金銀花有效成分綠原酸(Chlorogenic
Acid)在家兔之藥物動力學及生體可用率 研究
中國醫藥學院 中國藥學研究所 藥局學組∗
趙彥鈞∗∗
第一章 緒 言
藥物動力學，主要在探討藥物的吸收、分佈、代謝與排泄。對中藥成 分進行藥物動力學研究，不但可提供將來在製劑上的有用資訊，更讓我們 可以客觀的了解藥物在生體的經時變化過程，為臨床及研究工作者提供參 考。
中藥金銀花為忍冬科(Caprifoliaceae)植物忍冬及同屬近緣植物之乾燥 花蕾。正統本草中，以忍冬之花為獨立藥材(即金銀花)而記其藥性者始推《本
草備要》(1~4)，記載其「性味甘寒，入肺經，主治癰疽疥癬，楊梅惡瘡，腸
啡酸(caffeic acid)等(10)。
對傳統中藥的成分進行藥物動力學研究，是實現中藥現代化的重要環 節。由於微量化學分析方法的進步，更加速這一方面研究之進展。本研究 透過藥物動力學觀點，對常用中藥金銀花(Lonicerae Flos )中有效成分綠原 酸(Chlorogenic acid)進行在家兔之藥物動力學及生體可用率研究。
本實驗將首先對綠原酸的血中濃度分析方法進行研究，希望尋找出精 確性、專一性及靈敏度高的分析方法，供血漿檢品中綠原酸之定量。其次 將探討綠原酸在家兔中之藥物動力學及生體可用率。所得結果希望能提供 臨床及研究工作之參考。
第二章 總 論
第一節 綠原酸的來源
綠原酸的主要來源為忍冬科忍冬屬植物的乾燥花蕾或初開的花，基緣 植物如忍冬(Lonicera japonica THUNB.)含量 1.94~5.02% 、山銀花(Lonicera confusa Dc.)含量 0.20~6.49%、線葉忍冬(Lonicera hypoglauca MIQ.)含量 1.89~2.40%、毛花柱忍冬(Lonicera dasystla REHD.)含量 4.9~5.9%、細苞忍冬 (Lonicera similis HEMSL.)含量 6.1~8.9%、茵陳蒿(Artemisia Capillaris THUNB.) 全草綠原酸含量 0.23~1.6%(10,11)。
第二節 綠原酸的藥理作用
有關綠原酸之藥理研究報告甚多，摘錄綜述如下:
1.抗氧化作用
據 João 等人於 1992 年的報導(12~14)，以人體的低密度脂蛋白做 體外試驗，結果顯示綠原酸能補捉自由基，抑制金屬離子誘導的脂質 過氧化(Lipid peroxidation)。又據 Kono 等人的報告(15~16),綠原酸在老鼠 體內能捕捉氧基(O2
-)，減少氫氧自由基(OH)的形成及減緩脂質過氧 化。
又 據 Masahito 等 人 實 驗 (18) ， 證 實 綠 原 酸 能 抑 制 n-methyl-n-nitrosourea 對老鼠胃腺的致癌作用。
3. 抗潰瘍作用
據 Takahiko 等人報導(19)，在大白鼠飲水中加入綠原酸，能有 效防止以束縛水浸應激法(Restrained cold water stress)(20)誘導的 胃潰瘍。
4. 抗過敏作用
據 Hisdtomi 等 人 指 出(21~23)，以大白鼠嗜鹼性白血病細胞 (basophilic leukemia cell)做體外試驗，綠原酸能降低血管通透性及調 節 mast cell 的作用，能抑制過敏反應中相關酵素 hyaluronidase 及β -hexosaminidase 由 mast cell 中釋放，進而抑制組織胺的釋放。
5.保肝作用
據胡潤生的報導(24~26)， 以大白鼠作實驗綠原酸對過氧化玉 米油、CCl4及鈷 60 引起的肝損害,綠原酸能抑制 GOT 及 GTP 上升，
減少血清及肝中脂質過氧化物的產生。
6.毒性(27)
口服 LD50 為 1 g/kg；腹腔注射 LD50 為 0.25 g/kg。
第三節綠原酸的理化特性
1.化學名
3-[[3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-1-oxo-2-propenyl]oxy]-1,4,5-trihydroxycy clohexanecarboxylic acid；3-caffeoylquinic acid
