主 编 分册主编 编写人员

主 编 分册主编 编写人员

汪 忠 汪 忠 李其柱

汪 忠 姚玉琴 李其柱

李 伟 王小平 王苏豫

刘继祥 李朝晖 宋世亮

梁 平 虞蔚岩

同学们^，当你们畅游在知识海洋时^，可曾想到^，生物科学与人类社 会的关系比其他科学更为密切^；当你们漫步在科学丛林时^，可曾感知^， 生物科学就在你我的身边^……

回顾生物科学近百年来的发展史^，许多重大的事件^，如孟德尔遗传 规律的发现^、基因学说的创立^、ＤＮＡ分子双螺旋结构的确定^、人类基因 组计划的完成^……仿佛还在昨天^；许多伟大的科学家^，如孟德尔^、摩尔 根^、沃森^……仿佛就在眼前^。 在如今这瞬息万变的时代^，生物科学在迅 猛地发展^，基因工程^、生物克隆^、生物芯片等成果的取得^，引起了全世界 的广泛关注^。 与此同时^，我们还应该知道^，千百年来^，在这些伟大成果的 背后^，有许多默默无闻的工作者和无数平凡的事情^，所有这些都是生物 科学发展进程中不可或缺的^、充满生命活力的组成部分^！

２０世纪后期^， 生物科学在物理学和化学等学科发展的基础上取得 了长足的进展^，已经深入到分子水平探究生命活动的本质^。 一般来说^， 新生的交叉学科在很大程度上是未来科学的先驱^， 而生物科学的研究 领域正是产生这些新生学科科学启蒙思想的沃土^。 难怪许多科学家早 就预言^，２１世纪生物科学将是自然科学中最为活跃的学科之一^。

当今^， 人类生存环境恶化的倾向对以造福人类为理想目标的科学 提出了严峻的挑战^，人们对科学进一步发展的期待日益迫切^。 生物科学 在迎接挑战中^，不断地丰富着自己^。 随着数学^、技术科学^、物理学^、化学 等学科的不断渗透交融^，２１世纪的生物科学必将取得更加重大的突破^， 呈现出更加欣欣向荣的景象^。 生活在这样一个激动人心的生物科学时 代^，我们怎能不兴奋呢^！

千鸟竞翔^，万马奔腾^，是生命的一种壮美^；ＤＮＡ分子的双螺旋^，是生 命的一种结构美^……同学们^，生物科学中蕴含着各种形态的美^，让我们 在追求美的同时^，也用美去感染你我身边的每一个人^！

编 者

２０14

年

月

绪 论 实实验验开开启启生生物物科科学学王王国国的的大大门门

科学实验揭开了

分子结构之

……… 谜

2

实验开启生物科学王国的大

……… 门

4

第一节 运用发酵技术加工食 品 ……… ³⁷

边做边学 水果的发酵加工

制作果酒和果

……… 醋

39

边做边学 豆制品的发酵加工

制作腐 乳 …

边做边学 蔬菜的发酵加工

制作泡 菜 ……

第二节 测定发酵食品中的特定成 分 ……… ⁴⁵

课题研究 泡菜中是否含有亚硝酸 盐 …………

课题研究 蔬菜在腌制过程中维生素

含量的变

……… 化

50

第二章 发酵技术实践

第一章 无菌操作技术实践

第一节 微生物的分离和培 养 ……… ^８

边做边学 大肠杆菌的接种与分离培养 ………

第二节 分离特定的微生物并测定其数 量 …… ¹⁷

边做边学 以尿素为唯一氮源的土壤微生物的分离

培 养与数量测定 ………

课题研究 分离土壤中能分解纤维素的微生物

第三节 植物组织培养技 术 ……… ²⁶

边做边学 天竺葵的组织培 养 ………

第四章 生物化学与分子生物学技术实践

第一节 生物成分的分离与测定技 术 ………… ⁷¹

边做边学 血清蛋白醋酸纤维薄膜电 泳 _………

课题研究 凝胶色谱法分离血红蛋 白 …………

边做边学 水蒸气蒸馏法提取橘皮中的芳香 油 …

第二节 分子生物学技 术 ……… ⁸³

边做边学 目的

片段的体外扩 增 …………

附 录

………

………

………

……… … 附录 ^１ 生物科学实验规 则 ……… ⁹³ 附录 ^２ 实验试剂的配 制 ……… ⁹⁶ 附录 ³ 显微观察和测量细 胞 ……… ¹⁰⁰ 附录 ⁴ 生物科学实验的设计与实 施 ……… ¹⁰² 附录 ⁵ 生物科学实验结果的分析与总 结 … ¹⁰⁵

………

………

………

……… …

第三章 酶的应用技术实践

………

…………

………

…………

第一节 酶的制备和应 用 ……… ⁵⁶

边做边学 制备果胶酶并观察其作 用 …………

课题研究 探究洗衣粉中的酶在洗涤中的作用

第二节 固定化酶的制备和应 用 ……… ⁶³

边做边学 酵母菌细胞的固定化技 术 …………

………

…………

………

…………

绪 论

● 科学实验揭开了 ^DNA 分子结构之谜

● 实验开启生物科学王国的大门

实

实验 验开 开启 启生 生物 物科 科学 学王 王国 国的 的大 大门 门

生

生物物科科学学的的每每一一次次重重大大发发现现都都证证明明科科学学实实验验是是开开启启 生

生物物科科学学王王国国大大门门的的钥钥匙匙。。 随随着着现现代代生生物物学学实实验验技技术术的的 快

快速速发发展展，， 一一扇扇扇扇生生物物科科学学王王国国的的大大门门也也必必将将随随之之而而打打 开

开。。 中中学学生生物物学学实实验验教教学学不不仅仅是是生生物物学学科科教教学学的的组组成成部部 分

分，，更更是是培培养养创创新新精精神神和和提提高高实实践践能能力力的的主主要要载载体体。。 积积极极 主

主动动地地参参与与生生物物技技术术实实践践吧吧！！

组织培养实验室

实

实验验开开启启生生物物科科学学王王国国的的大大门门

生物科学是一门实验科学^。 从某种意义上说^，生物科学实验技术和方法的创新^，是推动生 物科学理论飞速发展的直接动力^。 因此^，生物科学实验被认为是开启生物科学王国大门的钥 匙^。正是因为生物科学实验技术和方法的不断进步^，极大地推动了生物科学的迅猛发展^，才使 得生物科学对整个人类生活和生产活动的影响日益增大^。

