30種大蒜的園藝性狀及含硫化合物質量分析

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國立臺灣大學生物資源暨農學院園藝系研究所碩士論文

Department or Graduate Institute of Horiculture College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

30種大蒜的園藝性狀及含硫化合物質量分析

Morphological characteristics and sulfur-containing compounds analyses in 30 garlic (Allium sativum) cultivars

張玳瑜 Dai-Yu Chang

指導教授﹕曹幸之博士、許圳塗博士 Advisors：Shing-Jy Tsao, Ph.D.

Chou-Tou Shii, Ph.D.

中華民國 97 年 7 月

June 2008

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誌謝

三年的研究生生涯，雖然其中幾經波折，於老師、家人及朋友的鼓勵下，隨著論文的完成終將劃上句點。於蔬菜研究室這個環境中學習、研究及成長，使我獲益良多，承蒙指導教授曹幸之老師在學業、研究及做人處事上的諄諄教誨，於試驗上提出多方幫助，使我無後顧之憂的專心研究，並於心情低潮時安慰我，幫我走出陰霾，在此由衷感謝。文稿初成時，承蒙許圳塗老師、宋妤老師及陳開憲老師的細心審閱及斧正，並給予寶貴建議，使論文得以更加完善。

試驗期間特別感謝繼中學長提供試驗儀器，並於儀器使用上提出諸多的指導教學、熱心協助，使我於最短的時間內掌握操作的方法，使試驗迅速上軌道。於試驗遭遇瓶頸時，提供我寶貴的建議，並提出不同方向及層面的思維方式和見解，

使我得以突破重重難關，使整個試驗最終得以順利完成，謹致衷心感謝。感謝香霖細心管理 GC/MS，於機器操作異常時不辭辛勞幫忙排除及解決，且於數據分析及寫作上給予我諸多的照顧和建議。另外，感謝台中區農業改良場蕭政弘學長熱心提供大量試驗材料。

實驗室的學姊毓華、學長順元、賜福、國銘，同學金燕、昱辰、婷雅，及學弟妹們芝蓉、瓊儀、亦中、瑜筑、佩潔、奕成，我們在蔬菜室一起聊天、做實驗、

討論作業、一起出差，一起渡過一段開心的時光。還有香霖、荷惠、石腦、某墮、

雲卻、鳳兒、小佑、小白、SCO 和 Peter 等人，謝謝你們在我失落、難過的時候提供我歡笑，使我再度振作起來。謝謝你們陪我走過研究所生涯種種挫折和磨練。

最後，感謝家人全力支持，謝謝父母貼心的支持，謝謝阿姨陪我談心，謝謝大舅舅在緊要關頭拉我一把，謝謝外公、外婆及其他家人給我鼓勵，因為有你們無私的付出和關心，使我能勇於面對挫折。僅以此論文獻給所有陪伴過我的人。

張玳瑜 2008.07 於台大園藝系蔬菜研究室

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中文摘要

大蒜為世界上重要的香辛蔬菜，由於含有特殊氣味常用以食物調味，其氣味來源多屬含硫揮發性或半揮發性含硫化合物。本研究利用固相微萃取-氣相層析質譜儀（SPME-GC/MS）及溶劑萃取-GC/MS 兩種方法，分析由台中區農業改良場所提供之大蒜品種 30 種，其中包括 22 個大陸品種、4 個台灣品種、2 個韓國品種和 2 個越南品種的揮發性成分，各品種進行了型態調查。蒜球周徑介於 10.17 cm- 18.27cm，蒜瓣數介於 6 ~ 23。供試品種 4 種為軟骨蒜，26 種為硬骨蒜。型態特徵上，‘和美’與‘大片黑’比與‘宜蘭白’或‘芳苑’有較多相似。使用 SPME-GC/MS 分析‘和美’、‘大片黑’和‘宜蘭白’三個品種葉齡 20、40 及 60 天之葉片含硫化合物種類及含量，皆表現葉片隨著葉齡增加、揮發性含硫化合物的種類及含量逐漸減少。分析葉身、葉鞘及鱗莖三個不同部位的結果顯示，‘和美’和‘宜蘭白’兩品種表現相同的趨勢，即葉片中的揮發性含硫化合物最少，葉鞘中的含硫化合物種類較多，而以蒜球中的含硫化合物種類最多。在含硫化合物的相對含量上，以發育中的蒜球最高，其次為葉鞘，而葉片中的含量最低。‘大片黑’以葉鞘中的含硫化合物種類最多，

多數含硫化合物的相對含量也以葉鞘最高，葉片的含硫化合物種類最少，含量最低。分析‘和美’和‘大片黑’ 蒜瓣和蒜皮中的揮發性含硫化合物組成及相對含量都同樣以蒜皮中的揮發性含硫化合物遠較蒜瓣為少，量也較低。以 SPME-GC/MS 分析 30 個大蒜品種葉片及鱗莖，各偵測到 17 和 20 種揮發性化合物，葉片氣味主要由一硫（1 種）、二硫（5 種）及三硫（2 種）化合物組成，鱗莖中化合物種類及含量較葉片多，四硫（1 種）化合物亦為主要化合物之一。以溶劑-GC/MS 分析 30 個大蒜品種鱗莖，共偵測到 18 種揮發性化合物，成分皆為一硫（1 種）、二硫（6 種）及三硫（1 種）化合物；相較於 SPME 所得之結果，溶劑法偵測到的化合物中除了 3-vinyl-1,2-dithiacyclohex-4-ene 和 3-vinyl-1,2-dithiacyclohex-5-ene 兩個環狀化合物含量大量增加外，其他成分皆顯著減少，並且增加了 2-vinyl-1,3-dithiane，而

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這三種化合物應為萃取時產生之人為產物。以 SPME-GC/MS 分析大蒜葉片、鱗莖和溶劑萃取-GC/MS 分析大蒜鱗莖的群聚分析結果，各品種依化合物的種類及成分含量高低而可分群。由 SPME 分析，台灣四個品種中‘和美’歸為葉片及鱗莖含硫化合物種類及含量均少的一群，‘大片黑’ 歸為葉片及鱗莖含硫化合物種類均少的一群，‘芳苑花蒜’葉片中含硫化合物種類多，但鱗莖屬於化合物種類少的一群，‘宜蘭白’屬於葉片及鱗莖含硫化合物種類均多的一群。以溶劑萃取分析，四個品種之鱗莖，除‘芳苑花蒜’外，其餘三品種皆屬硫化合物種類多的一群。比較兩個不同生產地的‘和美’蒜球揮發性化合物，有產地差異，但兩個不同產地的‘大片黑’則成分相似。

關鍵字：含硫揮發性化合物、固相微萃取、溶劑萃取、氣相層析質譜儀、主成分分析、大蒜品種群聚分析

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英文摘要

Garlic (Allium sativum L.) is an important vegetable of the world for its culinary value as a flavoring agent. Its volatile or partially-volatile sulfur-containing compounds contribute to the characteristic flavors. In this study both solid-phase microextraction -gas chromatography/mass spectrometry (SPME-GC/MS) and solvent extraction-GC/

MS are employed to analyze the flavor compounds of 30 garlic cultivars. All cultivars are grown at Taichung District Agricultural Research and Extension Station, Chang-Hua, including 4 cultivars of Taiwan, 22 of China, 2 of Korea and 2 from Vietnam. The result of field plant characters of 30 garlic cultivars indicated that 4 cultivars are soft-neck with the rest being hard-neck which produced a flower stalk. The perimeter of the bulb ranges from 10.17 to 18.27 cm and the cloves number from 6 to 23. Morphologically, cvs. ‘He-Mei’ and ‘Large-Black-Leaf’ showed more similarities than they are to either ‘Fan-Yuan’ or ‘Yi-Lan White’. Both the number and amount of arising sulfur-containing volatiles collected by SPME- GC/MS in leaf blades decreased with leaf age increasing from 20 d, 40 d to 60 days after labeling in cvs. ‘He-Mei’,

‘Large-Black-Leaf’, and ‘Yi-Lan-White’. Both cvs. ‘He-Mei’ and ‘Yi-Lan-White’ had the least volatile sulfur-containing compounds in leaf blades followed by leaf sheath and the developing bulb having the most and the highest content of sulfur volatiles, while cv. ‘Large-Black-Leaf’ had the most and highest amount of total volatile compounds in leaf sheath and the least in leaf blades. The cloves had more and higher amount of sulfur-containing volatiles than clove peels did in both cvs. ‘He-Mei’ and

