以RAPD技術進行白及種原之遺傳歧異度分析
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(2) 白及之 RAPD 親緣分析. 傳控制，亦會受外在環境因子及人為觀點所影 響 ， 產 生 鑑 定 結 果 的 差 異 (Fu et al. 1997; Weising et al. 1995)。利用 DNA 分子標誌可直 接 鑑 定 植 物 基 因 型 之 遺 傳 歧 異 度 (genetic diversity)，不會受環境、植物發育時期及人為 因素影響，其結果較傳統利用植物性狀鑑定更 具客觀、準確與快速性 (Fu et al. 1997; Millan et al. 1996; Pejic et al. 1998; Williams et al. 1990)。由於白及屬植物一般難以植株與花朵外 表形態進行辨別；且台灣各地理位置所採集之 台灣白及其花朵與植株形態雖有差異存在但卻 為同種植物，更增加鑑別的困難度，因此以分. 255. 子標誌釐清其遺傳歧異度有其必要性。本研究 以分子標誌之逢機增幅多型性 DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD) 探討台灣 各地所採之台灣白及種內遺傳歧異度並輔以白 及屬之其他白及種原進行分析，藉此探討台灣 白及以及白及屬種原之間的親緣關係。. 材料與方法 植物材料 本研究使用的 25 個白及樣品來源分別為 野外採集或蒐集自民間業者 (表 1)。. 表 1. 試驗白及樣品之編號、物種名及其產地或採集地資料 Table 1. Bletilla samples’ name and its collection information Code name. Species. Collected country or region. Note. BS1. Unknow. China. Bought from Ying Qiao Orchids. BS2. B. striata. Japan. Bought from He Chen Orchids. BS3. B. striata. Japan. Bought from Shan Ye Orchids. BL. B. formosana. Region unknown, Taiwan. Gift from Ms. G. C. Chen. BO. B. ochracea. China. Gift from Ion Angel Orchids. BFS. B. formosana. Lanyu, Taitung county. Self Collected. BF1. B. formosana. Nangang, Taipei county. Self Collected. BF2. B. formosana. Pingsi, Taipei county. Self Collected. BF3. B. formosana. Shihding, Taipei county. Self Collected. BF4. B. formosana. Wulai, Taipei county. Bought from Banciao flower market. BF5. B. formosana. Lalasan, Taoyuan county. Bought from Banciao flower market. BF6. B. formosana. Fushan, Yilan county. Bought from Banciao flower market. BF7. B. formosana. Beipu, Hsinchu county. Self Collected. BF8. B. formosana. Suhua Highway, Yilan. Self Collected. BF9. B. formosana. Suhua Highway, Hualien. Gift from Ms. G. C. Chen. BF10. B. formosana. Nanshan, Yilan county. Gift from H. L. Lay Pro., NPUST. BF11. B. formosana. Lishan-Yilan branch line. Bought from Shan Ye Orchids. BF12. B. formosana. Lochao, Hualien county. Gift from H. L. Lay Pro., NPUST. BF13. B. formosana. Kukuan, Taichung county. Collected from Mr. Zhen-Yu Weng, TARI Gift from Flower Research Center, TARI. BF14. B. formosana. Shueili, Nantou county. BF15. B. formosana. Region unknown. Bought from Banciao flower market. BF16. B. formosana. Tongpu, Nantou county. Self Collected. BF17. B. formosana. Alishan-1, Chiayi county. Self Collected. BF18. B. formosana. Alishan-2, Chiayi county. Self Collected. BF19. B. formosana. Wutai, Pingtung county. Gift from H. L. Lay Pro., NPUST.
