B 型,C 型肝炎及非B 非C 型相關肝癌組織的基因表現特異性研究

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

B 型,C 型肝炎,及非 B 非 C 型相關肝癌組織的基因表現特異

性研究

計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2315-B-006-003- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學分子醫學研究所 計畫主持人： 張定宗 計畫參與人員： 楊孔嘉、翁玉美 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 92 年 10 月 31 日

B 型,C 型肝炎及非 B 非 C 型相關肝癌組織的

基因表現特異性研究

Characterization of gene expression patterns of

hepatitis B,C, and non-B,non-C related

Hepatocellular Carcinoma

計畫編號：NSC 90-2314-B-006-064-MH

執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日

主持人：張定宗

共同主持人：

計畫參與人員：楊孔嘉、翁玉美

一、研究計畫中英文摘要： （一）計畫中文摘要 肝癌是台灣最重要的癌症之一， 也是一種預後極差的惡性腫瘤。B 型肝 炎病毒及 C 型肝炎病毒已被證實與肝 癌的發生有關，但其機制到目前仍不 清楚。對於源發性肝癌其基因表現的 變化可能也是主要原因之一。目前， 分子生物學並結合生物資訊已經研發 成熟的高效能技術，其中以 cDNA 微陣 列雜交法可以由生物晶片同時平行分 析癌化組織與正常組織中相同一套基 因表現量的差異。我們將利用 cDNA 微 陣列晶片或寡核甘酸晶片研究基因體 的變化，透過這些研究知道肝癌的形 成是由於哪些致癌基因的活化及抑癌 基因的抑制所造成，並希望利用此方 法建立一個鑑定肝癌的指標。由於肝 癌組織中，約有 10﹪~25﹪的比例為非 肝癌細胞，因此考量到我們的結果會 受到非肝癌組織的影響，基因的表現 差異不能明顯表現出來，我們將利用 雷 射 捕 捉 微 切 片 （ Laser capture Microdissection，簡稱為 LCM）來分 離肝癌細胞及非肝癌細胞，並利用 RNA 放大的反應將所抽取到的 RNA 放大至 少一萬倍，以便得到足夠的檢體做進 一 步 的 微 陣 列 雜 交 分 析 。 並 與 國 外 Affymetrix 公 司 合 作 ， 利 用 真 核 GeneChip，配合高敏感性的螢光偵測 平台辨識技術，對檢體檢測的結果將 可更精確的作分析與歸納所得的結果 將有利於我們了解對於不同的病毒作 用，B 型肝炎病毒與 C 型肝炎病毒的致 病機轉上的不同，以及了解在非 B 及 非 C 型肝炎其可能的基因表徵，以應 用於未來臨床治療、基因治療的發展 上。 （二）計畫英文摘要

HBV and HCV have been implicated in hepatocarcinogenesis,（₁）

but the exact mechanism renaims unclear. The HCC-related genetic changes such as activation of oncogenes and tumor suppressor genes have been provided by using cDNA microarray, oligonucleotide microarray, as well as serial analysis of gene expression. However, some of those results were based on studies in cell lines or animals that may not represent the true pathogenesis. In this projects, we try to elucidate the differential gene expression profile between HBV and HCV-related HCC. In consideration of the non-tumor cells composed about 10~15 ﹪ of HCC tissue, we will implicate laser capture microdissection （LCM）for isolate tumor cells from patient HCC tissue, and cDNA microarray will be used. By the

characterization of the distinct candidate genes of HBV and HCV-related HCC, we intend to provide more information as indicators to improve clinical detection and therapy. However, the sample obtained from LCM was not sufficient for further analysis. In order to amplify the RNA sample from LCM（₂）,

we imply an anti-sense RNA amplification technique to linearly amplify our sample. With the characterization of the candidate genes between HBV and HCV-related HCC, we intend to establish the hypothesis of

hepatocarcinogenesis mechenism leading to difference pathogeny.