科学实验揭开了 DNA 分子结构之谜

生物科学是一门历史悠久的学科^{。 １６～１８}世纪^，生物科学 的突出成就是一些分支学科的先后建立和发展^，如解剖学^、生 理学^、分类学^、胚胎学等^。１９世纪是生物科学全面发展的世纪^， 细胞学说^、生物进化论和遗传理论就在此期间创立^，它们被誉 为现代生物科学的三大基石^。２０世纪^，伴随物理学^、化学^、数学 等学科的发展以及计算机技术的广泛应用^， 生物科学的面貌 发生了巨大的变革^，从静态的^、定性描述性的学科向动态的^、 定量实验性的学科转化^， 人类基因组计划的完成则标志着生 物科学新时代的开始^。 若追溯起来^，人们不会忘记²⁰ 世纪中 叶沃森 ^{（Ｊ．D.Ｗａｔｓｏｎ） 、} 克里克 ^{（Ｆ．Ｃｒｉｃｋ） 、} 威尔金斯^（M．

Willkins）和富兰克林^（Ｒ．E.Ｆｒａｎｋｌｉｎ）等许多科学家的科学实验 成果^。

积极思维 科学实验揭开了 ^DNA分子结构之谜

事实：

１９５３年^，沃森和克里克确立了^ＤＮＡ分子的双螺旋结构 模型^，开创了生物科学的新纪元^。而此前孟德尔^（Ｇ． J. Ｍｅｎｄｅｌ）

的遗传实验^、格里菲斯^（Ｆ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）等的肺炎球菌实验^、赫尔 希^（Ａ． Ｄ． Ｈｅｒｓｈｅｙ）等的噬菌体实验^、富兰克林与威尔金斯 给出的^ＤＮＡ晶体结构的^Ｘ射线衍射照片等^，都为揭开^ＤＮＡ 分子结构之谜奠定了坚实的基础^。

沃森看到富兰克林¹⁹⁵² 年拍摄的^DNA结构的^X 射线 衍射照片后受到启发^，认定^DNA应该是双链结构^。沃森和克 里克循着这个思路深入研究探讨^，终于在¹⁹⁵³ 年³月⁷日^， 将美丽无比的^DNA分子双螺旋结构模型搭建成功^， 正确地 反映出^DNA分子的空间结构^。 这是一个无比伟大的时刻^，从 此生物学研究从细胞生物学阶段发展到了分子生物学阶段^。

威尔金斯被列为发现^DNA分子双螺旋结构的第三人^，而富 兰克林则是发现^DNA分子双螺旋结构的真正的^“幕后英雄^”。

生物科学在^２０世纪已经取得了诸如^DNA分子结构的揭示 等举世瞩目的成就^，在自然科学的发展中也处于领先地位^，并正 向着前所未有的深度和广度迅速地发展^。

富兰克林在威尔金斯的研究室里^，富兰克 林通过反复实验^，成功地拍到了显示

DNA具有螺旋结构的^X射线衍射照 片^。威尔金斯将这些照片提供给沃森 和克里克^， 这是后者发现^DNA具有 双螺旋结构的主要实验依据^。

威尔金斯威尔金斯原来是物理学家^，后转 向生物学研究^。他用物理学方法研究 染色体和^DNA的结构^， 也开展拍摄

DNA 的 ^X 射 线 衍 射 图 像 的 实 验^。

1962年^， 他与沃森和克里克一起荣 获诺贝尔生理学或医学奖^。

克里克克里克原来是物理学家^，后来才 转向生物学研究^{。 37}岁时^， 他与²⁵ 岁的沃森合作^， 发表^DNA具有双螺 旋结构的论文^，后来他又提出了^“中 心法则^”等理论^{。 1962}年^，克里克与 沃森及威尔金斯共同获得诺贝尔生 理学或医学奖^。

富兰克林得到的^DNA晶体结构 的^X射线衍射照片^。

图¹ 科学实验揭开了^DNA分子结构之谜

分析：为什么说是科学实验揭开了^DNA分子结构之谜^？

科学实验实现了哺乳动物的克隆

１９９７年^，英国科学家们采用哺乳动物体细胞克隆出 绵羊^。 科学家为此进行了^２７７次克隆实验才获得成功^。

实验开启生物科学王国的大门

从生物进化论和细胞学说的创立^， 到基因靶向技术的 发明^、多利羊的诞生和杂交水稻的成功培育等^，这些重大成 果的取得都证明了实验是开启生物科学王国大门的钥匙^。

图^２ 实验开启生物科学王国大门的实例

生物科学实验

施莱登 施旺

科学实验开创了稻谷培育的新纪元

20世纪⁷⁰年代初^，袁隆平利用其助手发现的自 然不育株^（雄性不育^）作为杂交水稻的育种材料^，提 出了水稻杂种优势利用的观点^， 打破了世界上自花 受粉作物育种的禁区^， 实现了杂交水稻培育的历史 性突破^，从而大幅度地提高了水稻的产量^。 袁隆平因 此被称为^“杂交水稻之父^”。

科学实验成就了基因靶向技术

2007年诺贝尔生理学或医学奖获得者为美国人 卡佩奇^（M. Capecchi） 、史密斯^（O. Smithies）与英国人 埃文斯 ^{（M. Evans），} 他们的杰出成果是基因靶向技 术^。迄今为止^，通过该技术已有一万多个小鼠基因被 敲除^，从而确定了单个基因在健康和疾病中的作用^。 科学实验创立了细胞学说