2.結構式(27)
3.分子式及分子量
C16H18O9：mol. wt.=354.30 4.物理、化學性質(27)
UV max (ethanol):325 nm；pKa=2.6，熔點 208℃。25℃溶解度為 4%。
易溶於乙醇及丙醇。
據張文政報導(28), 金銀花以酸性乙醇(pH 2~3)添加異戊醇提取綠原酸，
經過純化後可得到純度 90%以上的綠原酸。
OOCCH=CH
OH
OH OH
HO
HO
COOH
第四節 綠原酸的定量法
綠原酸的定量方法，有以紫外分光光度法(UV Detector)(11)，和近年 用 的 高 效 液 相 層 析 法 (High Performance Liquid Chromatography,HPLC)
(30~39)，其中高效液相層析法，因所需檢品少，準確性高，是目前測定藥品
含量常用的方法。
目前文獻報告中，曾有用 HPLC 來定量大白鼠中綠原酸之含量(39)，及 以紫外分光光度法測定人及兔體內綠原酸含量(40,41)，但尚無綠原酸在兔體內 之 HPLC 定量方法。
因此，為了進行綠原酸在家兔體內藥物動力學以及生體可用率研究，
本研究將探討一種靈敏度高且具專一性及可行性，適合綠原酸在血漿檢品 中濃度之 HPLC 定量方法。前人使用過的方法，列舉如下表：
Table 1 Chlorogenic acid 之 HPLC 定量法文獻整理
作者 層析管柱 分析條件 檢品處理備註
Siranoush Shahrzad et.
al.(31)
MERCK LiChrospher®
100 RP-18 120x4 mm
Water:ethylacetate:ace tic acid=95.6:4.1:3 320 nm,0.5 ml/min
1. 乙酸乙酯抽提 2. 以 移 動 相 溶 解
後分析 呂阮珊、華傳
義(34)
Sperisosb 200 mmx4.6
mm
12.5%ACN+2%冰醋酸
330 nm,1 ml/min 以乙醇溶解後分析 沙明、曹愛民
(35)
Shim-pack CLC ODS 6 mmx150 mm
MeOH:0.025 M 磷 酸
=3:7, 325 nm,1 ml/min
以 50%甲醇溶解後 分析
鞠建明、任愛 農、袁紅宇(36)
Waters uBondpak C18
MeOH:THF:1%phosph oric acid=25:15:70 328 nm,0.5 ml/min
以甲醇溶解後分析
張 丹 、 李 章 萬、姜焱（38）
Shimpack ODS C18
0.2mol/L 磷酸二氫鉀：
甲醇=75：25 327 nm,1.0 ml/min
1 移動相 pH3.2 2 以甲醇溶解後分 析
何 心 、 越 鐵 敏、郡修德等
（39）
ERC-ODS-116 1
(6x100 mm)
磷 酸 緩 衝 液 ： 甲 醇 ﹦ 90：10
274 nm,1.0 ml/min
1 血漿檢品以氰甲 烷沉澱蛋白
2 移動相(pH2.7)溶 解
第五節 金銀花的藥物動力學相關研究
金銀花中成分之藥物動力學研究，一般是以綠原酸為指標成分(40)。Tsai
(42)等人於大白鼠靜脈注射 20、40、60 及 80 mg/kg 後其測血中綠原酸濃度，
t1/2β隨之增高，依序為 21.16、23.22、88.05 及 172.37 分鐘。又據何心等(39) 的報告，以綠原酸靜脈注射 1.2 mg/kg 於大白鼠後，發現綠原酸在大白鼠體 內為二室開放模式，在體內代謝極快，半衰期約 12 min。
迄今尚未見到針對綠原酸設計較週全的藥物動力學及生體可用率研 究。因此本研究便以家兔進行這方面的探討。
第六節 研究動機
1. 探討綠原酸在血漿檢品中之高效液相層析定量方法
探討一種簡單、快速、靈敏度高且具專一性的 HPLC 定量分析方法，
測定綠原酸之含量。對於分析方法的確效性(Validation)也進行評估，以尋找 適合進行藥物動力學及生體可用率研究之 HPLC 定量方法。