‘Large-Black-Leaf’ tested. In SPME-GC/MS analyses, 17 and 20 volatile compounds were detected in leaf blades and cloves of 30 cultivars, respectively. The major compounds of leaf blades were sulfide (one compound), di-sulfide (5 compounds) and

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tri-sulfide (one compound). In addition to these compounds, the cloves contain also tetra-sulfide and with higher contents of sulfur volatiles than those of leaf blade. In solvent-GC/MS analyses, 18 volatile compounds were detected in garlic cloves. The major ones were di- and tri-sulfide with contents being much decreased as compared with the results of SPME-GC/MS, except for 3-vinyl-1,2-dithiacyclohex-4-ene and 3-vinyl-1,2-dithiacyclohex-5-ene. Compound of 2-vinyl-1,3-dithiane was only detected in solvent-GC/MS. These latter three compounds might be artifacts. The dendrogram based on leaf or bulb sulfur-containing volatiles extracted either by SPME- GC/MS or solvent-extraction GC/MS indicate that all 30 garlic cultivars can be grouped by the number and level of compounds they contain. From the results of SPME-GC/MS,

‘He-Mei’, the early variety in Taiwan is low in volatile sulfur-containing compounds in both leaves and bulbs; ‘Large-Black-Leaf’, the main bulb variety of Taiwan follows and contains relatively low volatile sulfur compounds in both leaves and bulbs. In comparison with ‘Large-Black-Leaf’, ‘Fang-Yuan’ has more volatile compounds in number in leaves but not in cloves. Cultivar ‘Yi-Lan-White’ is high in volatile-sulfur containing compounds in both leaves and in bulbs. The results of solvent-extraction GC/MS indicates garlic cultivars of Taiwan, except cv. ‘Fang-Yuan’ contain high number of volatile sulfur compounds. Variations in volatile sulfur compounds were detected in cv. ‘He-Mei’ but not in ‘Large-Black-Leaf’ of two different sources.

Key words: volatile sulfur-containing compounds, solid-phase microextraction (SPME), solvent-extraction, gas chromatography/mass spectrometry(GC/MS), cluster analysis of garlic cultivars

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目錄

口試委員會審定書...i

誌謝...ii

中文摘要...iii

英文摘要...v

第一章前言...1

第二章前人研究...3

一、大蒜生產及種原...3

二、大蒜成分...5

三、大蒜成分之分析方法...7

（一）分析樣品製備法...8

（二）分析方法...10

（三）萃取時影響大蒜成分分析之因子...11

四、化學分類法...12

第三章材料與方法...15

一、試驗材料...15

二、試藥與儀器設備...15

（一）試藥及溶劑...15

（二）儀器及設備...15

三、試驗方法...16

（一）大蒜品種基本性狀...16

1. 性狀調查...16

2. 數據分析...17

（二）揮發性化合物分析...17

1. 樣品準備...17

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2. 樣品切碎以水為酵素反應媒介，再以 SPME 吸附...18

3. 溶劑萃取...18

4. 數據分析...19

第四章結果...21

一、大蒜之園藝性狀...21

（一）園藝性狀...21

（二）品種間之相似度與群聚分析...22

（三）主成分分析...24

二、大蒜之含硫化合物組成...24

（一）試驗之重複性...24

（二）不同葉齡葉片含硫揮發性化合物的變化...27

（三）不同葉部含硫化合物的變化...27

（四）不同產地來源蒜瓣之含硫化合物變化...29

三、大蒜 30 個品種的含硫揮發性化合物變化...30

（一）葉片含硫化合物的變化與群聚分析...30

1. 葉片含硫化合物的組成...30

2. 大蒜 30 個品種之群聚分析...30

3. 主成分分析...32

（二）鱗莖中含硫化合物的變化與群聚分析...33

1. 固相微萃取...33

（1）鱗莖中的含硫化合物...33

（2）群聚分析...34

（3）主成分分析...36

2. 溶劑萃取...36

（1）鱗莖中的含硫化合物...36

(10)

（2）群聚分析...37

（3）主成分分析...38

第五章討論...87

一、分析方法及儀器的穩定性...87

二、比較 SPME 及溶劑萃取法...87

三、大蒜含硫揮發性成分...89

四、以植株性狀及揮發性含硫化合物探討不同大蒜品種...92

第六章結論...94

參考文獻...95

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圖目錄

圖 1、供試 30 個大蒜品種之性狀調查...42

圖 2、以 12 個性狀分析 30 個供試大蒜品種...44

圖 3、以 12 個園藝性狀分析 30 個大蒜品種之主成分分析...46

圖 4、含氘內標準品之結構式...47

圖 5、大蒜中揮發性含硫化合物結構式...61

圖 6、大蒜‘和美’、‘大片黑’和‘宜蘭白’新葉標示後 20 天、40 天和 60 天之葉長度及葉位變化...66

圖 7、以固相微萃取所得之 17 種葉片揮發性含硫化合物分析 30 個大蒜品種之樹狀圖...74

圖 8、以固相微萃取法吸附大蒜葉片所得之含硫揮發性化合物分析 30 個大蒜品種之主成分分析...76

圖 9、以 20 種固相微萃取所得之鱗莖揮發性含硫化合物分析 30 個大蒜品種的樹狀圖...79

圖 10、以固相微萃取法吸附大蒜鱗莖所得之揮發性含硫化合物分析 30 個大蒜品種之主成分分析...81

圖 11、以溶劑萃取鱗莖所得之 18 種揮發性含硫化合物分析 30 個大蒜品種的樹狀圖...84 圖 12、以溶劑萃取大蒜鱗莖所得之揮發性含硫化合物分析 30 個大蒜品種之主成分分析.86

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表目錄

表 1、參試 30 種大蒜之編號、材料名稱、來源國家及提供來源... 20

表 2、30 個大蒜品種之植株性狀比較... 39

表 3、30 個大蒜品種之葉部性狀比較...40

表 4、30 個大蒜品種之鱗莖性狀比較...41

表 5、30 種大蒜 12 個園藝性狀的主成分分析...45

表 6、大蒜‘大片黑’葉片以固相微萃取法重複試驗所得之揮發性含硫化合物變異量...48

表 7、大蒜‘廣西崇左市扶綏縣’葉片以固相微萃取法重複試驗所得之揮發性含硫化合物變異量...49

表 8、大蒜‘和美’蒜瓣以固相微萃取法重複試驗所得之揮發性含硫化合物變異量...50

表 9、大蒜‘大片黑’蒜瓣以固相微萃取法所重複試驗得之揮發性含硫化合物變異量...51

表 10、大蒜‘宜蘭白’蒜瓣以固相微萃取法重複試驗所得之揮發性含硫化合物變異量...52

表 11、大蒜‘和美’蒜瓣以溶劑萃取法重複試驗所得之揮發性含硫化合物變異量...53

表 12、大蒜‘大片黑’蒜球以溶劑萃取法重複試驗所得之揮發性含硫化合物變異量...54

表 13、使用‘宜蘭白’蒜球以溶劑萃取法重複試驗所得之揮發性含硫化合物變異量...55

表 14、大蒜‘和美’蒜瓣中以溶劑萃取法所得之揮發性含硫化合物變異量...56

表 15、大蒜‘大片黑’蒜瓣中以溶劑萃取法所得之揮發性含硫化合物變異量...57

表 16、大蒜‘宜蘭白’蒜瓣中以溶劑萃取法所得之揮發性含硫化合物變異量...58

表 17、以固相微萃取法所得之大蒜揮發性含硫化合物及內標準品...59

表 18、固相微萃取法所用之內標準品及其對應量之含硫揮發性化合物...62

表 19、以溶劑萃取法所得之大蒜揮發性含硫化合物及內標準品...63

表 20、溶劑萃取法所用之內標準品及其對應量之含硫揮發性化合物...65

表 21、‘和美’、‘大片黑’和‘宜蘭白’於葉齡 20、40 及 60 天葉片以 SPME-GC/MS 測定之葉身揮發性含硫化合物校正量...67

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表 22、‘和美’、‘大片黑’ 和‘宜蘭白’之葉身、葉鞘和鱗莖以 SPME-GC/MS 測定之揮發性