(3) 256. 台灣農業研究. DNA 之萃取與分析 葉片 DNA 萃取參考 Bornet & Branchard (2001) 的 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 方法進行。所萃取的 DNA 經 OD 值測定濃度 後以電泳分析判別 DNA 品質後使用。. 第 58 卷. 第4期. 結. 果. 首先以 Operon A1-20、B1-20、Y1-20、Z1-20 等共 80 個 RAPD 引子經由初步篩選獲得清 晰、具有多型性及再現性良好之 12 個引子，其 引子編號分別為 OPA08、10、12、18；OPB07、. PCR 反應與分析. 08、10、13；OPY03、15、16；OPZ13。接著. PCR 反應試劑 PCR Pro Taq 反應套組購自 波士特生技公司 (ProTECH，台灣)。以 100 ng DNA 為模板在總體積 20 µL 反應溶液中進行， 反應內含 2 µL 10× PCR buffer、1.6 µL 2.5 µM dNTPs (dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、4 µL 2.5 µM random primer (Operon)、0.4 µL ProTaq DNA polymerase (2 unit/µL) ， 反 應 置 於 PCR 儀 (BIORAD MyCycler, USA) 中進行，反應條件 為 94℃ 2 分鐘，再以 94℃ 1 分鐘，37℃ 1 分 鐘，72℃ 2 分鐘，循環 39 次，最後一次循環 94℃ 1 分鐘，37℃ 1 分鐘，72℃ 12 分鐘，反應 完成後以 4℃保存。反應取出後加入 4 µL 的 6× loading dye 混合後，以 2.0%的瓊脂凝膠進行電 泳分析，經 ethidium bromide 染色後在 UV 燈 下觀察膠體上條帶之呈現，並照相存檔做為後 續分析之用。. 以中國、日本與台灣共 25 個白及樣品之 DNA 模板配合上述 12 個引子進行 PCR 反應，結果 共產生 165 個條帶，其中 161 個為多型性條帶， 平均每個引子可產生 13.8 個條帶及 13.4 個多型 性條帶，多型性百分率為 97.6% (表 2)。PCR 的電泳分析圖顯示，以 OPA08 分別於 280 bp 與 490 bp 分子量產生中國白及與黃花白及專一 性條帶，於 200 bp 產生部份台灣產區之白及 (BL、BF7、BF11-14、BF16-18) 專一性條帶， 於分子量 250 bp 產生紫紅色花日本白及 (BS3) 專一性條帶 (圖 1A)。OPA10 引子可分別於分 子量 520 bp 與 650 bp 產生中國白及專一性條帶 (圖 1B)。以 OPA12 引子可於分子量 490 bp 產生 日本白及之專一性條帶，部份台灣白及 (BL、 BF2-4、BF6-9 與 BF15-17) 可於 260 bp 產生專 一性條帶，與其他種白及區分 (圖 1C)。以. 逢機引子篩選. OPB08 引子於分子量 430 bp 與 300 bp 產生中. 以 A1-20、B1-20、Y1-20、Z1-20 (Operon, USA) 共 80 個逢機引子進行 PCR 反應，初步 以台灣坪林地區採集之白及 DNA 為模板進行 引子篩選，依其結果選出可顯現清楚條帶並產 生多型性的 12 個引子，作為後續 25 個白及樣 品分析之用，試驗共重複進行 3 次。. 國白及專一性條帶 (圖 2A)；使用 OPB13 引子. PCR 標誌資料分析 利用 Gel-Compar II, Version 3.5 軟體依 Dice coefficient 方法 (Nei & Li 1979) 計算兩樣 本 間 的 相 似 度 ， 之 後 以 軟 體 中 的 UPGMA (unweighted pair-grouping mean arithmetical) (Sneath & Sokal 1973) 法估算樣品間的遺傳相 似度，並據此繪製親緣關係樹狀圖。. 可產生中國產區之中國白及與黃花白及此二白 及共有的專一性條帶，分子量為 210 bp 與台 灣、日本白及加以區分，台灣白及則於 200 bp 與 300 bp (BF16-18) 分子量產生專一性條帶 (圖 2B)。 利用 Nei & Li (1979) 方法計算兩兩樣本 間的相似度，並以軟體中的 UPGMA (Sneath & Sokal 1973) 法估算樣品間的遺傳相似度，結果 顯示中國、日本與台灣地區之白及相似度在 39.3–94.7%之間 (表 3)，且經由軟體之群叢分 析與所建構出親緣關係樹狀圖之結果，可將參 試之 25 個白及物種區分成中國、日本與台灣 3.