2. 綠原酸之藥物動力學研究
探討綠原酸在家兔經由四種劑量靜脈注射後，分析綠原酸在家兔體內 的藥物動力學特性，經定量而得之血中濃度經時變化數據，進行藥物動力 學相關模式之評估，以求得有關藥物動力學參數，並探討綠原酸在家兔體 內之過程。
3. 綠原酸之生體可用率研究
為瞭解綠原酸在家兔生體可用率相關資訊，以靜脈注射(I.V.)、肌肉注 射(I.M.)及口服(P.O.)三種不同投藥方式，分析相關藥物動力學參數，期可作 為製劑品管及臨床評估之應用參考。
第三章 實驗材料及方法
第一節 實驗材料
1.藥品及試劑
綠原酸(Chlorogenic Acid) 美國 SIGMA(St. Louis. USA.), 間羥基苯甲酸(m-hydroxybenzoic acid) Wako Chemical Industries,
LTD(Osaka, Japan) 肝素鈉(Heparin Sodium) Novo Industrial Co.5000 I.U./ml 磷酸(Phosphoric Acid) E. Merck Co.
甲醇(Methanol) 美國 Mallinckrodt Co.
氰甲烷(Acetonitrile) 美國 Mallinckrodt Co.
氫氧化鈉(Sodium Hydroxide) 德國 R.D.H. Co.
藥用酒精(Ethanol) 臺灣煙酒公賣局
生理食鹽水 信東化學工業公司
氮氣 源吉行
² 使用於高效液相層析儀之試劑均為 HPLC 級。
2.儀器及材料
高效液相層析儀之裝備
幫浦(Pump): Jasco Model PU-980 Intelligent HPLC Pump 偵測器(Detector): Jasco Model UV-975 Intelligent UV/VIS 積分儀(Integrator): Scientific Information Service
Coroporation Integrator
自動取樣機(Auto Sampler) Jasco Model 851-AS Intelligent sampler 印表機(Printer): HEWLETT PACKARD Deskjet
層析管(Column): MERCK LiChrospher® 100 RP-18e (250x4mm , endcapped 5 µm)
保護管柱(Pre-column): Merck 50962 Lichrospher 100 RP-18e ( endcapped 5µm )
實驗室裝備
直示電子天平: Sartorius Type 1801
水壓抽氣機： Eyela,Aspirator A-2S,Tokyo,Rikak Co.
微量移液管(Micropipette) Socorex Transferpette ： l - 10 µl
20 - 200 µl 100 - 1000 µl
試管振盪器: Maxi Mix ll Thermolyne Type 37600 Mixer 高速離心機: Hettich Zentrifugen D-7200 Tuttlingen,
Germany ( 5000 rpm )
酸鹼測定儀(pH meter): Model 2002 , Good Digital Co.
純水製造裝置: Operting and Maintenance manual For RiOsTM and ElixTM Water purification system,Millipore Co.Operting and Maintenance manual Milli-Q,Millipore Co.
超音波振盪器: BRANSON 5510,HONG Yu INSTRUMENTS Co.,LTD
吹氣濃縮裝置: Organomation Associates Inc. Model No.112
過濾膜： Millipore Type HV ,0.45 and 0.22 µm ,Millipore Co.