含硫化合物校正量...68

表 23、‘和美’和‘大片黑’之蒜皮和蒜瓣以 SPME-GC/MS 測定之揮發性含硫化合物校正量...70

表 24、不同來源之‘和美’和‘大片黑’之蒜瓣以 SPME-GC/MS 測定之揮發性含硫化合物校正量揮發性含硫化合物校正量...71

表 25、大蒜 30 個品種葉片以 SPME-GC/MS 測定之揮發性含硫化合物相對量...72

表 26、以固相微萃取法分析 30 種大蒜葉片揮發性含硫成分之主成分分析...75

表 27、大蒜 30 個品種鱗莖以 SPME-GC/MS 測定之揮發性含硫化合物相對量...77

表 28、以固相微萃取法分析 30 種大蒜蒜瓣揮發性含硫成分之主成分分析...80

表 29、大蒜 30 個品種鱗莖以溶劑萃取-GC/MS 測定之揮發性含硫化合物相對量...82

表 30、以溶劑萃取法分析 30 種大蒜蒜瓣揮發性含硫成分之主成分分析...85

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附錄

附錄 1、世界重要大蒜生產國與台灣之大蒜產量...103

附錄 2、大蒜 100 克鮮重所含之成分及含量...104

附錄 3、大蒜中有機含硫化合物之結構式...105

附錄 4、固相微萃取裝置...106

附錄 5、固相微萃取使用方式...107

附錄 6、氣相層析裝置...108

附錄 7、以 12 個性狀分析 30 大蒜品種間之相似性矩陣...109

附錄 8、大蒜‘大片黑’葉片揮發性成分以固相微萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...110

附錄 9、大蒜‘廣西崇左市扶綏縣’葉片揮發性成分以固相微萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...111

附錄 10、大蒜‘和美’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...112

附錄 11、大蒜‘大片黑’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...113

附錄 12、大蒜‘宜蘭白’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...114

附錄 13、大蒜‘和美’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...115

附錄 14、大蒜‘大片黑’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...116

附錄 15、大蒜‘宜蘭白’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法重複試驗所得之總離子層析圖….117 附錄 16、大蒜‘和美’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...118

附錄 17、大蒜‘大片黑’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...119

附錄 18、大蒜‘宜蘭白’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法重複試驗所得之總離子層析圖...120

附錄 19、大蒜‘和美’葉身揮發性成分於葉齡 20、40 及 60 天以固相微萃取法測定之總離子層析圖...121

附錄 20、大蒜‘大片黑’葉身揮發性成分於葉齡 20、40 及 60 天以固相微萃取法測定之總離子層析圖...122

(15)

附錄 21、大蒜‘宜蘭白’葉身揮發性成分於葉齡 20、40 及 60 天以固相微萃取法測定之總離子層析圖...123 附錄 22、大蒜‘和美’葉身、葉鞘和鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...124 附錄 23、大蒜‘大片黑’葉身、葉鞘和鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...125 附錄 24、大蒜‘宜蘭白’葉身、葉鞘和鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...126 附錄 25、大蒜‘和美’蒜皮和蒜瓣揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析圖...127 附錄 26、大蒜‘大片黑’蒜皮和蒜瓣揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析圖....128 附錄 27、兩個不同來源的大蒜‘和美’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法所測得之總離子層析

圖………...129 附錄 28、兩個不同來源的大蒜‘大片黑’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法所測得之總離子層

析圖...130 附錄 29、大蒜‘和美’和‘古宅大蒜’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...131 附錄 30、大蒜‘混香蒜’和‘大片黑’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...132 附錄 31、大蒜‘廣西仁東玉林’和‘四川南蒜’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子

層析圖...133 附錄 32、大蒜‘四川新都紫皮蒜’和‘正月早新繁市場’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定

之總離子層析圖...134 附錄 33、大蒜‘越南紅膜早熟’和‘廣西崇左市扶綏縣’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定

之總離子層析圖...135 附錄 34、大蒜‘越南’和‘雲南昆明瓣蒜’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

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圖...136 附錄 35、大蒜‘大里彌度獨蒜’和‘廣州江南洱沅獨蒜’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定

之總離子層析圖...137 附錄 36、大蒜‘嘉定 2 號’和‘雲南昆明王旗營紫蒜’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之

總離子層析圖...138 附錄 37、大蒜‘廣東梯雲獨蒜’和‘河南白蒜’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子

層析圖...139 附錄 38、大蒜‘北京新發地’和‘彭州正月早’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子

層析圖...140 附錄 39、大蒜‘彭州丹景山二月早’和‘雲南昆明王旗營三瓣蒜’葉身揮發性成分以固相微萃

取法測定之總離子層析圖...141 附錄 40、大蒜‘彭州溫二早’和‘韓國暖地型’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子

層析圖...142 附錄 41、大蒜‘韓國昌寧’和‘蒼山蒲蒜’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...143 附錄 42、大蒜‘芳苑花蒜’和‘宜蘭白’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...144 附錄 43、大蒜‘四色菊府’和‘正月早彭州’葉身揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層

析圖...145 附錄 44、大蒜 30 個品種以 SPME-GC/MS 測定葉片揮發性含硫化合物之校正量...146 附錄 45、以固相微萃取法所得之 17 個葉片揮發性含硫化合物分析 30 個大蒜品種間之相

似性矩陣...147 附錄 46、大蒜‘和美’和‘古宅大蒜’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...148 附錄 47、大蒜‘混香蒜’和‘大片黑’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

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圖...149 附錄 48、大蒜‘廣西仁東玉林’和‘四川南蒜’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子

層析圖...150 附錄 49、大蒜‘四川新都紫皮蒜’和‘正月早新繁市場’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定

之總離子層析圖...151 附錄 50、大蒜‘越南紅膜早熟’和‘廣西崇左市扶綏縣’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定

之總離子層析圖...152 附錄 51、大蒜‘越南’和‘雲南昆明瓣蒜’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...153 附錄 52、大蒜‘大里彌度獨蒜’和‘廣州江南洱沅獨蒜’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定

之總離子層析圖...154 附錄 53、大蒜‘嘉定 2 號’和‘雲南昆明王旗營紫蒜’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之

總離子層析圖...155 附錄 54、大蒜‘廣東梯雲獨蒜’和‘河南白蒜’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子

層析圖...156 附錄 55、大蒜‘北京新發地’和‘彭州正月早’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子

層析圖...157 附錄 56、大蒜‘彭州丹景山二月早’和‘雲南昆明王旗營三瓣蒜’鱗莖揮發性成分以固相微萃

取法測定之總離子層析圖...158 附錄 57、大蒜‘彭州溫二早’和‘韓國暖地型’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子

層析圖，化合物編號對照表...159 附錄 58、大蒜‘韓國昌寧’和‘蒼山蒲蒜’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...160 附錄 59、大蒜‘芳苑花蒜’和‘宜蘭白’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析

圖...161

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附錄 60、大蒜‘四色菊府’和‘正月早彭州’鱗莖揮發性成分以固相微萃取法測定之總離子層析圖...162 附錄 61、大蒜 30 個品種以 SPME-GC/MS 測定鱗莖揮發性含硫化合物之校正量...163 附錄 62、以固相微萃取法所得之 20 個鱗莖揮發性含硫化合物分析 30 大蒜品種間之相似

性矩陣...164 附錄 63、大蒜‘和美’和‘古宅大蒜’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層析

圖...165 附錄 64、大蒜‘混香蒜’和‘大片黑’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層析

圖...166 附錄 65、大蒜‘廣西仁東玉林’和‘四川南蒜’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層

析圖...167 附錄 66、大蒜‘四川新都紫皮蒜’和‘正月早新繁市場’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之

總離子層析圖...168 附錄 67、大蒜‘越南紅膜早熟’和‘廣西崇左市扶綏縣’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之

總離子層析圖...169 附錄 68、大蒜‘越南’和‘雲南昆明瓣蒜’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層析

圖...170 附錄 69、大蒜‘大里彌度獨蒜’和‘廣州江南洱沅獨蒜’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之

總離子層析圖...171 附錄 70、大蒜‘‘嘉定 2 號’和‘雲南昆明王旗營紫蒜’’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之

總離子層析圖...172 附錄 71、大蒜‘廣東梯雲獨蒜’和‘河南白蒜’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層

析圖...173 附錄 72、大蒜‘北京新發地’和‘彭州正月早’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層

析圖...174

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附錄 73、大蒜‘彭州丹景山二月早’和‘雲南昆明王旗營三瓣蒜’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層析圖...175 附錄 74、大蒜‘彭州溫二早’和‘韓國暖地型’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層

析圖...176 附錄 75、大蒜‘韓國昌寧’和‘蒼山蒲蒜’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層析

圖...177 附錄 76、大蒜‘芳苑花蒜’和‘宜蘭白’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層析

圖...178 附錄 77、大蒜‘四色菊府’和‘正月早彭州’鱗莖揮發性成分以溶劑萃取法測定之總離子層析

圖...179 附錄 78、大蒜 30 個品種以溶劑萃取-GC/MS 測定蒜瓣揮發性含硫化合物之校正量...180 附錄 79、以溶劑萃取法-GC/MS 所得之 18 個鱗莖揮發性含硫化合物分析 30 個大蒜品種間