施莱登^（Ｍ． Ｊ． Ｓｃｈｌｅｉｄｅｎ）和施旺^{（Ｔ． Ｓｃｈｗａｎｎ）}分别于

１８３８年和¹⁸³⁹年独立提出^“细胞学说^”，这是科学家积

１７０余年的实验成果所获得的重大发现^。

纵观生物科学的发展史^，每一次里程碑式的进展无不源于 重大的实验成果^。随着生物科学理论与技术的不断进步^，它对人 类的生活^、生产和社会发展将会产生更加深远的影响^。

事实：

1. 袁隆平对人类的贡献之大、影响之深，是世界公认的。

他自己说过：“我做了一个梦，梦见了水稻植株长得像树，稻谷 长得像苹果那么的硕大， 那么的沉甸甸， 把树枝都压弯了

……”这是他日有所思、夜有所梦的结果。 正是为了实现这个 梦想， 年逾古稀的袁隆平一直还在为亩产吨粮田的目标而默 默耕耘着，孜孜践行着。 袁隆平“千里之行，始于足下”的追梦 征程就是科学实验和探索的过程，这使他的事业越来越辉煌，

创新越来越备受瞩目，梦想越来越接近实现。

因为水稻是雌雄同花、自花受粉 的作物，难以一朵一朵地去掉雄花进 行杂交。这就需要获得一个雄花不育 的稻株，即雄性不育系，然后才能与 其他品种杂交。 这是一个世界难题。

袁隆平知难而进，他认为，雄性不育 系的原始亲本，可以是一株自然突变 的雄性不育株， 因此也能天然存在，

而中国有众多的野生稻和栽培稻品 种，蕴藏着丰富的种质资源，“外国没 有搞成功的，中国人不一定就不能成 功”。

为此，袁隆平迈开了双腿，走进 了水稻的莽莽绿海，去寻找这从未见

过，而且中外资料也没报道过的水稻雄性不育株。 时间一天天 过去，袁隆平头顶烈日，脚踩烂泥，驼背弯腰地一穗一穗地观

察寻找。“功夫不负有心人”，他和他的团队终于发现了一株花

药不开裂的天然的雄性不育水稻植株。

2. 袁隆平的梦想还启迪我们： 没有任何一项科学能穷尽 自然的奥秘， 宇宙间更广阔的未知领域还有待于我们前仆后 继地通过实验去探索。

分析:

1. 从袁隆平的“梦想”和“追梦”故事谈科学实验和探索的 重要性。

2. 袁隆平的“梦想”和“追梦”对我们还有什么启迪？

袁隆平的^“梦想^”和^“追梦^”对我们有什么启迪

积极思维

图³ 沉甸甸的杂交水稻稻穗

电流刺激

任氏液

迷走神经

双蛙心灌流实验的故事

２０世纪初^，德国生理学家罗维^{（Ｏ． Ｌｏｅｗｉ）}研究迷走神经对 心跳^（心肌收缩^）的控制作用^。 当罗维用电流刺激青蛙的迷走 神经时^，青蛙的心跳就减慢^。 罗维想^，究竟是迷走神经受电流 刺激后^，电信号直接传导造成心跳减慢呢^，还是由于迷走神经 分泌了某种化学物质造成心跳减慢呢^？ 如果是后者^，那该如何 证明呢^？

事实上^，罗维一直想用一个实验来证实他的假设^，而构思 和设计这个实验花费了他整整^１７年的时间^。后来罗维回忆了 他当时做实验时的情景^{：“１９２０}年复活节的前夜^，我突然从睡 梦中醒来^，打开电灯^，匆匆在一张小纸片上写下几行字后^，我 又躺下睡着了^。 第二天早晨^６点钟^，我起床后想起来^，夜间我 曾写下一些重要的东西^，但小纸片上的字太潦草^，根本无法 辨认^。 第三天凌晨 ^３ 点钟^， 上一夜的想法又在我的脑中出现 了^，原来是一个验证迷走神经产生化学物质控 制心肌收缩的双蛙心灌流实验的设计^。这时虽 然还是深更半夜^，但我立刻起床^，冲进实验 室^，按照梦中的设计^，进行了控制青蛙心跳的 实验^{。 ”}

其实这个实验并不复杂^。罗维解剖了两只 青蛙^，取出它们的心脏^，第一个心脏上仍连接 有迷走神经^，另一个心脏上的迷走神经被剥 离^。他将两个蛙心通过导管连接起来实施灌流 实验^。他先用电流刺激了第一个心脏上的迷走 神经^，当连接迷走神经的心脏中的液体^（任氏 液^）流入到另一个心脏中时^，奇迹出现了^，第二 个心脏的跳动立即减慢下来^。实验结果证明^， 神经系统通过产生化学物质作为信号^， 控制 了心肌的收缩^。现在我们知道^，这种化学物质 是乙酰胆碱^。罗维的成就在于他通过实验揭开 了神经细胞通信问题的神秘面纱^。