(4) 白及之 RAPD 親緣分析. 257. 表 2. RAPD 分子標誌使用的引子名稱、DNA 序列、PCR 產生之條帶數、多型性條帶數及其比率 Table 2. DNA fragments and polymorphism produced from 12 of RAPD primers Primer. Primer sequence (5’￫3’). No. of polymorphic fragments. Polymorphic index (%). OPA08. gTg ACg TAg g. Total fragments 16. 16. 100.0. OPA10. gTg ATC gCA g. 15. 14. 93.3. OPA12. TCg gCg ATA g. 18. 18. 100.0. OPA18. Agg TgA CCg T. 13. 12. 92.3. OPB07. ggT gAC gCA g. 13. 12. 92.3. OPB08. gTC CAC ACg g. 14. 14. 100.0. OPB10. CTg CTg ggA C. 15. 15. 100.0. OPB13. TTC CCC CgC T. 15. 15. 100.0. OPY03. ACA gCC TgC T. 16. 16. 100.0. OPY15. AgT CgC CCT T. 11. 11. 100.0. OPY16. ggg CCA ATg T. 8. 8. 100.0. OPZ13. gAC TAA gCC C. 11. 10. 90.9. 165. 161. 97.6. Total. 圖 1. 參試之 25 個白及樣品以 (A) OPA08；(B) OPA10；(C) OPA12 引子進行 PCR 反應之 RAPD 電泳分析圖 譜。M：分子量標誌；樣品號碼參照表 1。 Fig. 1. RAPD profile of 25 Bletilla samples. Primers of (A) OPA08, (B) OPA10, and (C) OPA12 were used for PCR reaction. Names of tested samples are listed in Table 1..
(5) 258. 台灣農業研究. 第 58 卷. 第4期. 圖 2. 參試之 25 個白及樣品以 (A) OPB08、(B) OPB13 引子進行 PCR 反應之 RAPD 電泳分析圖譜。M：分子 量標誌；樣品號碼參照表 1。 Fig. 2. RAPD profile of 25 Bletilla samples. Primers of (A) OPB08 and (B) OPB13 were used for PCR reaction. Names of tested samples are listed in Table 1.. 大群，而台灣不同地理位置之白及又可區分成 5. 葉片形態與中國及台灣白及區別外，中國白及. 個小群，相似度為 63.8–88.7% (表 3)，第 1 小群. 與台灣白及難以藉由植株外觀與假球莖形態加. 內相似度為 76.6%，由離島之蘭嶼白及、贈自花. 以區分。蘭嶼白及花朵為純白色，在開花期時. 蓮改良場蘭陽分場搜集地點不詳之白及 (BL). 較易以花器作為辨別依據。而自台灣不同地區. 與花蓮縣蘇花公路白及所組成；第 2 小群內相似. 採集之白及其花朵與唇瓣顏色有差異性存在. 度為 79.4%，主要為台灣北部地區，由台北縣南. (圖 4)，推測花朵形態上的差異容易受外在環境. 港、石碇、平溪、烏來、宜蘭縣福山、桃園縣拉. 因子影響所造成 (Millan et al. 1996; Weising et. 拉山與新竹縣北埔地區所組成，而購自板橋花市. al. 1994)。. 之 BS15 樣品亦被歸在此類群中；第 3 小群內相. 本試驗以 RAPD 作為鑑別白及屬植物分子. 似度為 80.1%，以中央山脈與東北部地區為主，. 標誌的群叢分析結果顯示，可將中國、日本與. 由宜蘭縣南山，宜蘭縣蘇花公路、花蓮縣洛韶、. 台灣白及三地區之白及清楚區隔開來 (圖 3)，. 台中縣梨山、台中縣谷關與南投縣水里地區白及. 顯示參試之中國、日本與台灣白及為不同的白. 所組成；第 4 小群相似度為 71.5%，以單一屏東. 及原生種。在專一性的條帶產生方面，以 OPA12. 縣霧台白及組成；第 5 小群相似度為 64%，以嘉. 引子可產生日本白及之專一性條帶，紫紅色花. 義縣阿里山與南投縣東埔地區白及組成，為台灣. 之日本白及 (BS3) 以 OPA08 引子可產生專一. 白及中差異較大的一群 (圖 3)。. 條帶加以分別。以 OPA10 引子可區別中國. 討. 論. 產區之中國白及與黃花白及，以 OPB13 引子 則可產生中國產區白及共有的專一性條帶，. 由外表形態觀察 25 個參試白及樣品，除了. 中國白及亦可以 OPB08 引子分別於分子量. 日本白及 (BS3) 其植株葉片較為寬大，可藉由. 430 bp 與 300 bp 產生專一性條帶與其他白及區.