的相似性矩陣...181

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第一章前言

大蒜（garlic, Allium sativum L.）又名葫、蒜仔，為蔥科（Alliaceae）蔥屬（Allium）

之一、二年生單子葉蔬菜作物，原產於中亞一帶。大蒜為重要的世界性香辛作物之一，有許多不同的利用方式。在歐洲大蒜多用於食物的調味，在埃及大蒜除了用於烹煮外，亦用於食物保存上。大蒜還可加工製成大蒜油、蒜泥、蒜粉及加工醃漬品。大蒜另一重要用途為用於製藥，於古埃及大蒜即用於治療疾病和骨折，

在中國用於治療喘息氣塞、牙痛等症狀。近年更發現大蒜具有抗菌、降低心血管疾病、幫助新陳代謝和抗癌等功能，也常被製成藥品或保健食品（Keusgen, 2002;

Kamenetsky, 2007）。

大蒜於中國栽培歷史悠久，最早可追溯至漢朝，北魏賈思勰所著《齊民要術》

卷二〈種蒜〉記載：

「張騫周流異域，始得大蒜、葡萄、苜蓿。」

文中提到大蒜為西元前 113 年張騫出使西域時帶回中國，可據以考證大蒜於中國地區栽培超過二千年。於明．李時珍《本草綱目》卷二十六〈菜之一〉中介紹大蒜的藥性時提到：

大蒜「味辛、溫、有毒。久食損人目。」

大蒜在台灣早期由開台先民攜入，相關文獻紀錄可追溯到清．《台灣府志》

卷之七物產〈蔬之屬〉，推算大蒜於台灣栽植已有三百多年歷史。除了食用膨大的鱗莖（蒜頭）外，假莖（青蒜）或花苔（蒜苔）亦供食用（李, 2005）。

在台灣大蒜的採收期為 3 至 4 月，採收乾燥後在一般之通風倉庫可貯藏至 10 月，因此在每年 11 月至翌年 2 月為台灣大蒜青黃不接時期。大陸四川、山東等地之大蒜於每年 5 至 7 月間開始採收， 8、 9 月起即可大量出口，而且價格低廉、耐貯運，因此大陸蒜為國內走私蒜之最大來源，且台灣蒜與大陸蒜品質差異不顯著，對台灣蒜農造成

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不小的衝擊（方 , 2003）。

台灣蒜品質佳、辣味強（林和顏, 1995）；歐美進口蒜辣味弱、風味有不同；

東南亞地區的大蒜辣味過強，且蒜瓣小。各地市場需求及氣候土壤因素造成各地品種具有不同風味（Kamenetsky, 2007）。台灣大蒜品種間的揮發性成分曾以水蒸餾法結合氣相層析質譜儀（gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS）分析並加以比較（廖, 2003），但只針對五種主要精油成分。本研究使用固相微萃取法（solid-phase microextraction, SPME）分析台灣大蒜品種的揮發性化學物質之差異，並比較溶劑萃取及 SPME 配合 GC/MS 分析大蒜葉片及蒜球揮發性成分的效果。以收集自台灣、大陸、韓國及越南之 30 個品種，栽植於同一地點所採集之蒜球和葉片，分析大蒜品種在揮發性成分種類及相對含量的變化，可以做為有關大蒜風味特性及品種差異的參考。

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第二章前人研究

一、大蒜生產及種原

大蒜為淺根系作物，根為肉質不定根。莖短縮並在基部形成莖盤，於莖盤基部新生葉腋處第二至第六個側芽會直接發育成蒜瓣，或先分裂成 2 至 3 個鱗芽後，再分別肥大成蒜瓣（clove）（李, 2005）。鱗芽為兩層鱗葉（scaly leaf）和一個幼芽構成，外層鱗葉在鱗莖膨大後乾縮成膜狀保護膜（蒜膜），內層鱗葉則發育成肥厚的貯藏葉，幼芽由3 至 4 個葉原基（leaf primordia）圍繞著頂端分生組織（apical meristem）所形成（Brewster, 1994; DeMason, 1990）。蒜瓣集合成鱗莖（bulb）俗稱蒜球，蒜瓣一般有 1 ~ 50 個鱗莖，平均 15 個（Kamenetsky, 2007）。葉自莖盤中心長出，為互生葉，可分為葉身及葉鞘（leaf sheath），葉鞘部分互相抱合形成假莖（pseudostem），就是我們所食用的青蒜。花為繖形花，大蒜由於花朵雄蕊退化、染色體異常及減數分裂異常等因素，使得所有栽培品種皆不具稔性（Etoh, 1979）。花梗為實心圓柱形，於花序著生小花處會產生珠芽（aerial bulbils）又稱氣生小鱗莖，珠芽解剖形態與蒜瓣相似，可用以培育健康之無病毒種蒜（鄧和陳, 2005; 鄧, 2007）。

亞洲地區為大蒜主要生產區。依據 2006 年世界糧農組織統計年報，前三大生產國家依序為中國大陸（73.4 %）、印度（ 4.1 %）及韓國（2.1 %）（附錄 1）。大蒜亦為台灣秋冬季重要經濟作物。民國 95 年台灣蒜頭之栽培面積為 5,378 公頃，產量為 43,842 公噸，主要產地為雲林縣（市）、屏東縣（市）、花蓮縣（市）、彰化縣（市）及高雄縣（市），其中以雲林縣（市）產量（35644 公噸 , 81.3%）及栽培面積（4308 公頃 , 80.1%）最大。台灣栽培大蒜地方品種中較重要的有‘西港蒲蒜 ’、 ‘大片黑 ’、 ‘西螺白葉 ’、 ‘和美種 ’、 ‘北蒜 ’、 ‘印尼早生’及 ‘宜蘭白蒜 ’，而以 ‘和美種 ’及 ‘大片黑 ’為主要蒜頭品種，‘和美

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種’為早熟種，主要種植於彰化及雲林沿海鄉鎮，‘大片黑 ’則為雲林縣主要蒜種。

台灣種植的大蒜品種來源主要來自中國以及印尼，於1940 年代光復前，大蒜的栽培品種有‘黑葉硬骨’、‘西螺黑葉’、‘溫州’、‘學甲白’、‘砂蒜’、‘土蒜’及‘北白’七種，其中晚生硬骨種‘北白’和‘砂蒜’皆由中國浙江省崇明、錦州、餘姚等地引入。1960 年代由於品種名稱混亂，因此大致將大蒜依照外表性狀例如莖硬軟、

葉色濃淡、葉片寬狹進行歸類，此時期比較有栽培規模的有‘西螺白葉’、‘西港蒲蒜’、‘學甲軟骨’、‘鳳山選一號’及‘鳳山選二號’，其中‘鳳山選一號’及‘鳳山選二號’分別由‘西螺白葉’及‘大片黑’選出（邱和曾, 1983; 張和黃, 1998）。1970 年代大蒜栽培品種由於引種的關係數目逐漸增加，有經濟栽培的品種增加了‘學甲大片黑’、‘花蒜’、‘北蒜’和‘印尼早生’，其中‘北蒜’又名‘嘉定種’，來自中國大陸江蘇省嘉定縣，而‘印尼早生’是由印尼爪哇引進之耐熱品種。（林, 1993）。

大蒜分類上大致可以葉色深淺分為黑葉及白葉，而依植株老化後假莖的軟硬 程度可區分為硬骨種（A. sativum spp. ophioscorodon, hardneck）和軟骨種（A.

sativum spp. sativum, softneck）兩個亞種（subspecies），兩者最大的差異在於硬

骨種會產生花梗（flower stalk）但軟骨種不會（李, 2005; Kamenetsky, 2007）。

硬骨蒜葉鞘較纖維化，幼嫩時質地較粗，成熟時因假莖易產生木質化現象，因此較不適合做青蒜食用，但硬骨蒜耐熱、生長勢強，一般生產蒜球，代表品種為‘大片黑’和 ‘和美種 ’。而軟骨蒜老化後不會有木質化的現象產生，且假莖較柔軟，

因此常用以生產青蒜，代表品種為‘宜蘭白蒜 ’和 ‘北蒜 ’。日照長短為影響大蒜結球之重要因素，於美國、日本、法國等地栽培之大蒜品種屬於長日照品種，而台灣由於處於亞熱帶地區，主要品種以低緯度短日照品種為多，從歐美等地引進之大蒜品種在台灣無法結球，而從東南亞如印尼、菲律賓引進的品種雖亦為短日照品種，但結球較早且品質不佳。林（1993）提出適宜低緯度地區做為參考之大蒜分類，應依大蒜品種所需之日照長短分為極早生（日照需要8 小時）、早生（日照需10 小時及 11.5 小時者）、中早生（日照需 12 小時者）、中生（日照需 14