二、計畫緣由及目的： 肝癌是台灣最重要的癌症之一， 也是一種預後極差的惡性腫瘤。B 型肝 炎病毒及 C 型肝炎病毒已被證實與肝 癌的發生有關，但其機制到目前仍不 清楚。在流行病學的研究中顯示肝炎 病毒的感染、黃麴毒素的暴露、酗酒 及 男 性 都 是 好 發 肝 癌 的 危 險 因 子 之 一。此外，對於源發性肝癌其基因表 現的變化可能也是主要原因之一。根 據過去的研究，肝癌的形成涉及以下 基 因 表 現 量 的 差 異 ： 包 含 基 因 的 活 化，如：N-ras、H-ras、c-erbA、c-iun 等，和基因的抑制，如 p53。過去的實 驗方法往往是一次分析一個或數個基 因的訊息傳遞路徑，但對於一個全面 性的解讀必須採用高效能的分析方法 來研究。目前，分子生物學並結合生 物資訊已經研發成熟的高效能技術， 其中以 cDNA 微陣列雜交法可以由生物 晶片同時平行分析癌化組織與正常組 織中相同一套基因表現量的差異，樣 品 中 的 基 因 不 論 相 對 表 達 量 為 高 、 中、低者，皆可個別分析結果，比較 能夠避免忽略掉重要但相對量較低的 基因，並且此技術也已應用在乳癌、 肺癌、卵巢癌等組織中。 我們將利用 cDNA 微陣列晶片 或寡核甘酸晶片研究基因體的變 化，透過這些研究知道肝癌的形成 是由於哪些致癌基因的活化及抑 癌基因的抑制所造成。由於肝癌組 織中，約有 10﹪~25﹪的比例為非 肝癌細胞，因此考量到我們的結果 會受到非肝癌組織的影響，基因的 表現差異不能明顯表現出來，我們 將 利 用 雷 射 捕 捉 微 切 片 （ Laser capture Microdissection ， 簡 稱 為 LCM）來分離肝癌細胞及非肝癌 細胞，並利用 RNA 放大的反應將所 抽取到的 RNA 放大至少一萬倍，以 便得到足夠的檢體做進一步的微 陣列雜交分析。 本計畫目標擬完成各 20 個 B 型肝炎病毒相關、20 個 C 型肝炎病 毒相關，及 20 個非 B 及非 C 型肝 炎病毒相關的肝癌檢體。利用 LCM 分 離 出 肝 癌 組 織 及 正 常 的 肝 細 胞；再以 RNA 放大技術將 mRNA 放 大；並將檢體進一步進行 cDNA 微 陣列晶片或寡核甘酸晶片微陣列 雜交分析。所得的結果將有利於我 們了解對於不同的病毒作用，B 型 肝炎病毒與 C 型肝炎病毒的致病機 轉上的不同，以及了解在非 B 及非 C 型肝炎其可能的基因表徵，以應 用於未來臨床治療、基因治療的發 展上。 三、研究方法： a. 肝癌組織的收集： 肝癌組織收集於成大外科進行 手術切除肝癌病患之檢體，由外科部 林炳文醫師、林毅志醫師負責，每位 病人組織分為癌組織及非癌組織二 部分，各 20 個 B 型肝炎病毒相關、 20 個 C 型肝炎病毒相關，及 20 個非 B 及非 C 型肝炎病毒相關的肝癌組 織，總共六十名患者。所切割的組織 大小須保留 1x1x0.5cm 的大小，並立 即冷凍保存，以待分析。 b. 組織切片及染色： 由 60 個 肝 癌 病 人 取 得 肝 癌 組

織，並同時取得正常的肝組織作為對 照組，組織離體後必須在 10 分鐘包 入 OCT。整個過程要求在沒有 RNA 分 解腜（RNase-free）且低溫的環境 下，將組織切成約 1 cm × 1 cm × 0.5 cm 的組織塊，立刻進行 OCT 包埋， 冷凍在-20℃。利用冷凍微切片機進 行 冷 凍 切 片 ， 每 片 組 織 厚 度 約 10 µm ， 黏 貼 在 LCM 專 用 膜 （ LCM transfer film ； LEICA-BEST.NR.11505129）上。組織 切片先以 70﹪的酒精固定約 2 分 鐘，然後利用 DEPC 水清洗去除多餘 的 酒 精 ， 然 後 進 行 H ＆ E 染 色 （Hematoxylin and eosin stain）。 將組織切片先以 Hematoxylin 染色 5 秒 ， 利 用 DEPC 水 清 洗 後 再 以 alcoholic Eosin Y 染液染色約 1 秒，然後以 100﹪酒精進行脫水，最 後浸泡在 Xylene 約 5 分鐘並風乾。 c. 利用雷射捕捉微切片（LCM）收取 肝癌細胞： LCM 系統是利用雷射的原理將 雷射光打在組織片上，將所要的組織 圈取下來。我們將已染色的組織片架 設在 LCM 系統上，並在組織片下架設 0.7ml 離心管。利用 LCM 系統電腦解 析，在低倍下觀看組織切片，肝細胞 組織切片中會有一些不要的結締組 織及血管或淋巴組織等等，我們必須 排除這些部位，在電腦螢幕上利用軟 體工具圈選完全為肝細胞組織的部 分，然後利用雷射將所要的組織打 下，組織片會掉落到離心管中。約 15~20 片 10　m 的肝組織切片經過 LCM 之後所收得的組織片，即可足夠 進行 RNA 的抽取。 d. RNA 抽取： 利用 PicoPureTM RNA Isolation Kit（ARCTURUS）純化細胞中的 RNA， 利用 OD260/280 測得 RNA 的濃度。 e. RNA 放大： （1） cDNA 的形成： 將由 LCM 過後所得的組織所抽取的