双蛙心灌流实验

评价指南

1．举例说明生物科学在^２０世纪所取得 的哪项重大成果对你的日常生活产生了重 大影响^。

2． 联系自己熟悉的事例^， 说明生物科

学实验与生物科学迅速发展的关系^。

3．展望未来^，畅想生物科学的发展可能 对人类的生活^、生产和社会发展产生哪些 影响^。

● 微生物的分离和培养

● 分离特定的微生物并测定其数量 植物组织培养技术

第一章

无

无菌 菌操 操作 作技 技术 术实 实践 践

无

无菌菌操操作作和和无无菌菌培培养养是是生生物物科科学学、、 医医学学等等领领域域最最基基 本

本的的实实验验要要求求，，在在生生产产和和生生活活中中也也有有广广泛泛的的应应用用价价值值。。例例 如

如，， 图图中中一一种种放放线线菌菌的的菌菌落落的的形形成成离离不不开开无无菌菌操操作作和和无无 菌

菌培培养养技技术术。。尝尝试试进进行行无无菌菌操操作作技技术术实实践践，，你你会会初初步步掌掌握握 这

这一一技技术术。。在在今今后后的的工工作作和和生生活活中中，，这这一一技技术术可可能能会会帮帮你你 解

解决决问问题题呢呢！！

一种放线菌的菌落

第

第一一节节 微微生生物物的的分分离离和和培培养养

微生物与人类的关系十分密切^，如在酒类酿造^、食品发酵等传统生产工艺中^，飘香的美 酒和美味的食品都与微生物的代谢活动密切相关^。 随着科学技术的发展^，在医药^、农业^、能 源^、环保等领域中^，许多利用微生物生产的产品被逐渐开发出来^，如抗生素^、疫苗^、微生物杀 虫剂等^。

微生物种类繁多^，在自然界分布广泛^，为了深入地研究它们的特性^，首先要对其进行分 离与培养^。 掌握无菌操作的技能^（如使用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌^）是进行微生物分离与培 养的基础^；掌握微生物培养基的配制技术^（如配制细菌培养基^），学习微生物接种和培养的方 法等^，是实现微生物分离和培养的必要条件^。

高压蒸汽灭菌锅

实验室常利用高温处理达到灭菌效果^，包括采用干热灭菌或湿热灭菌等方法^。 干热 灭菌方法是将准备灭菌的物品放在干热灭菌箱内^，在^{160～170 ℃}下加热^{1～2 h}以达到灭 菌的目的^。 湿热灭菌方法常采用高压蒸汽灭菌锅进行^，如手提式高压蒸汽灭菌锅就是实 验室常用的灭菌仪器之一^。

高压蒸汽灭菌锅^（图^Ⅰ-Ⅰ）的使用包括加 水^、装锅^、加热排气^、保温保压^、出锅等步骤^。

加水是指使用前在锅内加入适量的水^。 加 水不可过少^，以防将灭菌锅烧干^。

装锅是指将待灭菌物品放在灭菌桶中 ^（不 要装得过满^），盖好锅盖^，按对称方法旋紧四周 固定螺栓^，打开排气阀^。

加热排气是指加热后^，锅内水沸腾并有大 量蒸汽自排气阀冒出时^，维持^{２～３ ｍｉｎ} 以排出 冷空气^。 如待灭菌物品较大或不易透气^，应适 当延长排气时间^，务必使空气充分排出^，然后 将排气阀关闭^。

保温保压是指当气压升至^{１００ ｋＰａ、}温度达到 ^{１２１ ℃}时控制热源^，保持压力^，维持

20～３０ ｍｉｎ后^，关闭电源^。

出锅是指当压力表中指针降至^“０”点^，并待温度下降后^，打开排气阀^，旋开固定螺 栓^，开盖^，取出灭菌物品^。 若当压力表指针尚在^“０”点以上^、温度也在^{１００ ℃}以上时开启 排气阀^，会因压力骤然降低而造成培养基剧烈沸腾^，并冲出管口或瓶口^，污染棉塞^，以 致培养微生物时引起杂菌污染^。

灭菌完毕取出物品后^，将锅内余水倒出^，保持灭菌锅内壁及内胆干燥^，盖好锅盖^。

图^Ⅰ-Ⅰ 高压蒸汽灭菌锅结构示意图

安全阀 压力表 排气阀

软管固定螺栓

灭菌桶 筛架 水

配制培养基

培养基（culture medium）是为人工培养微生物而制备的适合微生物生长^、繁殖或积 累代谢产物的营养基质^。 培养基可以分为天然培养基^（采用动植物组织或微生物细胞以 及它们的提取物或粗消化物配制而成^，如牛肉膏蛋白胨培养基^）和合成培养基^（由准确称 量的分析纯等级别的高纯度化学试剂加蒸馏水配制而成^，如葡萄糖铵盐培养基^）等类型^。 天然培养基的主要优点是取材便利^、营养丰富^、配制简便^，缺点是营养成分难以控 制^、实验结果的重复性较差^；合成培养基的优点是化学成分及其含量明确^、实验的可重复 性好^，缺点是配制繁琐^、成本较高^。 各种培养基的配方虽然不同^，但一般都含有水^、碳源

（提供碳元素的物质^）、氮源^（提供氮元素的物质^）和无机盐等最基本的物质^。

配制固体培养基时^，常常需要在液体培养基中添加一定量的凝固剂^。例如^，琼脂是较 为常用的凝固剂之一^，它是从某些藻类中提取出来的一类多糖物质^。通常^{100 mL}液体培 养基中需要加入^{1.5～2.0 g}琼脂^。

在配制培养基时^，根据拟培养的微生物的不同需要^，有时还要加入维生素等特殊的 营养物质^，并要调节培养基的^pH使之满足微生物生长的需要^。

接种微生物

在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程叫做接种^。 在接种操作过程中^， 常用的工具有玻璃涂布器^、接种针^、接种环等^（图^{Ⅰ-Ⅱ）。} 由于接种方法的不同^，采用 的接种工具也有区别^，如用玻璃涂布器进行涂布平板接种^（图^{Ⅰ-Ⅲ），}用接种针进行