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至15 小時者）、中晚生（日照需 15 小時者）及晚生（日照需 15 小時以上者）

品種七群。台灣栽培品種中，‘西港蒲蒜 ’屬於極早生品種、 ‘大片黑 ’屬於中早生品種、‘北蒜 ’屬於晚生種，於台灣栽培做為青蒜。大陸品種多為中生品種，結球所需日照約 14 小時以上，在台灣種植時結球甚晚，常遇到雨季和低溫而不利結球，因此只是用於青蒜栽培，不適合用於蒜球生產（林, 1993）。

大蒜根系淺，性喜濕潤、不耐乾旱且耐重肥，因此常栽植於肥沃且排水良好之砂質壤土或壤土上。大蒜性喜冷涼之氣候，適合萌芽的溫度為 18 至 22 ℃ ，若溫度超過 26 ℃ 發芽有受到抑制的現象發生，並進而發生強迫休眠的情況。莖葉生長適溫為 15 至 20 ℃ ，若超過 26 ℃ 則易發生生長不良並枯萎的現象（李, 2005）。大蒜於鱗芽分化需要低溫的刺激，於 20 ℃ 以下的溫度即可完成鱗芽的分化，在田間種植時鱗芽的分化多於冬春低溫的季節進行。而蒜球的膨大的適溫為 15 至 20 ℃ ，加上長日、強光等環境因子，因高溫有助於養分往地下部輸送，加速蒜球生長（Brewster, 1990; Kamenetsky, 2007），因此在台灣大蒜適合秋冬季進行大蒜栽培生產，中北部的種植期在 9 月下旬至 11 月上旬，南部則在 10 月上旬至 11 月中旬，採收期為翌年 3 至 4 月（林, 2000）。

二、大蒜成分

大蒜具有特殊之氣味，常被用為食品中之辛香料或調味料。新鮮大蒜組織中除水外，含碳水化合物、蛋白質、氨基酸及含硫化合物等（附錄 2）（Brewster, 1994; Lee and Harnly, 2005; Shukla and Kalra, 2007）。大蒜氣味來源多屬含硫揮發性或半揮發性化合物，常見的含硫揮發性或半揮發性化合物之結構式及縮寫依 Shukla 和 Kalra（2007）列如附錄 3。

將新鮮大蒜切開或搗碎之後，可萃取出具有特殊氣味的主要含硫化合物，稱

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為蒜素（allicin, diallyl thiosulfinate），於正常情況下，大蒜組織中並無蒜素存在。

蒜球發育初期，細胞中的含硫物質主要以γ-glutamylcysteines 的形式貯存於組織中。γ-glutamylcysteines 可經由 γ-glutamyltranspeptidase （ EC 2.3.2.2 ）、 γ-glutamylpeptidase oxidase 等酵素水解或氧化作用催化後，產生無色無味的蒜胺酸或稱蒜鹼（alliin, (+)-S-(2-propenyl)-L-cysteine sulfoxide, 2-PECSO）累積於大蒜鱗莖中，並於成熟前一個月大量增加，可佔蒜球鮮重之14 %（Kamenetsky, 2007;

Keusgen et al., 2002）。蒜胺酸為蒜素的前驅物，當大蒜細胞受到物理性破壞而破裂時，蒜胺酸便與存在於液胞中的催化酵素蒜胺酸酶（alliinase, EC. 4.4.1.4）

迅速接觸及作用而轉換為蒜素。蒜素不但為新鮮大蒜特殊氣味的來源，亦被認為是大蒜中具有重要的生物功能性之成分（biologically active compounds）（Song and Milner, 2001）。

大蒜所含的有機硫化合物具抗菌以及醫療保健功能。Sofia 等人（2007）於培養基中添加3 %之大蒜，即可有效抑制 Baccillus cereus 和 Escherichia coli 之生 長，並認為大蒜具有抑菌的效果主要是由於含有allicin。研究指出 alliin、allicin、

diallyl disulfide（DADS）、diallyl trisulfide（DATS）、allyl propyl disulfide（APDS）

及 ajoene 具有降低血液中膽固醇濃度的功能，在抗氧化及防癌等生理功能上，

具有良好效果，ajoene 為蒜素在室溫下形成相對較穩定的化合物（Kamenetsky, 2007）。Agarwal（1996）讓健康的人及缺血性心臟病之病人每天食用 5 ~ 10 g 生的大蒜（raw garlic）2 ~ 3 個月，血液中的膽固醇（cholesterol）和三酸甘油酯

（triglycerides）的濃度皆明顯降低。大蒜具有抗凝血作用，可以減少冠狀動脈硬化及中風發生的機率，其中已知diallyl sulfide（DAS）、DADS、alliin 及 ajoene 等具有抑制血小板凝結的功能，ajoene 的效果最大。由動物實驗以及細胞培養實驗結果顯示 allicin、DAS、DADS、DATS、S-allyl cysteine、ajoene、S-allyl mercaptocysteine 等成分可抑制腫瘤細胞的增生，同時前面五種成分可透過降低致癌物的生物活性而降低癌症的發生率（林, 2001; Agarwal et al., 2007; Cheng et al., 1995）。抗氧化方面，除了前面所提到抑制腫瘤細胞增生的成分外，大蒜中

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alliin、allyl methyl disulfide（AMDS）和 allyl methyl trisulfide（AMTS）等物質亦有抗氧化的效果。含硫化合物可以透過直接清除細胞內活性氧分子(reactive oxygen species, ROS)及提高穀胱甘肽（glutathione, GSH）的方式，抑制活性氧分子所造成之血管內皮細胞脂質的過氧化傷害，也可抑制低密度膽固醇

（low-density lipoprotein, LDL）氧化及低密度膽固醇氧化物（oxidized low-density lipoprotein, Ox-LDL）對內皮細胞之傷害，而具有抗氧化的作用（Ide and Lau, 1999;

Corzo-Martínez et al., 2007）。

三、大蒜成分之分析方法

大蒜氣味相關研究，最早是由Wertheim於 1844 年所提出（Block et al., 1993;

Harris et al., 2001）。由於蒜素不穩定的特性，很容易降解成多種有機含硫物質

（organic sulfide compounds），其中包括DADS、DATS、DAS及ajoene等化合物

（Shukla and Kalra, 2007）。分析大蒜氣味的方式有水蒸氣蒸餾（steam distillation）

（Yu et al., 1989, Edris and Fadel, 2002）、溶劑萃取（solvent extraction）（Abu-Lafi et al., 2004）、超臨界二氧化碳萃取（supercritical fluid carbon dioxide extraction）

（Calvey et al., 1994）、頂空-固相微萃取（headspace-solid-phase microextraction, headspace-SPME）（Lee et al., 2003）及頂空法（headspace）（Pino, 1992）等萃取方式，再結合氣相層析質譜儀（gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS）

（Martín-Lagos et al., 1995）、高效液相層析儀/紫外光偵檢器（high performance liquid chromatography/ultra-violet detector, HPLC/UV）（Ichikawa et al., 2006）或液相層析質譜儀（liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS）（Calvey et al., 1994）等分析方式，其中以水蒸氣蒸餾法將精油（essential oil）蒸餾出後，結合 GC/MS為最常見的分析方法（Pino. 1992; Calvey et al., 1994; Ichikawa et al., 2006）。此所得之精油，主要成分為DAS、DADS與DATS（Block, 1985; Yu et al., 1989）。

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（一）分析樣品製備法

水蒸氣蒸餾是最常使用且使用歷史最久的方式，利用加熱使低揮發性物質能蒸發分離，而高沸點（150 – 250 ℃）的揮發性油類可藉由水蒸氣被攜出成為精油的一部份。但高溫以及水分子會使精油成分產生變化，由於熱分解或水解後產生的化合物例如硫化氫、乙醛醋酸等水溶性化合物會溶解在精油裡面，造成分析上的困擾（陳, 2006）。

溶劑萃取法是利用有機溶劑將樣品內揮發性及非揮發性物質溶出，溶劑依極性（polarity）又可分為極性及非極性溶劑，可依照萃取物的性質選用萃取溶劑。

溶劑萃取時可經過數次的溶劑交換萃取，達到揮發性及非揮發性物質之分離，所需的萃取時間較水蒸氣蒸餾法來得短且方便，但由於溶劑萃取通常仍需要經過加熱步驟，因此仍有分熱分解的問題產生，且有機溶劑易影響樣品內的產物生成，

