抑制此現象。但砷離子卻不會影響 TSA 所造成的 Histone H3 及 H4 acetylation。進一步的實驗分析表示砷離子與 TSA 可能影響到 BZLF 基 因啟動子的區域而產生作用。 四、參考文獻
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圖一、TSA 與砷離子(As3+)對 P3HR1 細胞中 Zta、Rta 及 EA-D 等蛋白的影響。
0
1
2
3
4
5
Untreated
TSA
TSA+As0.25
TSA+As1
TSA+As4
As0.25
As1
As4
Fold-induction
A (-2258) ＜＜ ΔZ(RZluc) 77 % (-240) ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─────── Zp-W-8 74 % (-103) ─ ─ ─ ─ ─ ── Zp-NS1 44 % (-78) ─ ─ ─ ─ ─ Zp-NS2 29 % (-54) ─ ─ ─ ─ Zp-NS3 53 % B