(6) 79.3 79.0 81.5 78.1 78.1 78.8 77.6 75.2 79.3 76.7 100.0. 81.2 78.5 81.0 81.3 80.0 79.5 78.3 77.0 72.7 81.3 87.7 100.0. 84.2 81.7 81.7 81.9 83.0 81.4 80.2 74.3 77.2 78.3 85.7 85.4 100.0. 82.4 79.8 83.4 82.4 82.4 84.2 81.9 78.3 81.2 82.5 83.8 82.2 85.2 100.0. 77.6 79.8 82.3 76.3 78.8 80.7 78.3 75.8 76.4 77.4 84.0 81.0 82.9 78.5 100.0. 77.6 78.5 82.3 78.8 82.4 83.1 83.2 78.3 78.8 81.3 79.0 79.8 81.7 83.4 78.5 100.0. 77.6 77.2 83.6 80.0 80.0 79.5 80.8 70.8 80.0 81.3 79.0 79.8 80.5 82.2 81.0 83.6 100.0. 70.8 74.0 72.7 73.1 72.1 74.1 77.7 73.9 70.8 75.5 70.9 68.8 66.3 69.2 74.0 72.7 68.8 100.0. 61.1 64.2 65.7 63.3 62.5 66.2 65.7 57.1 65.3 67.2 56.7 61.3 57.3 62.0 62.8 64.2 62.8 58.7 100.0. 65.3 68.6 67.1 67.6 65.3 68.9 68.5 60.1 69.4 65.7 62.5 64.3 64.4 67.6 62.9 65.7 64.3 61.8 85.7 100.0. 57.6 62.1 63.6 58.2 56.1 62.9 62.2 53.3 64.8 58.9 57.4 56.1 58.0 61.3 59.1 63.6 63.6 57.8 75.7 77.2 100.0. 58.1 57.0 59.4 59.9 62.8 59.0 57.1 57.1 62.8 61.7 59.2 57.0 59.7 58.8 55.8 64.2 64.2 54.7 41.7 39.5 41.7 100.0. BF10. BF13. BF11. BF8. BF12. BFS. BF14. BF19. BF16. BF17. BF18. BS1. Mean = 71.19. 48.6 43.6 49.6 51.9 48.6 49.7 48.5 48.5 47.1 49.2 52.6 48.1 50.4 44.9 48.1 51.1 49.6 43.4 41.1 45.2 39.3 54.3 49.3 78.5 100.0. 84.0 78.7 83.9 84.1 81.5 79.8 81.0 77.2 85.2 100.0. BF9. BS3. 81.4 80.0 80.0 79.0 80.2 79.8 78.6 72.6 100.0. BL. 55.4 51.6 56.6 55.9 59.0 59.9 59.3 53.1 53.0 52.6 55.2 55.4 61.8 56.1 59.1 59.1 56.6 51.6 50.7 46.8 42.1 66.3 100.0. 84.5 78.3 79.5 81.0 78.6 86.4 85.4 100.0. BF1. BS3. 53.2 47.0 54.6 53.7 53.2 52.9 53.3 51.9 48.9 49.6 51.5 51.5 56.5 48.2 53.0 57.6 54.6 43.8 45.1 45.6 45.3 50.4 54.1 100.0. 84.5 84.5 84.5 83.4 83.3 94.7 100.0. BF3. BS2. BS2. 86.7 84.3 85.5 82.1 83.2 100.0. BF2. BO. 259. BO. 87.4 86.3 83.8 100.0. 81.4 83.6 81.2 88.6 100.0. BF9 BF10 BF13 BF11 BF8 BF12 BFS BF14 BF19 BF16 BF17 BF18 BS1. BF7. 86.1 84.8 100.0. BF5. BL. BF6. 86.1 100.0. 100.0. BF15. BF4. BF4 BF15 BF5 BF6 BF7 BF2 BF3 BF1. 表 3. 25 個參試白及之 RAPD 相似度表 Table 3. Similarity coefficients among 25 tested Bletilla samples based on RAPD analysis. 白及之 RAPD 親緣分析. 白及之 RAPD 親緣分析 259.