因此常有人工產物（artifacts）的形成（陳, 2006）。

頂空法是將一定量的樣品放入足夠容積的密封氣體擴散瓶中，於恆溫下達到平衡後即可進行分析。此法因為只需要樣品的頂空揮發氣體，不需要複雜的前處理即可分析，且不經過加熱或添加溶劑，可以較真實的反應樣品的揮發性化合物組成，但此法需要專門的頂空取樣設備，若氣相中含有大量的空氣和水蒸氣，會降低分析時的靈敏度，而且水分對於GC 的分離及質譜的穩定性都有影響，造成分析上的困擾（劉, 2003）。

超臨界二氧化碳萃取法是使二氧化碳處於臨界狀態進行萃取的方法，物質皆具有氣、固、液三相，當溫度及壓力超過其臨界溫度及臨界壓力時，就進入所謂的超臨界流體狀態，物質在未達臨界點前，常存在明顯氣、液兩相之間的界面，

但到達臨界點時，此界面即消失不見。使用超臨界二氧化碳萃取法時，因樣品處於低溫環境下，減少樣品中化合物的變質，此外超臨界流體有如氣體幾乎無表面張力，因此很容易滲入到多孔性組織中。因溶解能力會隨溫度及壓力而不同，因此可藉由溫度及壓力的改變對於化合物進行選擇性分離。但此法所需的費用太高，造成其應用上的限制（Poliakoff et al., 1989）。

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頂空-固相微萃取法（headspace-SPME）為新興的萃取方式，由 Arthur 和 Pawliszyn 於 1990 年提出。SPME 是以高分子聚合物當萃取靜相，利用分析物與高分子聚合物之間的親和力，使分析物於樣品基質與纖維表面相間進行平衡分配

（equilibrium partition），因此可達到結合了取樣、萃取及濃縮等過程，將傳統繁瑣的萃取步驟合併成單一步驟的功能。SPME 也可直接將樣品注入儀器分析，

具有攜帶方便、採樣及萃取時間短、處理速度快、可重複使用、不需大量樣品、

不需溶劑脫附等優點，因此近年來越來越多研究採用此法為分析工具。SPME 裝置的結構類似注射針筒（附錄 4），主要包含兩個部分，一為固定器（holder），

另一為塗覆高分子吸附固定靜相的熔融矽纖維（fused silica fiber），此纖維與不鏽鋼管以耐高溫之環氧樹脂黏著，裝置於固定器內。固定器主要功能在於固定並支持纖維，控制纖維的伸縮及調節其於樣品中的深度。由於纖維相當脆弱，因此於纖維外層有一不銹鋼針管（septum-piercing needle）保護，以增加纖維重複使用的機械強度。熔融矽纖維的部分可根據待測物的特性，塗覆適合的高分子聚合物，以得到最好的吸附（trap）效果，纖維種類具有多重選擇。由附錄 5 所示，

使用時當推桿（plunger）往下壓纖維即會從不銹鋼針管中露出，推桿上有一推桿固定螺絲（plunger retaining screw），當推桿固定螺絲下推碰觸到 Z 型（Z-slot）

溝槽的轉角處，即可順時針旋轉將推桿固定使推桿無法回彈，纖維長度亦可藉此固定。當樣品吸附完成後，將纖維收回不銹鋼針管中，攜至氣相層析儀注入口將不銹鋼針管插入，如同樣品萃取時的操作方式進行數分鐘熱脫附，將纖維上吸附的物質脫附下後即可進行分析，而 SPME 亦可抽出，繼續進行下個樣品的吸附

（Supelco, 1998）。

SPME 常與 GC/MS 及 HPLC 結合使用，應用範圍包括：揮發性有機化合物分析（Langenfeld et al., 1996）、空氣、廢水及土壤等環境分析（Chia and Pawliszyn, 1995; Thomas et al., 1996）、農藥檢測（Chen et al., 2007）、食品分析（Miller and Stuart, 1999）、藥物檢驗（Huang et al., 2002）等，而 SPME-GC/MS 是最常用於分析蔬果產品及加工品的芳香成分及風味等，例如：蘋果（Young et al., 2004）、

(29)

芝麻菜（Jirovetzet al., 2002）、起司（Chin et al., 1996）、酒類（Ng et al., 1996）

等。此法亦曾用於分析 Allium 屬雜交種的香氣組成並加以鑑別（Ohsumi et al., 1993; Boscher et al., 1995; Keusgen et al., 2002; Storsberg et al., 2004）。Rohloff

（1999）以此方式測定歐薄荷（Mentha x piperita L.）葉和花之精油組成，結果顯示SPME 分析具有高可信度且省時。但吸附方式屬於競爭型吸附（competitive absorption），使用時因吸附線性範圍（linear range）小，定量常遭遇困難，需配合使用其他的校正方法。

（二）分析方法

高效能液相層析(HPLC)適用於半揮發性和非揮發性化合物或遇熱易被裂解的待測物，應用此方法進行分析的先決條件是標的待測物必須溶於移動相的溶劑中。由於移動相的溶劑是在加壓狀況下輸送，所以最初被稱為高壓液相層析( High pressure liquid chromatography )。其分析原理是藉移動相通過靜相達到分離的效果；混合物中的各成分在靜相和移動相之間的分配係數不相同，即親和力不同，

使其在管柱中的滯留時間不同而得以分離。當化合物與靜相親和力較強，則滯留時間長，當化合物與移動相的親和力較強，則滯留時間短，依此，樣品中的標的待測物得與共同萃取出來的干擾物分離（Harris, 2003b）。

氣相層析儀（GC）為近代分析揮發性化合物的重要工具，主要分成注射器

（injector）、管柱（column）、偵測器（detector）和記錄器（recorder）四個部分（附錄6）。其原理是將樣品於注射器完全氣化後，藉由載體氣體（carrier gas）

例如氮、氫或氦氣，通往管柱的部分。由於管柱中充填了固相的載體，載體表面附著一層薄薄的液體，因此當樣品通過時，雖然氣相的攜帶氣體會帶動樣品往前行，但載體上的液相薄層會與樣品間有互相吸引的拉力，而化合物的移動速率由此二作用力的淨值大小決定。不同化合物的作用力淨值不同，造成了移動速率的差異而導致化合物間的分離，但並不是每一種化合物皆可分離，管柱的填充物會決定化合物的分離效果，所以分析不同化合物時應選擇適合的管柱才能達到最好

(30)

的分析效果。管柱位於可調整溫度的烘箱（oven）中，當溫度越高時，氣體流動的能力越大，因此與液相的平衡改變，試驗進行的速率會變快，但分析效果變差，

雖然藉由壓力的控制亦可以改變氣體的流動速度，流速越快實驗進行速度也會變快，但相較之下，藉由流速的變化來改進分離效果的成效較差，因此大多分析仍採用控制管柱溫度來改善樣品分離效果。GC 的偵測器有質譜儀（ mass spectrometry, MS）、火焰離子化偵檢器（flame ionization detector, FID）、電子捕捉偵檢器（electron capture detector, ECD ）及熱傳導度偵檢器（ thermal conductivity detector, TCD）等，最常用的為 FID。除 MS 可同時提供定性與定量資訊外，所有偵檢器僅能提供定量資訊（Harris, 2003c）。

MS 的原理為利用熱電子撞擊氣體分子，使其於離子源內離子化（ionization）

產生碎片及離子；帶電粒子於電場中因具有不同之荷質比（mass to charge ratio），

其電場中之運行軌跡亦不同，因此可以區分離子之質量，進而判斷其分子式。分析揮發性化合物時，GC/MS 為常用的分析組合。最後於偵測器所得之訊號，經放大後送到記錄器中，就可將訊號畫出，而不同的化合物因性質有所差異，訊號強度（abundance）上也會有所不同（Harris, 2003a）。

（三）萃取時影響大蒜成分分析之因子

大蒜萃取常因貯藏時間的長短，以及製備過程的外在條件、處理方式及分析方法的不同，而造成產物-含硫化合物-種類以及含量的改變（Schmitt et al., 2005）。不同的萃取方法所得之產物有所差異，萃取溶劑 pH ≧ 10 時，所得之產物主要為DADS、AMDS；於水蒸餾萃取法所得之產物還增加 DATS 和 AMTS；