動物實驗所用器材
胃管(內徑 1.5 mm):季勗儀器公司 針筒過濾器 0.22 µm:PRO-XTM (Lida)
注射針及針筒：Terumo Co.Tokyo , Japan
1 ml Syringe 25G× 5/8 ” (0.5 × 16 mm) 2.5 ml Syringe 24G× 1 ” (0.55× 25 mm) 10 ml Syringe 22G×1 1/2 ” (0.70 × 38 mm) 靜脈置留針及針塞：Terumo Co.Tokyo , Japan
×
3.溶液製備
(1)綠原酸標準溶液 (Chlorogenic acid stock standard solution)
精稱綠原酸標準品 10 mg 置於 10 ml 的定量瓶中，加甲醇至刻度，
即得濃度為 1 mg/ml 的綠原酸標準溶液。使用時再以移動相稀釋成所需 濃度之標準溶液。
(2). 間 烴 基 苯 甲 酸 內 標 準 溶 液 ( m-hydroxybenzoic Acid internal standard solution )
精稱 m-hydroxybenzoic Acid 4 mg 置於 100 ml 容量瓶中，加甲醇至 刻度，即得濃度為 40 µg/ml 的內標準溶液。
(3).肝素鈉溶液 ( Heparin sodium solution )
精取肝素鈉注射液(5,000 IU/ml) 2.5 ml 加於 500 ml 生理食鹽水中，
即得 25 I.U./ml 抗凝血肝素鈉溶液。
(4). 綠原酸靜脈注射液 (Chlorogenic Acid solution for intravenaous injection )
精稱所須的綠原酸滴加乙醇 5.4 µl/mg 溶液使之溶解，以純水稀釋至 定容，再經 0.22 µm 過濾薄膜過濾除菌即得。
(5). 綠原酸肌肉注射液 ( Chlorogenic Acid solution for intramuscular injection )
製備方法同(4)靜脈注射液。
(6). 綠原酸口服液 ( Chlorogenic Acid oral solution )
製備方法同(4)靜脈注射液，但未經過濾除菌。
(7).磷酸緩衝溶液
精取 85% 磷酸 0.32 ml，置入 1000 ml 定量瓶中，以水定量至刻度 即得 pH=2.44~2.46 的磷酸緩衝溶液。
第二節 實驗方法
1.綠原酸血漿檢品之 HPLC 定量分析方法
A. HPLC 分析條件
層析管(Column) Merck LiChrospher 100 RP-18e column (250x4 mm, endcapped 5 µm)
保護管柱(Pre-column) Merck Lichrospher 100 RP-18e (endcapped 5µm)
檢測波長 UV 330 nm 流速 1.0 ml/min
移動相 Acetonitrile：Water =1：9 (pH2.45 ) 注入量 110 µl
B.血漿檢品之前處理
精確量取血漿檢品 200 µl 置入試管中，加入 20 µl m-hydroxybenzoic acid 內標準品及氰甲烷 600 µl，以振盪器振盪 10 秒，使蛋白沉澱。再以 3000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液置於另一試管中以氮氣噴吹至乾，以 200 µl 移動相溶解，接著以 HPLC 分析。
C.檢量線之製作
精確量取家兔空白血漿 180 µl 加入 20 µl 含不同濃度之綠原酸標準溶 液，分別加入 20 µl m-hydroxybenzoic acid 內標準品及氰甲烷溶液 600 µl，
以振盪器振盪 10 秒，使蛋白沉澱。再以 3000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上 清液置於另一試管中以氮氣噴吹至乾，以 200 µl 之移動相溶解，可得到理 論濃度為 0.05 至 100 µg/ml 之標準血漿檢品液（Table 2）。接著以 HPLC 分析。由所得之綠原酸與內標準品之面積比(Peak Area Ratio)與校正液濃 度作線性迴歸以製作檢量線。