(7) 260. 台灣農業研究. 第 58 卷. 第4期. 圖 3. 25 個白及參試樣品之 RAPD 條帶結果經 UPGMA 群叢分析之樹狀圖。 Fig. 3. Phylogenetic tree based on RAPD bands among 25 tested Bletilla samples using UPGMA method. Names of tested samples are listed in Table 1.. 圖 4. 中國白及與採自不同地理位置之台灣白及花朵與唇瓣形態。 Fig. 4. Flower and lip morphological traits of Bletilla formosana collected from various areas of Taiwan and B. species from China. Names of tested samples are listed in Table 1..
(8) 白及之 RAPD 親緣分析. 別。綜合而言，以 OPA08、OPA12 引子可作為 鑑別日本白及之分子標誌，而以 OPB13 引子可 作為同時鑑別中國、日本與台灣白及之分子標 誌。台灣目前白及藥材皆仰賴中國進口，中國 白及與台灣白及在外觀上本來就不易區別，在 乾品藥材上就更難有辨別依據，因此本研究初 步篩選出之分子標誌將進一步針對品種專一性 進行重複試驗，或更進一步以 SCAR (sequence characterized amplified region) 標誌，評估這些 分子標誌作為種原與藥材基原鑑定之可行 性。 在台灣白及遺傳歧異度分析結果方面，依 UPGMA 所建構之親緣關係樹狀圖初步可將台 灣白及區分成 5 個小群，其中蘭嶼白及被歸於 台灣白及之內，應為台灣白及之一型，符合 Lin (1977) 與 Yang et al. (2001) 的分類結果。各地 採集之台灣白及樣品間的遺傳歧異度頗大 (相 似度在 52.1–87.3%之間) (表 3)。在第 1 小群部 分，由於在台灣本島過去亦曾有過蘭嶼白及之 採集紀錄 (Lin 1977; Na et al. 1978)，因此推測 可能因鳥類、昆蟲、風力或人類旅行交流而使 得蘭嶼白及種子傳播至台灣本島，花蓮改良場 蘭陽分場所提供之採集地不詳之台灣白及，宜 蘭縣蘇花公路旁小路 (海岸邊) 與蘭嶼白及均 屬在東部沿海同一小群有其可能性；第 2 小群 以雪山山脈為分群，主要為台灣北部地區，由 台北縣南港、石碇、平溪、烏來、宜蘭縣福山、 桃園縣拉拉山與新竹縣北埔地區之白及所組 成，而購自業者謂採自南投的白及樣品亦歸為 在此類群中，有可能是業者混淆所致；第 3 小 群為中央山脈與中橫公路為分群，以宜蘭縣南 山，宜蘭縣蘇花公路、花蓮縣洛韶、台中縣梨 山、台中縣谷關與南投縣水里地區白及所組 成；第 4 小群以大武山為分群，以屏東縣霧台 白及自成一群；第 5 小群以阿里山山脈為分 群，以嘉義縣阿里山與南投縣東埔地區白及組 成。