穿刺接种^（图^{Ⅰ-Ⅳ），}用接种环进行斜面接种^（图^{Ⅰ-Ⅴ），}或在固体培养基平板上进

行划线接种^（图^Ⅰ-Ⅵ）等^。

图^Ⅰ－Ⅳ 穿刺接种示意图

图^Ⅰ－Ⅱ 接种工具

玻璃涂布器^（涂布平板使用^） 接种针^（穿刺接种使用^） 接种环^（划线接种使用^）

图^Ⅰ－Ⅴ 斜面接种示意图 图^Ⅰ－Ⅵ 平板划线接种示意图 图^Ⅰ－Ⅲ 涂布平板接种示意图

图^１－1 配制培养基 图^１－2 调节^ｐＨ 图^１－3 分装

边做边学 大肠杆菌的接种与分离培养

实践：

（一^）配制牛肉膏蛋白胨培养基

１．配制培养基

在 ^{２００ ｍＬ}烧杯中加入 ^{０．５ ｇ}牛肉膏^{、１.0 ｇ} 蛋白胨^{、 ０．５ ｇ}

ＮａＣｌ、2.0 ｇ琼脂^，再加入蒸馏水至 ^{100 mL，}边加热边用玻璃棒 搅拌^，配制成培养基^（图^{１－1）。}

： 牛肉膏蛋白胨培养基是常用的培养细菌的基 础培养基^，可以根据实际需要配制成液态的^（又称为肉汤培 养基^）或固态的^（添加琼脂作凝固剂^）。牛肉膏蛋白胨培养基具 有营养丰富^、配制方便等特点^，应用非常广泛^。

注意加热安全^，参照^“附录¹ 生物科学实验规则^”进 行操作^。

２．调节^ｐＨ

测试并调节培养基的酸碱度时^， 先用玻璃棒蘸取培养基 接触^ｐＨ试纸测试其^ｐＨ，再根据实际情况用质量分数为^３％的

HCl溶液或^ＮａＯＨ溶液将培养基^ｐＨ调至^７．２（图^{１－2）。}

３．分装

将液态的培养基趁热分装到洁净的试管中^， 培养基的高 度约为试管长度的^{１ ／ ５。}分装时注意不要污染试管口^，随后立 即用棉花塞紧试管口^（图^{１－3）。}

４．包扎

将^３～５支试管扎成一捆^， 并用牛皮纸等将试管口包扎 好^。 在试管壁上注明培养基的名称^、组别^、配制日期等信息

（图^{１－4）。}

５．灭菌

高压蒸汽灭菌是常用的灭菌方法之一^， 通常是在温度为

１２１ ℃、气压为^{１００ ｋＰａ}的条件下灭菌^{２０～30 ｍｉｎ。} 灭菌完毕后

３．在火焰附近用握有接种环的手的小指^、无名指^、中指和 掌心拔去两支试管上的试管塞^， 迅速将试管口通过火焰^２～３次^，

图^１－6 搁置斜面 图^１－5 灭菌

图^１－4 包扎

切断电源^，待压力表中指针指向^“０”点^、温度降至 ^{60 ℃}以下 后^，取出灭菌物品^（图 ^{１－5） 。}

：灭菌（sterilization）是指采用强烈的物理学或化 学方法使物体内外所有的微生物永远丧失生长和繁殖能力 的方法^。 消毒^（disinfection）是指用较为温和的物理学方法^（如用 波长为^{265～266 nm}的紫外线照射^）或化学方法^（如涂抹体积分 数为^70%～75%的酒精^） 杀灭物体上绝大多数微生物的方法^。 通常认为消毒是一种部分灭菌的方法^。

６．搁置斜面

待试管冷却至^{５０ ℃}左右^， 将试管口部枕在高约^{１ ｃｍ}的木 条或其他合适高度的物体上^，使其自然倾斜^，斜面长度不超过 试管总长的^{１ ／ ２（}图 ^{１－6）。}

（二^）斜面接种和培养大肠杆菌

斜面接种大肠杆菌的主要目的有菌种转移^、扩大培养和保存 纯净菌种等^。 具体操作步骤如下^：

１．点燃酒精灯后取两支盛有培养基的试管^， 其中一支内 有菌种^，另一支为无菌的斜面培养基^。用一只手的拇指和其他四指 夹住试管^，使管口齐平^，管内培养基斜面向上^（图^{１－7）。}

２．手持接种环^， 将接种环的环端和接种时可能进入试管 内的部分放在酒精灯火焰上^，来回灼烧多次^，以达到迅速彻底 灭菌的目的^（图^{１－8）。}

图^１－8 接种环灭菌 图^１－7 准备接种

7.将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中^{（4 ℃）}保存^。 由于 菌种容易被污染或产生变异等^，因此用这种方法保存菌种的时 间不宜过长^。一般每隔^3～6个月要重新将菌种从原有的培养基

图^１－１1 划线接种 图^１－１2 培养大肠杆菌 图^１－10 挑取少许菌种 图^１－9 试管口灭菌

５．将上述带菌的接种环迅速伸入待接种的试管中^，在培养 基斜面上由底部向上轻轻划^“Ｓ”型曲线^，将菌种接种到培养基 上^。 划曲线时不要将培养基的表面划破^（图 ^{１－１1）。}

６． 将试管口与试管塞分别通过火焰^２～３次^， 迅速塞紧试 管^。 多次灼烧接种环确保无菌^，冷却后^，放回原处^。 将接种过菌 种的试管^，放在恒温箱中^{（３７ ℃）}培养^{２４ ｈ（}图 ^{１－１2），}观察接种 和培养的结果^。

以杀灭试管口上的微生物^（图^{１－9）。}

：无菌操作是微生物接种和培养的关键^。为防止 被杂菌污染^，不但培养微生物用的试管^、培养皿和培养基等在 接种前须进行灭菌^，接种操作通常还需要在酒精灯火焰附 近进行^，这是因为酒精灯火焰附近的局部高温使微生物难以 存活^。