Table 2 Chlorogenic Acid 標準濃度血漿檢品溶液之製備
標準溶液濃度
(取 20 µl) 空白血漿體積 (µl) 濃 度
(µg/ml)
1000 180 100.00
500 180 50.00
300 180 30.00
100 180 10.00
50 180 5.00
30 180 3.00
10 180 1.00
5 180 0.50
1 180 0.10
0.5 180 0.05
D.回收率實驗
目的在比較綠原酸在添加空白血漿和空白溶液( Methanol )中，經血漿 檢品之前處理步驟處理後檢出量之差異。實驗步驟如同 C.檢量線製作中對 檢品之處理過程。計算方式如下式:
Standard Peak Area Ratio in Plasma Recovery %=
Standard Peak Area Ratio in Methanol ×100％
E.精確性試驗
為了確認綠原酸定量分析方法之精確性，因此做同日內( Intraday )及間 日內( Interday )的精確性比較。同日內試驗是以不同濃度綠原酸標準濃度血 漿檢品，於同一日建立六次檢量線，計算各個濃度之平均值( Mean )、標準 偏差( S.D.)及變異係數( C.V.)。若於連續六天以同法操作則可得到間日內的 精確性比較。
F.靈敏度試驗
分析過程中，欲找出能和背景濃度相區分的分析物最低濃度，將依標 準濃度血漿檢品製備方法，令其濃度重複稀釋，至 HPLC 無法偵測為止，
取 HPLC 圖譜之 signal 與 noise 之比為 2~4 之間時之理論濃度為偵測極限 ( Limit of Detection , LOD )，取大或等於 10 以上之濃度為偵測極量( Limit of Quantitation , LOQ ），依前述「檢量線之製作」，採標準濃度血漿檢品製備
G.安定性試驗
(1) 綠原酸在家兔血漿中於-30℃冷凍櫃下之安定性試驗
取濃度為 1 , 10, 100 µg /ml 之綠原酸標準溶液 0.5 ml，加入 4.5 ml 之空白血漿中，振盪一分鐘以混合均勻，即得濃度為 0.1 , 1 , 10 µl/ml 之血漿檢品，將之分裝後置於 -30℃的冷凍櫃中，於第 0 , 1 , 3 , 6 , 10 , 15 及 30 天分別取出一組檢品(n =3)。解凍後，依血漿檢品之前處理方 法處理後，以 HPLC 分析，觀察綠原酸之濃度變化情形。
(2 ) 綠原酸在家兔血漿中於室溫下之安定性試驗
取濃度為 1 , 10 , 100 µl/ml 之含綠原酸標準溶液 0.5 ml，加入 4.5 ml 之空白血漿中，振盪一分鐘以混合均勻，即得濃度為 0.1、1、10 µl/ml 之血漿檢品，依血漿檢品之前處理方法處理後將之分裝後置於自動取樣 機中，於第 0、1、3、6、12 及 24 小時，分別取出一組檢品(n=3)，以 HPLC 分析，觀察綠原酸之濃度變化情形。
2. 綠原酸在家兔體內之藥物動力學
A. 實驗設計
實驗一
取雄性家兔六隻，體重介於 2 至 3 公斤之間(Table 3 )，每隻家兔以四 種劑量進行靜脈注射(I.V.)投藥，給藥順序及劑量示於 Table 4，同一隻兔子 進行實驗須相隔一週以上。
Table. 3 Chlorogenic Acid 在靜脈注射實驗中家兔之體重
Rabbit No. 1 2 3 4 5 6
2.3 2.8 2.8 2.4 2.5 2.2
2.4 2.7 2.6 2.9 2.6 2.8
2.6 2.4 2.5 2.5 2.7 2.4
Weight (Kg)
2.6 2.2 2.5 2.1 2.1 2.2
Table. 4 Chlorogenic Acid 在靜脈注射實驗中家兔投藥順序及劑量
Rabbit No. 1 2 3 4 5 6
A B C A B C
B A D B A D
C D A C D A
Order
D C B D C B
Dose
A： 2 mg/kg B： 10 mg/kg C： 20mg/kg D： 50 mg/kg
實驗二
取雄性家兔六隻，體重介於 2 至 3 公斤之間(Table 5 )，分別進行靜脈注 射(I.V.)、肌肉注射(I.M.)、口服(P.O.)投藥，給藥順序及劑量示於 Table 6，