對照台灣白及採集之地理位置 (圖 5) 與親. 261. 緣分析樹狀圖的分群結果，推論山脈的阻隔、 生長環境與其繁殖方式有可能是造成不同地理 位置之台灣白及遺傳歧異度與親緣關係差異的 原因，依據台灣白及採集地之生態觀察與 Na et al. (1978) 的研究顯示，台灣白及主要生長在中 海拔之濕潤向陽岩石或泥壁上以及平野濕潤之 草叢中，有其特殊之生長環境條件，在繁殖方 式方面，觀察顯示台灣白及極易自花授粉且單 花壽命短 (2–3 天)，再加上山脈及河流阻隔之 地理因素，使花藥不易流佈及擴散至其他地 區，造成不同地理位置之台灣白及族群於在演 化及親緣關係上有其獨特性。目前收集之種原 在相同條件及環境種植下記錄其形態特徵，將 進一步利用此資料與分子標誌之親緣分析樹狀 圖比較其異同，交互驗證其正確性。 分子標誌必需要產生一定數量以上之標誌 數目作為分析才能有其正確性 (Pejic et al. 1998)，越多的標誌數目能讓相似係數與分群歸 類趨於穩定，文獻中顯示標誌數目達到 150 個 以上是較為具有可信度之數目 (Weising et al. 1994)，本實驗中 RAPD 分析之標誌數目 165 個已達到標準之上，且以 OPB13 引子可作為同 時鑑別中國、日本與台灣白及之分子標誌。此 外，若能配合 ISSR (inter simple sequence repeat) 分子標誌，增幅生物體基因組中的重複序列間 之產物進行比較，利用物種基因的序列組合有 一定的規則，而在同物種中重複基因出現之模 式有所差異，而顯現出相近物種的差異來，對 於整個台灣白及的演化與遺傳變異將能得到更 多的了解，本研究目前正以 ISSR 分子標誌以 及增加採集地點及改善樣品的採樣方法，輔以 形態之資料更進一步研究台灣白及族群演化關 係的發展。 在蘭科植物之白及蘭屬目前尚未見有以分 子標誌進行相關鑑定與親緣分析之研究，對於 台灣區所產之台灣白及間演化的親緣關係資料 更付之如闕，本試驗以 RAPD 分子標誌所建立.
(9) 262. 台灣農業研究. 第 58 卷. 第4期. 圖 5. 台灣與蘭嶼白及樣品採集地點分佈之情形。 Fig. 5. Samples collection sites of Bletilla formosana populations in Taiwan and Orchid Island. samples are listed in Table 1.. 之初步資料，將朝品種專一性引子發展，希望 未來可供鑑別藥材用途之白及屬植物，更可將 台灣白及與中國、日本白及加以區分，作為種 間基原鑑定與親緣分析輔助工具，對於台灣特 有之台灣白及親緣演化間的關係提供參考。. 誌. Name of tested. 謝. 本研究承行政院農委會經費補助 [96-98 農科-8.1.1-農 C1 (Z)]，謹此致謝。本試驗部分 研究材料承農試所種原組黃勝忠組長、應動組 翁振宇先生、古坑花卉研究中心吳容儀助理研.