４．将已灭菌的接种环伸入内有菌种的试管中 ^（菌种可 以购买^，也可以通过分离培养和保存获得^），先将环部接触 培养基斜面顶端或其他无菌的培养基部位使其冷却^， 再轻轻 挑取少许菌种^。 在抽出接种环时^，注意其带菌部位不要触及 试管壁^，也不要通过火焰处^（图 ^{１－１0）。}

a 打开瓶塞 ^b 灼烧瓶口灭菌

c 倒培养基 ^d 倒置平板

图^１－１3 平板制作操作示意图

转移到新鲜的培养基上^，以保证菌种的活性^。 对于需要长期保 存的菌种还需要采用其他特殊的方法^。例如^，采用甘油管藏法^： 将^{1 mL}待保存的菌液转移到^{1 mL}已灭菌的甘油中^，充分混匀 后置于^{-20 ℃}的冷冻箱中长期保存^。

（三^）平板划线分离和培养大肠杆菌

在实验室中^，平板常常被用来培养^、分离细菌等微生物^。

1．牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板制作

将配好的牛肉膏蛋白胨培养基装入锥形瓶并用棉塞塞 紧^，置于高压灭菌锅中^；用牛皮纸等将培养皿包好^（一般 ⁵套 一包^），再用细绳扎紧后也放入高压蒸汽灭菌锅中^，与培养基 一起灭菌^。

灭菌后^，将物品取出置于操作台上^，待培养基冷却到^{50 ℃}左 右时进行倒平板操作^。首先^，在酒精灯火焰旁一只手拿着装有培 养基的锥形瓶^，另一只手拔出瓶塞^（图^{1-13 a），}使瓶口迅速通过 火焰 ^2～3次^（图^{1-13 b），}并转动瓶口^，确保瓶口灭菌彻底^。 再 取无菌培养皿^，在火焰旁用拇指和食指将培养皿打开一条稍大 于锥形瓶瓶口的缝隙^，将锥形瓶中的培养基^{（10 ～20 mL）} 倒入培养皿中^（图 ^{1-13 c）。} 等平板冷却凝固后^，将平板倒置

（皿盖在下^、皿底在上^）备用^（图 ^{1-13 d）。}

：在制作平板的过程中^，一定要注意无菌操作^。 若在超净工作台上制作平板会更好^。

2.平板划线分离与培养大肠杆菌

除了试管斜面划线法外^，纯化和培养微生物的方法还有平 板划线法等^。 平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培 养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法^。例如^，用 已制备好的牛肉膏蛋白胨培养基平板进行大肠杆菌的分离与 培养^（图^1-14）。

讨论：

１．为什么要在酒精灯火焰附近接种^？

２． ２４ ｈ后^，培养基上长出了什么^？肉眼看到的一个菌落肯 定是由一个大肠杆菌生长和繁殖形成的吗^？

在一个倒有培养基的培养皿的 皿底外侧面 中 央 用记 号 笔 画 一 直 线^，再在此线中间画一垂直线^，将培 养基分成三个区域^：第¹区域^、第² 区域^、第³区域^，分别标上^{“1”、“2”、}

“3”字样^。

接种划线时^，将带有微生物样品 的接种环^，在培养皿内培养基的第¹ 区域划线^，然后再从第¹区域划到第

2区域^， 从第²区域划到第³区域^。 在固体培养基表面完成多次^“由点到 线^”的逐步稀释^。

通过培养可以得到由单个 细菌增殖而形成的菌落^。

图^１－１4 平板划线分离和培养大肠杆菌示意图

接种和划线操作需要在酒精灯 火焰附近进行^。

1

2 3

1 2 3

评价指南

一^、单项选择题

1. 培养基为培养微生物提供了所需的 多种营养物质^，牛肉膏蛋白胨培养基常用于

培养 ^{（ ）}

A. 细菌 ^B.酵母

C.霉菌 ^D.病毒

2. 下列有关牛肉膏蛋白胨培养基的叙 述中^，正确的是 ^{（ ）}

A. 配制方便的合成培养基

B.营养丰富的天然培养基

C.需要牛肉膏的量比蛋白胨多

D. 只适用于培养大肠杆菌

3.下列有关配制 ^{1 000 mL}牛肉膏蛋白 胨培养基的叙述中^，错误的是 ^{（ ）}

A. 需要加入 ^{5.0 g} 牛肉膏和 ^{10.0 g} 蛋 白胨

B.需要加入^{5.0 g NaCl}

C. 配制固体培养基时一般需要加适量 的琼脂

D. 配制液体培养基时一般不需要调节

培养基的 ^pH

4.通常要在酒精灯火焰附近接种微生 物^，其原因主要是 ^{（ ）}

A. 酒精灯火焰附近的局部高温使得微 生物不能存活

B.较高的环境温度可以使细菌的代谢 更加旺盛

C.在酒精灯火焰附近操作可以保持培 养基的液体状态

D. 火焰灭菌与高压灭菌锅的灭菌原理 完全相同

5.下列关于斜面接种目的的描述中^，错

误的是 ^{（ ）}

A.菌种转移 ^B.扩大培养菌种

C.保存纯净菌种 ^D. 获得单个菌落

6.下图中甲为大肠杆菌经过平板划线 接种和培养后的菌落分布图^，乙^、丙^、丁为平 板划线操作示意图^。 要得到甲图菌落分布^， 最可能的平板划线示意图是 ^{（ ）}

A. 只能是乙 ^B.只能是丙 ^C.只能是丁 ^D.乙^、丙^、丁都不是

丙 丁

乙 甲

二^、技能增进题

推理 由一个或几个已知的事实^，推导 出一个未知结论的思维过程^。 生物学学习过 程中也常常需要用已有的知识去推理得出 新的结论^。

右表是某微生物培养基成分^，请据此作 出推理^：

该培养基可培养的微生物营养类型是 什么^？

编号 成分 含量

1 粉状硫 ^{10.0 g}

2 (NH4)2SO4 0.4 g

3 K2HPO4 4.0 g

4 MgSO4 9.25 g

5 FeSO4 0.5 g

6 CaCl2 0.5 g

7 H2O 100 g

最早用来培养微生物的人工配制的培养基是液体状态 的^，分离并获得微生物纯培养物非常困难^。 因此^，在早期微生 物学研究中^，分离微生物的进展相当缓慢^。

利用固体培养基分离^、培养微生物的技术^，首先是由德国 细菌学家罗伯特^·科赫及其助手创立的^{。 １８８１}年罗伯特^·科赫 发表论文^，介绍利用土豆片分离微生物的方法^，用灼烧灭菌的 刀片将煮熟的土豆切成片^，然后用针尖挑取微生物样品在土 豆片表面划线接种^，经培养^、分离获得微生物的纯培养物^。 这 一方法的缺点是一些细菌在土豆培养基上生长状态较差^。