以酯類（ether）、己烷（hexane）和油（oil）進行萃取時，所得之產物除前述四種，還有3-vinyl-4H-1,2-dithiin 和 2-vinyl-4H-1,3-dithiin 等，因此萃取方式不同得到之產物亦不同（Harris et al., 2001）。Yu 等人（1994）利用 GC/MS 對於 alliin 進行分析，於不同pH 下所得產物也不同，pH = 3 時，主要的產物為（allylthio）

acetaldehyde、3-（allylthio）propanal、3,6-dimethyl-1,2,5-trithiepane、(allylthio)acetic

(31)

acid、allyl alcohol 和 acetaldehyde；pH = 5 時，與 pH = 3 時所得產物差異甚大，

主要為 DAS 、 2-methyl-1,4-dithiepane 、（ allylthio ） acetic acid 、 DADS 、 2-ethyl-1,3-dithiane 、 4,6-dimethyl-1,2,5-trithiepane 、 3,6-dimethyl-1,4-dithiane 、 mercaptan 、 acetaldehyde 、 2-acetylthiazole 、 sulfur dioxide 、 ethyl acetate 和 1-propene；pH=7 及 pH=9 時，所得之產物除有 pH=5 時所得之前九種產物外，

還有 allyl alcohol。有研究指出，萃取大蒜時隨著溫度升高，由氨基酸降解所產生的硫化物也越多，主要的成分為 DAS、DADS、DATS、diallyl tetrasulfide 和 allyl alcohol；高於 140 ℃後會產生含硫的環狀化合物 2,5-dimethyl-1,4-dithianes、

2-methyl-1,4-dithiepane 、 3-vinyl-4H-1,2-dithiin 、 2-vinyl-4H-1,3-dithiin 和 dimethyl-1,2,5-trithiepanes，此類型化合物是典型不需經由酵素作用而產生的化合物（Yu et al., 1989; Kubec et al., 1997）。但亦有研究者提出不同看法，以低溫萃取結合‘Cryogenic’ GC/MS、on-column injection 及液相層析儀進行大蒜成分的分析比較，仍然觀察到3-vinyl-4H-1,2-dithiin 和 2-vinyl-4H-1,3-dithiin 的存在，因此認為此二環狀含硫化合物並非因高溫處理造成，而是新鮮大蒜中的主要含硫成分之一（Abu-Lafi et al., 2004）。

四、化學分類法

植物分類除利用形態性狀、細胞學分類（cytological classification）外，還有化學分類（chemotaxonomy）及近年之分子分類（molecular classification）等方式。使用大蒜的外觀形態及生理特徵可將目前台灣的大蒜栽培品種分成‘小黑葉’、‘大黑葉’、‘花蒜’、‘印尼早生’及‘宜蘭白’五種（蕭, 2004）。但若欲探討更多品種間之差異，則因相似度高而窒礙難行。所以隨著生化科技的進步，補充或輔助外部形態分類的方式逐漸被開發及利用。

化學分類法是結合生物化學技術，對於生物體內的化學特徵進行分類，即以成分、結構或性質為依據所建立的分類法。因化學成分是酵素（enzyme）的產物，而酵素由基因調控產生，基於此而有化學分類法，而被分析的化學成分大多

(32)

為生合成產物，例如生物鹼、蛋白質、類黃酮、花青素、揮發性成分等（Wang et al., 2004; Lahtinen et al., 2006）。不同品種大蒜中的含硫揮發性物質組成亦有所差異。利用固相萃取（solid-phase extraction, SPE）以 GC/FID 及 GC/MS 分析 11 種大蒜的游離胺基酸（free amino acid）和半胱氨酸硫氧化物（cysteine sulfoxide composition, CSO），結果顯示硬骨大蒜的平均總氨基酸含量及 CSO 化合物較軟骨大蒜高（Lee and Harnly, 2005）。廖（2003）使用水蒸氣法萃取台灣 24 種大蒜品系，並配合GC/MS 分析精油組成，指出各品系之大蒜精油成分大致相同，

主要成分皆為DAS、DADS、AMDS、DATS 和 AMTS 五種，但其他精油組成分也有差異。以 5 種主要成分進行集群分析法（cluster analysis）之多變量統計分析結果，可將 24 種大蒜分成 4 群，代表品種分別為‘嘉義’、‘西螺白葉’、‘大片黑’及‘安南區花蒜’。‘安南區花蒜’的 DAS、DADS 及 DATS 的含量較其他三種低，

而有較高的AMDS 和 AMTS；就 DAS 含量，‘嘉義’、‘西螺白葉’和‘大片黑’三品系相近，而 DADS 含量以‘嘉義’為高，DATS 含量以‘西螺白葉’為高。Boscher 等人（1995）分析大蒜栽培種（A. sativum）及野生種（A. paniculatum、A. ursinum 和 A. vineale）葉片、鱗莖及珠芽的含硫成分，比較不同種及不同植株部位的差 異。試驗結果顯示栽培種大蒜含有較高的 allyl disulphide，但只微量的 methyl disulphide、propyl disulphide 和 propenyl disulphide，野生種卻以 methyl group 為主。Muoio 等人（2004）以薄層層析法（thin layer chromatography, TLC）分析栽 培種大蒜和野生種蒜（A. subhisutum、A. pendulinum、A. roseum 和 A. triquetrum）

的成分，並比較之間的差異，試驗結果顯示栽培種大蒜含有 DAS、allycin、

dipropylthiosulfinate 和 S-methylcysteine，且含硫化合物含量皆較野生種蒜高。

Baghlian（2005）以蒜素含量及鱗莖性狀調查 24 個伊朗地區生態型（ecotype）

並進行分群，結果顯示分群與地理分佈無顯著相關性。由此可知，不同種或不同品種的蒜，於成分組成上亦有所差異。但由於化學分類法所用之化合物為基因的產物，因此易受到環境的調控而產生差異表現，再者有些分類的化合物並非維持生物生存的必要物質，例如二次代謝物，因此在個體發育的過程中，這些物質的

(33)

含量會因為階段和部位的不同而有變化。大蒜不同部位的香氣含量以及組成有差 異，有文獻指出比較中美到北美的五種 Allium 植物中之總揮發性含硫化合物，

葉片含量較蒜球高，於成分上，蒜球中的methyl sulphide 和 allyl sulphide 的含量較葉片高（Randle and Lancaster, 2002）。

(34)

第三章材料與方法

一、試驗材料

試驗材料為台中區農業改良場（彰化, 大村）所栽植的 30 種大蒜(A. sativum L.)，包括 22 種大陸品種、4 種台灣品種、2 種韓國品種及 2 種越南品種，以及購自傳統市場的‘和美’與‘大片黑’。供試材料品種名稱及來源如表 1 所示。

二、試藥與儀器設備

（一）試藥及溶劑

1. 正己烷：GC 級，Merck，Germany 2. 二氯甲烷：99.9 %，J. T. Baker，USA 3. 無水硫酸鈉：98.5 %，nacalai tesque，Japan 4. 硫酸：97 %，nacalai tesque，Japan

5. 內標準品：US EPA method 8270 internal standards 4 mg/mL，AccuStandard，

USA

（二）儀器及設備

1. 游標尺：CD-6” CS，測定範圍 0 至 150mm，最小表示量 0.01 mm，Mitutoyo，

Japan

2. 葉綠素計（chlorophyll meter）：SPAD-502，Minolta，Japan 3. 電子天平：M-220，Denver Instrument，U.S.A

3. 粉碎機：RT-02B，Rong Tsong，Taiwan 4. 震盪器：G-560，Scientific Industries，U.S.A

5. MilliQ：Q-gard 1 / Quantum Ex 超純水純化管柱，Millipore，U.S.A 6. 水浴槽：B206，Firstek Scientific，U.S.A

7. 乾浴槽：國洲儀器，台灣

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8. GC/MS：GC/MS 為 HP-Aglent 5890 II plus GC-5972 MSD（Agilent），分析管柱為DB-5-MS（30 m × 0.25 mm ID，膜厚 0.25 μm，Agilent, USA），載體氣體為氦氣

9. 固相微萃取纖維：50/30 μm DVB/ PDMS，Supelco，USA

三、試驗方法

（一）大蒜品種基本性狀 1. 性狀調查

除市場所購蒜球外，所有供試品種於2007 年 10 月 15 日種植於台中區農業改良場試驗田區，種植80 天後每品種逢機標定 3 株進行品種特性調查。調查項目如下：