(10) 白及之 RAPD 親緣分析. 究員、花蓮區農業改良場蘭陽分場陳季呈助理 研究員、屏科大農園系賴宏亮教授協助種原收 集與提供，謹此致謝。. 引用文獻 (Literature cited) Arditti, J. 1992. Fundamentals of Orchid Biology. John Wiley & Sons. U.S.A. 668 pp. Bornet, B. and M. Branchard. 2001. Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Mol. Biol. Rep. 19:209–215. Fu, Y. M., W. H. Chen, W. T. Tsai, Y. S. Lin, M. S. Chyou, and Y. H. Chen. 1997. Phylogenetic studies of taxonomy and evolution among wild species of Phalaenopsis by random amplified polymorphic DNA markers. Rep. Taiwan Sugar Res. Inst. 157: 27–42. ( in Chinese with English abstract) Lin, T. P. 1977. Bletilla Rchb. f. p.62–66. in: Native Orchids of Taiwan. Vol. 2. SMC Publishing, Inc. Taipei, Taiwan. (in Chinese) Millan, T., F. Osuna, S. Cobos, A. M. Torres, and J. I. Cubero. 1996. Using RAPDs to study phylogenetic relationships in Rosa. Theor. Appl. Genet. 92:273–277. Na, G., W. S. Kan, N. Y. Chiu, and R. J. Yang. 1978. Pharmacognostical researches on Bletillae tuber. China Med. Coll. Annu. Bull. 10:451–467. (in Chinese with English abstract) Nei, M. and W. H. Li. 1979. Mathematical modes for studying genetic variation in terms of restriction. 263. endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76: 5269–5273. Pejic, I., P. A. Marsan, M. Morgante, V. Kozumplick, P. Castiglioni, G. Taramino, and M. Motto. 1998. Comparative analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs, and AFLPs. Theor. Appl. Genet. 97:1248– 1255. Sneath, P. H. A. and R. R. Sokal. 1973. Numerical Taxonomy. Freeman Pub. San Francisco, USA. 573 pp. Weising, K., H. Nybom, K. Wolff, and W. Meyer. 1994. DNA fingerprinting in plant and fungi. p.24–35. in: Detection of DNA Polymorphism by PCR-Based Fingerprinting. (Weising, K., ed.) CRC Press. Florida. Williams, J. G. K., A. R. Kubelik, K. J. Livak, J. A. Rafalski, and S. V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18:6531–6535. Wu, Z. Y. and P. H. Raven. 1990. Bletilla Rchb. f.. p.50. in: Flora of China. Vol. 18. (Wu, Z. Y. and P. H. Raven, eds.) Science Press. Beijing, China. (in Chinese with English abstract) Yang, Y. P., H. Y. Liu, and T. P. Lin. 2001. Orchidaceae Bletilla. p.222–223. in: Manual of Taiwan Vascular Plants. Vol. 5. (Yang, Y. P., H. Y. Liu, and T. P. Lin, eds.) Council of Agriculture. Taipei. (in Chinese with English abstract).
(11) 264. 台灣農業研究. 第 58 卷. 第4期. Genetic Diversity Analysis of Bletilla Species Using RAPD Technique 1 Chin-Yi Tsao2, Cheng-Zhi Xu3, Fu-Shin Chueh3, Uei-Chern Chen2, and Chi-Ni Hsia2,4 Abstract Tsao, C. Y., C. Z. Xu, F. S. Chueh, U. C. Chen, and C. N. Hsia. 2009. Genetic diversity analysis of Bletilla species using RAPD technique. J. Taiwan Agric. Res. 58:254–264.. Genetic makers of random amplified polymorphic DNA (RAPD) were used to analyze 25 samples containing different species in Bletilla genus and B. formosana collected from different regions of Taiwan. A total 12 primers with high reproduction was screened from 80 RAPD primers for consecutive experiments. A total of 165 DNA fragments was detected, among them, 161 markers (97.6%) were polymorphic. Three major groups of Bletilla genus from China, Japan, and Taiwan were separated according to unwighted pair-group mean arithmetical (UPGMA) analysis in this study. Five sub-groups of B. fomosana were classified and Bletilla species collected from Lanyu Island was found in the same group of Taiwan. It assumed that Bletilla formosana (Hayata) Schltr. f. kotoensis (Hayata) T. P. Lin is the same species with B. fomosana. The geographical barrier of mountains was presumed for constituting the genetic differentiation among ethnic groups of B. formosans in Taiwan. Key words: RAPD, Bletilla, Genetic diversity, Molecular marker.. 1. Contribution No.2374 from Taiwan Agricultural Research Institute (TARI), Council of Agriculture. Accepted: October 15, 2009. 2. Respectively, Assistant Researcher, Assistant Researcher, and Associate Researcher, Biotechnology Division, TARI, Wufeng, Taichung, Taiwan, ROC. 3. Master and Assistant Professor, Graduate Department of Health and Nutrition Biotechnology, Asia University, Wufeng, Taichung, Taiwan, ROC. 4. Corresponding author, e-mail: hsia@tari.gov.tw; Fax: (04)23302806..
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