罗伯特^·科赫还将明胶和牛肉膏蛋白胨培养基混合后铺 在玻璃平板上^，让其凝固^，在其表面接种微生物^。 由于明胶熔 点低^，而且容易被一些微生物分解利用^，其使用受到限制^。 有意思的是^，罗伯特^·科赫一名助手的妻子具有丰富的厨 房经验^，当她听说明胶作为凝固剂遇到的问题后^，建议以厨房 中用来做果冻的琼脂代替明胶^。 琼脂是从几种红藻^（主要是石 花菜^）中提取的^，主要成分是琼脂糖和琼脂胶^{。１８８２}年^，琼脂就 开始作为培养基的凝固剂^，从餐桌走向了实验桌^，为微生物学 的发展作出了重要贡献^。 直到今天^，琼脂仍然是最常用的凝固 剂^；在一些食品^、化妆品等产品中也是重要的原料之一^。

罗伯特^·科赫更为杰出的成就是研究和发现结核杆菌与 结核菌素等^，他也因此而荣获 ¹⁹⁰⁵ 年诺贝尔生理学或医学 奖^{。 1982}年³月²⁴日^，中国邮政部发行^《罗伯特^·科赫发现结 核杆菌一百周年^》纪念邮票^，全套一枚^。邮票右边是显微镜^、试 管^，左边的红色图案是中国的防治结核病标志^。

从餐桌到实验桌的琼脂

第

第二二节节 分分离离特特定定的的微微生生物物并并测测定定其其数数量量

在自然环境中常常有多种不同的微生物生活在一起^，要对其中的某种微生物进行研究

（如微生物的种类识别^、数量统计等^），就必须获得其纯培养物^，以排除其他微生物的干扰^。 在实验室中利用选择培养基就可以筛选和分离某种微生物^， 然后在高度稀释的条件下^，在 固体培养基上培养一个个微生物^（如某种细菌^）形成的单个菌落^。 单个菌落即为纯培养物^， 可用于科学研究^。 例如^，通过菌落数量的统计^，可以计算出样品中的含菌数等^。

分离特定的微生物并测定其数量^，需要掌握涂布平板法和混合平板法等^，如果采用选择 培养基分离特定微生物的方法^，还需要学习观察各种微生物形成的菌落等^。

将待分离的样品进行^１０倍系列稀释 取一定稀释 度的样品涂 布平板

预先制备好 平板

取 一 定 稀 释 度 的 样 品 与 熔 化 冷却 至^{50 ℃}左 右 的 培 养 基 混 合均匀

０．１ ｍＬ

涂布平板法

用无菌玻璃涂布器 将样品涂布均匀

混合平板法

细菌菌落通常仅 在平板表面生长

细菌菌落出现在 平板表面和内部 将混合液倒入

无菌培养皿

图^Ⅰ－Ⅶ 用涂布平板法和混合平板法分离细菌示意图

涂布平板法和混合平板法分离细菌

许多细菌^、真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落^，采用适宜的分 离方法很容易得到它们的纯培养物^。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培 养基表面或里面^，每个孤立的活微生物体经过生长^、繁殖均可形成单个菌落^。

分离^、培养微生物最常用的是琼脂固体培养基^。这种由德国科学家罗伯特^·科赫创 立的平板分离微生物并进行纯培养的技术简便易行^，１００多年来一直被用来分离各种 微生物^。平板分离法有多种^，如涂布平板法和混合平板法就是实验室中最常用的两种方

法^（图^{Ⅰ－Ⅶ）。} 平板分离法的各项操作均需在超净工作台上或在酒精灯火焰旁进行^。

选择培养分离

科学家观察到^，在一种培养基上接种多种微生物^，常常会有一些微生物能生长^，而另 一些微生物的生长受到抑制^。这是因为不同的微生物有不同的营养需求或对某种化学物 质有不同的敏感性^。 根据这一原理^，科学家针对某种微生物的特性^，设计一个特定的环 境^，使之特别适合这种微生物的生长^，而抑制其他微生物的生长^。这种通过选择培养进行 微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离^。通过选择培养能够从自然界混杂的微生物 群落中把特定的微生物选择分离出来^。

自然界中的微生物群落一般是由多种微生物组成的^，特别是当某种微生物与其他微 生物相比^，数量非常稀少的时候^，仅采用一般的平板法几乎不可能把数量稀少的微生物 分离出来^。要分离这种微生物^，必须根据它的特点^（包括营养^、生理^、生长条件等^），采用选 择培养分离的方法^，经过一定时间的培养后^，使这种微生物在群落中的数量不断增加^，再 通过平板法等进行纯培养分离^。 例如^，要分离耐高温菌^，可在高温条件下进行培养^；要分 离对某种抗生素具有抗性的菌种^，可在加有该抗生素^（如链霉素或青霉素^）的平板上进行分 离^。 再如^，在培养基中加入质量分数为^10%的酚^，可以抑制细菌和霉菌的生长^；运用将纤维 素作为唯一碳源和能源的培养基^，可以有效地分离能分解纤维素的细菌^；运用无氮培养基

（培养基完全不含氮元素^） 可选择能固氮的细菌^； 运用只含尿素而不含其他氮元素的培养 基^，可以选择能分解尿素以获取氮的微生物^（能合成脲酶的微生物可以分解尿素^）。