同一隻兔子進行實驗須相隔一週以上。
Table. 5 Chlorogenic Acid 在生體可用率實驗中家兔之體重
Rabbit No. 1 2 3 4 5 6
2.2 2.3 2.4 2.3 2.6 2.7
2.7 2.1 2.5 2.1 2.2 2.4
Weight (Kg)
2.5 2.1 2.4 2.3 2.4 2.6
Table. 6 Chlorogenic Acid 在生體可用率實驗中家兔投藥順序及劑量
Rabbit No. 1 2 3 4 5 6
IV IM PO IV IM PO
IM PO IV IM PO IV
Order
PO IV IM PO IV IM
Dose
IV： 50 mg/kg 打入家兔耳靜脈內 IM： 50 mg/kg 打入家兔大腿肌肉 PO： 250 mg/kg 由胃管餵入
B.給藥法及檢品處理
(1).靜脈注射給藥及血漿檢品之處理：
實驗的家兔須先禁食 24 小時，經稱重後記錄實際體重以便配製注射 溶液。實驗時將家兔關入限制籠內剃除兩耳之毛，接著以燈泡照射兔耳 使其血管擴張，再以酒精棉消毒並助血管擴張，隨即插入靜脈留置針，
將針塞(Injection plug)注滿肝素納溶液後，固定於靜脈留置針上。每次採 血後均由針塞注入 25 I.U./ml 之肝素鈉溶液約 0.2 ml，以防靜脈留置針管 內之血液凝固。
投藥前先抽取 l.5 ml 之空白血液，由另一耳靜脈投藥後，分別於投 藥後 2.5、 5、10、l5、20、30、45、60、75、90、l05、120、l50、l80、
210 及 240 分鐘由靜脈留置針之針塞抽取 l.5 ml 血液，置於試管中，以
3000 rpm 轉速離心 5 分鐘後，取出上層血漿，若不馬上分析則保存於 -30℃之冷凍櫃中。
血漿檢品之前處理，檢量線及分析條件均依前述方法操作，綠原酸 之濃度則由標準曲線經內插法推算而得。
(2).肌肉注射給藥及血漿檢品處理：
如同上述靜脈注射給藥，唯肌肉注射投藥則是注射於家兔的大腿肌 肉內。而採血點為投藥後之 10、20、30、45、60、90、120、150、180、
210、240、270、300 及 360 分鐘由耳靜脈抽取。
(3).口服給藥及血漿檢品處理：
如同上述靜脈注射給藥方式，唯口服給藥法是將家兔之口張開後以 張口器固定，再以胃管插入給藥。而其採血點為給藥後之 10、20、30、
45、60、90、120、150、l80、210、240、270、300、360 及 420 分 鐘。
B. 數據處理及統計方法
(1).一室體模式 ( One Compartment Model )
分析而得之血中濃度數據，經 Jana program(43)作 weighting、one exponential curve stripping 處理，取其 Volume/F、K01及 K10的數值。再用 WinNonlin Program (44)作曲線配適( Curve Fitting )取最適合的室體模式，
求其相關藥動學參數。
(2).二室體模式 ( Two Compartment Model )
分析而得之各個指標成分血中濃度數據，經 Jana program 作 weighting 、two exponential curve stripping 處理，取其 A 、 B 、 α 及 β 的數值。再用 WinNonlin Program 作曲線配適( curve fitting ) 取最適 合的室體模式，求其相關藥動學參數。
(3).非分室理論
以靜脈注射及口服給予家兔所得血漿檢品，由分析而得之各個指標 成分血中濃度數據，經 Lagran-P program 處理，可由非分室理論計算相關 藥動學參數。
第四章 結果與討論
1. 綠原酸在血漿檢品中之 HPLC 定量方法
本研究的定量分析法，是將血漿檢品經添加內標準品 m-hydroxybenzoic acid 及以氰甲烷去蛋白並離心後，取上清液以氮氣噴吹使氰甲烷逸離後，
以移動相溶解，再注入 HPLC 分析。經過多次試驗與修正後，找出最適當 定量分析條件。Figure 1 顯示空白血漿、標準濃度血漿及家兔靜脈注射後血 漿檢品之 HPLC 層析圖。