（1）假莖寬度：以游標尺測量離地 1 公分最寬處。

（2）假莖高度：測量由地面至最上位的葉身基部距離。

（3）葉片長度：測量最長葉之葉身基部到葉尖的距離。

（4）葉片寬度：測量最長葉之葉身基部的寬度。

（5）葉色：以葉綠素計進行測量，測量最長葉之葉片頂部、中間和基部的讀值，取三點平均。讀值越高表示葉片顏色越濃綠。

（6）總葉片：超過 5 公分之葉片即記錄為一片葉。

（7）生長勢：分為盛、中及弱（盛 = 3、中 = 2 及弱 = 1），以台灣本地品種‘和美’的生長勢做為對照，‘和美’為盛。

（8）葉姿：以肉眼觀察葉片與地面的角度。

採收後蒜球乾燥（在台中改良場進行）供試，每品種蒜球測量三個，調查項目如下：

（1）重量

（2）蒜球周徑：測量蒜球最大周長。

（3）蒜球重量

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（4）軟骨/硬骨：是否有抽花莖，有為硬骨、無為軟骨。

（5）蒜瓣數

2. 數據分析

基本性狀調查之數值輸入Microsoft Excel XP（Microsoft Co., 2002）計算平均值及標準差，之後將平均值取對數利用SAS 8.01（SAS Institue Inc., 1999-2000）

以相關性矩陣(correlation matrix) 分析的結果，進行主成分分析 (principle coordinate analysis, PCA)。此外，將假莖寬度、假莖高度、葉長、葉寬、葉綠素計讀值、葉數、生長勢、硬軟骨、鱗莖周徑、鱗莖重量及蒜瓣數取對數後，利用 R 2.4.1（Statistics Dept. of U. Auckland, U.S.A）計算歐氏距離（Euclidean distance）：

( )

∑

=

−

= ⁿ

i

i q

p d

1

2

1. p、q 為不同觀測樣品

2. i 為該觀測樣品之待測物種類

計算參試材料間的相似度(similarity)，以平均連結法(average linkage)計算兩兩品種間的相似度矩陣(similarity matrix)，進行群聚分析(cluster analysis)，並繪出樹狀圖。

（二）揮發性化合物分析 1. 樣品準備

於2008 年 1 月 4 日標定田間（台中區農業改良場）新生葉片，之後‘和美’、

‘大片黑’及‘宜蘭白’三品種在標定後 20（1 月 24 日）、40（2 月 13 日）及 60 天

（3 月 3 日）取葉身進行分析，60 天者的樣品另外分成葉身、葉鞘及還未乾燥的蒜瓣部分；其餘品種則於標定後40 天取葉身進行分析。每個大蒜品種逢機選取三株之標定葉片，自田間取回後以液態氮冷凍儲存於-80 ℃備用。蒜球於 2008

(37)

年三月初至四月底採收乾燥後，每品種逢機取3 顆蒜球（由台中區農業改良場提供）置於25 ℃乾燥環境備用。此外，以市場所購之‘和美’和‘大片黑’蒜球分成蒜皮及蒜瓣兩部分進行分析。

2. 樣品切碎以水為酵素反應媒介，再以 SPME 吸附

樣品製備方式改自Storsberg等人（2004）所使用的方法，將1 g之新鮮大蒜葉片、葉鞘、蒜皮切成0.4 × 0.4 cm²或去皮大蒜切成0.2 × 0.2 × 0.2 cm³大小裝入20 mL頂空瓶中，加入5 mL二次水後，以32 ℃乾浴恆溫加熱30分鐘使大部分的酵素反應結束，之後加入10 μL之0.1 M硫酸抑制酵素活性。加入0.6μL之內標準品後，

以SPME纖維吸附10分鐘，直接於GC/MS注射口進樣，進樣方式為熱脫附30秒。

脫附後啟動GC/MS進行分析。

GC/MS操作條件為進樣注射後使用不分流（splitless injection）模式，GC分析期間讓纖維繼續熱脫附20分鐘，以確保吸附纖維上之化學物質已完全脫附。升溫條件為起始溫度40 ℃維持3分鐘，以5 ℃/min的速度升至200 ℃，並在200 ℃維持3分鐘。注入口溫度為280 ℃，偵測器溫度為280 ℃，使用之偵測器為質譜儀。

管柱中的載體氣體為氦氣，流速為 1 mL/min。所得之質譜數據以Wiley275（Wiley, USA）和NIST05（National Institute of Standards and Technology, USA）之質譜資料庫進行比對分析。

3. 溶劑萃取

樣品製備方式改自Abu-Lafi等人（2004）所使用的萃取法，將新鮮大蒜去皮後，秤取8 g置於液態氮中冷卻，於低溫時立即以磨粉機磨碎，之後置入50 mL血清瓶中。於0 ℃下，將28 mL之溶劑（正己烷(v)：二氯甲烷(v)＝7：3）及12 mL 二次水加入粉末中，以震盪器使其混合均勻後，置於90 ℃的水浴槽中恆溫加熱 30分鐘。自水浴槽取出後迅速置入冰桶中降溫，之後於0 ℃下進行抽氣過濾，隨之加入無水硫酸鈉於10 ℃中震盪過夜。所得之萃取溶液存放於-20 ℃中待測。分

(38)

析前取1 mL樣品添加內標準品10 μL後，進行GC/MS分析，樣品注入量為1 μL。

GC/MS操作條件為進樣注射後使用分流模式。升溫條件為40 ℃維持3分鐘後，以3 ℃/min升至300 ℃，維持3分鐘。注入口溫度為280 ℃，偵測器溫度為280

℃，使用之偵測器為質譜儀。管柱中的載體氣體為氦氣，流速為 1 mL/min。所得之質譜數據以Wiley275和NIST05之質譜資料庫進行比對分析。

4. 數據分析

GC/MS 分析結果所得各品種成分圖譜資料，以 Initial Threshold 為 12 時所得的各類化合物積分面積數值，若於此條件下無法獲得積分值時，則該品種中此含硫揮發性化合物積分面積數值記錄為未檢出（not detected, ND）。將所得的數值輸入Microsoft Excel XP 中進行下一步的分析。並用內標準品之積分面積進行相對校正，公式一（吳等人, 2007）：

Calibrated

S S A A A

abundance ^IS

IS

IS'和美'× '和美'

×

=

1. Calibrated abundance：指標化合物校正量

2. A：樣品中指標化合物之總離子質譜層析圖（total ion chromatogram）之波峰 積分面積

3. Ais：參試樣品之內標準品之波峰積分面積 4. Ais‘^和美’：‘和美’之內標準品之波峰積分面積 5. S：參試樣品之頂空瓶進樣量

6. Sis‘^和美’：‘和美’之頂空瓶進樣量

由於各成分之積分值為各化合物的相對的反應量，因此利用SAS 8.01 以相關性矩陣分析的結果，進行主成分分析。此外，利用R 2.4.1 以歐氏距離（Euclidean distance）計算參試材料間的相似度（similarity），以平均連結法（average linkage）

計算每兩個材料間的相似度矩陣（similarity matrix），進行群聚分析（cluster analysis），並繪出樹狀圖。

(39)

表1、參試 30 種大蒜之編號、材料名稱、來源國家及提供來源。

Table 1. The number, cultivar names, sources and donor of 30 garlic (A. sativum) used in study.

編號 No.

品種名稱 Name

國家 Origin

提供來源 Donor

1 和美台灣台中改良場

2 古宅大蒜中國大陸台中改良場

3 混香蒜中國大陸台中改良場

4 大片黑台灣台中改良場

5 廣西仁東玉林中國大陸台中改良場

6 四川南蒜中國大陸台中改良場

7 四川新都紫皮蒜中國大陸台中改良場

8 正月早新繁市場中國大陸台中改良場

9 越南紅膜早熟越南台中改良場

10 廣西崇左市扶綏縣中國大陸台中改良場

11 越南越南台中改良場

12 雲南昆明瓣蒜中國大陸台中改良場

13 大里彌度獨蒜中國大陸台中改良場

14 廣州江南洱沅獨蒜中國大陸台中改良場

15 嘉定２號中國大陸台中改良場

16 雲南昆明王旗營紫蒜中國大陸台中改良場

17 廣東梯雲獨蒜中國大陸台中改良場

18 河南白蒜中國大陸台中改良場

19 北京新發地中國大陸台中改良場

20 彭州正月早中國大陸台中改良場

21 彭州丹景山二月早中國大陸台中改良場

22 雲南昆明王旗堂三瓣蒜中國大陸台中改良場

23 彭州溫二早中國大陸台中改良場

24 韓國暖地型韓國台中改良場

25 韓國昌寧韓國台中改良場

26 蒼山蒲蒜中國大陸台中改良場

27 芳苑花蒜台灣台中改良場

28 宜蘭白台灣台中改良場

29 四色菊府中國大陸台中改良場

30 正月早彭州中國大陸台中改良場

31 和美台灣草屯市場

32 大片黑台灣草屯市場