图^Ⅰ－Ⅷ 各种微生物形成菌落的表观特征

波状 裂片状 缺刻状 丝状 卷曲状

圆形状 丝状 不规则状 根状 纺锤状

扁平状 隆起状 凸透镜状 枕状 脐突状

光滑状 点状

俯面观

侧面观

边缘观

观察各种微生物形成的菌落

菌落^（colony）是指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长^、繁殖到一定程

度^，形成肉眼可见的^、有一定形态结构的子细胞生长群体^。不同微生物在特定培养基上生 长形成的菌落一般都具有稳定的特征^，如菌落的大小^、形状^、边缘特征^、隆起程度^、颜色等

（图^{Ⅰ－Ⅷ），}这些可以作为对微生物进行分类^、鉴定的重要依据^。 当多种微生物混杂在一

起时^，根据它们在平板上形成的菌落的形态特征^，可初步将所需的微生物与其他微生物 区分开^，并在此基础上获得所需微生物的纯培养物^。

实践：

（一^）涂布平板法培养和计数土壤微生物

１．准备实验器材^：土壤样品^；移液管^（图 ^1-15 左^），洗耳 球^（图 ^1-15 右^），试管^，试管架^，锥形瓶^，烧杯^，培养皿^，玻璃 涂布器^，天平^，称量纸^，恒温箱等^；相关培养基^，蒸馏水^。 所有 玻璃器皿灭菌前需用适当浓度的浓硫酸浸泡^{24 h。}

２．采集土壤^，制备悬液^：称取 ^{０．５ ｇ} 土壤样品^，倒入盛有

５０ ｍＬ无菌水的锥形瓶^，振荡 ^{２０ ｍｉｎ，}充分打散土壤^，即成为

１０^－２ｇ ／ ｍＬ的土壤悬液^。 用无菌移液管吸取^{０．５ ｍＬ}土壤悬液注 入盛有^{４．５ ｍＬ}无菌水的^１号试管^，配制^{１０－３ｇ ／ ｍＬ}的土壤悬液^。 取另一支无菌移液管吹吸 ^１号试管^３次^，使悬液均匀^，再吸取

０．５ ｍＬ注入盛有 ^{４．５ ｍＬ}无菌水的^２号试管^，配制^{１０－４ｇ/ｍＬ}的土 壤悬液^。 以此类推^，依次配制^{１０－５、１０－６、１０－７、１０－８ｇ/ｍＬ}的土壤悬 液^。 每次用移液管移取悬液前都要用洗耳球吹口对准移液管 末端^，将悬液吸入或排出移液管数次^，以使悬液均匀^（参照附 录 ²中^“容量玻璃器皿的使用^”要求^）。

３．选择适于分离特定微生物的培养基^：利用不同微生物代 谢特性的不同^，可以通过选择培养基抑制其他微生物的生长^，从 而选出所需要的微生物^。 如要分离土壤中能分解尿素的微生 物^，可采用唯一氮源为尿素的培养基^（表^1-1）。 将已灭菌的培 养基熔化^，冷却到^{４５～５０ ℃，}倒入不同编号的培养皿中^，迅速 盖好培养皿盖^，待凝固后即成平板^。 另设置一份不加氮源的培 养基作为空白对照^（以等体积的无菌水代替^）。

４．接种^：从浓度最低的土壤悬液^{（１０－８ｇ ／ ｍＬ）}开始^，用无菌 移液管吸取 ^{１ ｍＬ}加入到标记有^１０－８的培养皿中^，再分别用无 菌移液管从 ^{１０－７ｇ ／ ｍＬ、１０－６ｇ ／ ｍＬ} 的土壤悬液中各吸取^{１ ｍＬ} 加

边做边学 以尿素为唯一氮源的土壤微生物的分离^、培养与数量测定

ＫＨ2ＰＯ４ １．4 ｇ Na2ＨＰＯ４ 2．1 ｇ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．2 ｇ

葡萄糖 ^{10.0 ｇ}

尿素 ^{1．0 ｇ}

琼脂 ^{15．０ ｇ}

加蒸馏水定容至 ^{1 000 mL}

ｐＨ ７．０～７．２

表^１－1 分离可分解尿素的微生物 培养基配方

图^１－１5 移液器具

移液管 洗耳球

图^１－16 用涂布平板法进行微生物计数示意图

１０^－２

土壤悬液 ^１０

－３ １０^－４ １０^－５ １０^－６ １０^－７ １０^－８

倒 平 板^， 每只培 养 皿^{１５ ｍＬ}

１ ２ ３ ４ ５ ６

系列稀释

熔化的培养基

涂布平板和培养

： 涂布平板菌落计数法是将待测样品经适当稀 释后^，其中的微生物可能被分散成单个个体^，吸取一定量的稀 释样液接种到平板上^， 经过培养会形成由单个细胞生长繁殖 而形成的肉眼可见的菌落^， 每个菌落代表原样液中的一个微 生物^。

５．培养与观察^：将已经标明培养基种类^、培养日期以及样品 稀释度的培养皿^，倒置于^{３７ ℃}恒温箱中培养^１～２天^。 观察每个 培养皿中的细菌菌落^。

６．计数菌落^：取出已培养^1～2 天的平板^，观察和统计每个 培养皿中的菌落数^。 计算时^，一般选取菌落数为 ^{３０～３００} 的一 组为样本进行统计^。 每克土壤样品的细菌数^＝某一稀释度几 次重复培养后的菌落平均数^×稀释倍数 ^（涂布所用稀释液为

1 mL）。

：通过涂布平板菌落计数法统计菌落数时^，可根 据其稀释倍数和取样接种量换算出样品中的含菌数^。 由于待 入到标记有^{１０－７、１０－６}的培养皿中^（图^1-16），每个浓度设置^３个 重复^，再采用涂布平板法涂布均匀^。 注意^：每次吸取悬液前^，都 要将土壤悬液充分振荡^，混合均匀^；每一步操作都需要在无菌 条件下进行^。