層析圖中綠原酸波峰與內標準品 m-hydroxybenzoic acid 波峰獨立清晰 並無干擾，可見本法分離效果良好，具專一性。利用本法所製備標準液之 檢量線，其決定係數(R2)分別為 0.9991 及 0.9996，顯示在此範圍之內有良 好的線性關係(Figure 2~3)。
本法之偵測極限( Limit of Detection )，經逐步稀釋綠原酸標準溶液後分 析之，測得偵測極限為 12.5 ng/ml。回收率(Recovery)試驗結果平均可達 86.2
﹪(Table 7)。以製備血漿檢品檢量線之標準液，取六次標準液獨立檢品測得 之偵測極量( Limit of Quantitation )，其最低濃度的變異係數( C.V.)皆均低於 10 % (Table 10 )。顯示分析準確度良好。於同日內(Intraday)及間日內(Interday) 的精確度評估，其變異係數( C.V.%)均低於 10﹪(Table 8~9)。
綠原酸標準血漿檢品，以三種濃度( 1 , 10 , 100 µg/ml )於室溫及-30℃冷
綜合前述幾項分析確效試驗可知，本研究對於綠原酸高效液相層析 法，為一靈敏、簡便、再現性良好及精確之定量分析法，可以供綠原酸藥 物動力學相關研究及臨床藥物監測之分析應用。
2. 綠原酸在家兔體內之藥物動力學
為探討家兔體內綠原酸之動力學及體內過程，首先以四種不同劑量(2、
10、20 及 50 mg/kg)在家兔進行靜脈給藥研究。經由耳靜脈注射綠原酸注射 液後，經分析所得血漿中綠原酸濃度經時變化數據，如 Table 13~16 與 Figure 6 所示。而六隻家兔之平均血漿中綠原酸濃度變化，分別示於 Table 17 及 Figure 7 中。當家兔給予較低劑量(2 mg/kg)，在 2 小時(120 min)後偵測不到 血中藥物濃度，在 10 mg/kg 劑量時，在 3 小時後偵測不到血中藥物濃度。
由 Figure 7 中曲線的斜率可以發現， 綠原酸在家兔靜脈注射後血中濃度之 消逝極為迅速。
將分析所得之血漿中綠原酸濃度經時變化之數據，以 WinNonlin Program 進行曲線配適，發現二室體模式下，可以得到良好配適。在配適二 室模式(附錄二)後，所得之藥物動力學數據列於 Table 22 至 25。
綠原酸的四種劑量 2、10、20 及 50 mg/kg 於靜脈注射給予六隻家兔後，
其血中濃度之變化可以用下列四個方程式表示：
2 mg/kg：Cp = 8.753e-0.162t +0.673e-0.024t 10 mg/kg：Cp = 30.478e-0.092t +1.339e-0.069t 20 mg/kg：Cp = 63.628e-0.091t +2.839e-0.022t 50 mg/kg：Cp = 116.306e-0.074t +6.252e-0.019t
當家兔經靜脈注射 2 、10、 20 及 50 mg/kg 四種劑量綠原酸後，平均 排除半衰期(t1/2β)依次為 29±3.2、31±4.4、30±2.8 及 37±1.4 min。平均穩定 狀態分佈體積 (VdSS ) 分別為 1.096±0.035， 1.048±0.147， 1.000±0.08 及 1.349±0.079 L 。 平 均 曲 線 下 面 積 (AUC0-∞ ) 分 別 為 82.386±6.071 、 390.512±60.377、832.643±85.573 及 1907.49±118.694 µg min/ml。
據何心等人實驗(39)，老鼠靜脈注射 1.2 mg/kg 綠原酸後，半衰期約為 12 min, 分佈體積為 0.08 L，平均曲線下面積(AUC0-∞)為 2.32 µg.hr/ml，與本 實驗結果有差異，應與給藥劑量及實驗動物不同有關。
將檢品濃度數據以 Lagran-P 程式以非室體模式分析，所得相關藥物動 力學參數，分別列於 Table 18~21 中。綠原酸四種劑量之平均半衰期(T1/2) 為 32.623±1.038、33.275±1.762、34.962±0.955 及 41.985±0.862 min.。平均 穩定狀態分佈體積(VDSS )為 0.794±0.107、0.611±0.107，0.54±0.056 及 0.697±0.037 L。平均曲線下面積(AUCp)為 60.318±5.74、312.061±48.96、
691.557±77.928 及 1610.9±110.9 µg.min/ml。
據 Yow-Shieng Uang 等人於 1997 年的實驗(46)，家兔靜脈注射 Caffeic acid 10 mg/kg 後，半衰期約為 14min, 分佈體積為 0.15 l/kg，平均曲線下面 積(AUC0-∞ )為 531 mg.min /ml 與綠原酸比較，半衰期與分佈體積較小、
血中濃度較高
家兔經靜脈注射 2 、10、 20 及 50 mg/kg 四種劑量綠原酸後血中濃度 值，經 Lagran-P 程式處理後之藥物動力學參數，以平均曲線下面積(AUCp) 與給藥劑量(Dose)做線性迴歸，結果如 Figure 10 所示，決定係數(R2)為 0.9813，顯示綠原酸在家兔經靜脈注射劑量 2~50 mg/kg 之間其平均曲線下
了清除率(Cl) 無明顯差異之外，其餘的藥物動力學參數均在統計學上有明 顯差異。
3. 綠原酸在家兔體內的生體可用率(F)
六隻家兔分別以靜脈注射(I.V.) 50 mg/kg、肌肉注射(I.M.) 50 mg/kg 及 口服投與(P.O.)250 mg/kg 之綠原酸後，經分析而得之個別血中濃度值及曲 線，分別示於 Table 26~28 及 Figure 8 中。六隻家兔之血漿中綠原酸濃度平 均值及經時變化曲線則分別示於 Table 29 及 Figure 9。家兔經肌肉注射(IM) 劑量 50 mg/kg 之綠原酸後，約在 35 min. 即可達平均最高血中濃度(Cmax) 10.25±1.37 µg/ml。絕對生體可用為 0.477±0.093。
綠原酸口服的絕對生體可用率約為 0.127±0.023 ; 與劉漢清等人(38)研 究報告之綠原酸的絕對生體可用率 0.126 比較，與本實驗結果相近。又據 Yow-Shieng Uang 等人於 1995 年的實驗(47)，口服咖啡酸 10mg/kg 時，Tmax 約在 20-30 min 之間， 本實驗 Tmax 則約為 60 min。綠原酸的口服絕對生 體可用率很低，是否因綠原酸化性不安定，易受體內環境破壞，以口服方 式給藥，在製劑上有待進一步的探討研究。
前後兩次對家兔進行靜脈注射後之血中濃度值，經 Jana 及 WinNonlin Program 處理後之藥動學參數以統計 t-test 做比較(Table 37)，結果在統計學 上均無差異。家兔經靜脈注射(I.V.)、肌肉注射(I.M.)及口服給藥(P.O.)後血中 濃度值經 Jana 及 WinNonlin Program 處理後之藥動學參數以 One way ANOVA 比較(Table 38)，發現三種投藥方式之間有差異性存在。
第五章 結論 1.綠原酸之 HPLC 定量分析方法
利用 Merck LiChrospher 100 RP-18e column (250×4 mm endcapped ,5 µm)層析管，移動相為氰甲烷與水( pH=2.45 )，以 m-hydroxybenzoic acid 溶 液為內標準品，於 UV 波長 330 nm 偵測，分析綠原酸可得到良好的分析效 果。綠原酸標準溶液在 0.05 至 100 µg/ml 之理論濃度，與 peak area ratio 間 有良好的線性關係 ( r2=0.9991、0.9996)。故本法為足以分析綠原酸之定量 法。
2. 綠原酸靜脈注射後之藥物動力學
綠原酸在家兔靜脈注射給藥之後，經由血中藥物濃度測定及藥物動力 學與統計學分析之結果，係遵循二室體模式。在家兔體內，綠原酸的排除 半衰期約為 29，30，32 及 36 min，靜脈注射(I.V.)劑量在 2 至 50 mg/kg 之 間具線性藥物動力學關係。
3. 綠原酸在家兔體內之生體可用率
家兔經肌肉注射(I.M.) 綠原酸 50 mg/kg 之後，其藥物動力學以一室體 描述，在給藥後約 35 分鐘達到最高血中濃度約為 10 µg/ml；生體可用率約 為 0.48，而口服(P.O.)劑量 250 mg/kg，藥動學亦以一室體模式描述，則在