RNA 進行 reverse transcription， 形成 cDNA。所得的 RNA 加入含有 T7

promoter region 的 primer

（ 5’-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATA CGACTCACTATAGGCGCT24-3’），於 70 ℃ 10 分鐘，去除二級結構，然後置 放在冰上。此 primer 在 3’端具有 多個 dT，可以與 mRNA 的 poly-A 相 互 配 對 ， 進 行 reverse transcription。去除二級結構之後 的 RNA 加入 AMV-RT、AMV-RT buffer、 25 mM dNTP、RnaseIn、100 mM DTT， 總體積為 30 µl，37 ℃，90 分鐘。 利用 phenol-chloroform、酒精沈澱 後，溶於 20 µlDEPC 水中。此為第一 股 cDNA 形成。將此溶液置於 95 ℃ 作用 3 分鐘，再置放到冰上。加入 RNase H 、 Klenow fragment （ DNA polymerase I of E. coli）、330 µM dNTP，加 DEPC 水到總體積為 30 µl， 作用於 37 ℃，45 分鐘。再加入 T4 DNA polymerase 作用於 37 ℃，15 分鐘； 加入 S1 nuclease，並加 DEPC 水至 總體積為 100 µl，作用於 37 ℃，15 分鐘。利用酒精沈澱，最終溶於 20 µl DEPC 水 中 。 此乃 是形 成 第 二 股 的 cDNA。 （2）anti-sense RNA 的形成及放大： 取 2 µg 的 cDNA 進行 RNA 放大。2 µg cDNA 加 入 1000 Units T7 RNA polymerase、4mM NTP、RNaseIn，加 DEPC 水到總體積為 100 µl，作用於 37 ℃ 靜 置 一 夜 。 利 用 phenol-chloroform、酒精沈澱後， 溶於 20 　lDEPC 水中，偵測 OD 值及 濃 度 。 此 產 物 即 為 放 大 後 的 anti-sense RNA。 f. 放大後的 RNA 其品質及量的確定： 在放大的步驟中，由 total RNA 形成 cDNA 後會利用β-actin PCR 確 定 RNA 的品質。完成整個放大的步驟 之後，放大後的 RNA 會進一步進行另 一 股 DNA 的 形 成 並 進 行 點 墨 式 （Dotplot）分析，已確定 total RNA

在 放 大 後 沒 有 被 破 壞 （degradation）。 g. 微陣列雜交分析： 本計畫將與國外 Affymetrix 公司 合作，利用真核 GeneChip，配合高 敏感性的螢光偵測平台辨識技術，將 可獲得高解析度的螢光影像，對檢體 檢測的結果將可更精確的作分析與 歸納，對於日後更進一步的研究，必 將大有助益。 h. 肝癌候選基因之功能性研究 四、初步結果與討論： 將肝癌組織經由 LCM 及 RNA 放大之 後，利用 OD260/280 偵測 RNA 的量 及品質，如表一，可以見到從原本 的 微 量 total RNA 放 大 到 最 終 antisense-RNA 成為約 40 ug 以上 的濃度，使得能夠符合下一步進行 微陣列分析的濃度，而整個放大倍 數也達 4000 倍以上，此也達到我 們的目標。但是為了要確定最終所 得到的 RNA 的確是存在且它的品質 是 良 好 ， 將 利 用 PCR 及 點 墨 式 （Dotplot）分析，如圖一及圖二。 圖一乃是分別代表放大過程中所 產生的基因 cDNA 產物的確由細胞 中的 total RNA 被翻出來並可用引 子（primer）偵測得到。最終放大 出的 aRNA，如圖二中可見到的確能 被表現出來並隨著 RNA 濃度的遞 減，點墨有減少的趨勢。

C ases Sam ple Total RN A

O D ratio Total RN A

Total RN A in put

(3µl) m RN A in put A m plification aRN A 1 2000 cells 1.9 42ug 0.126µg 0.0063µg 41.225 µg 2 2000 cells 1.84 60ug 0.18µg 0.009µg 36.468 µg 3 2000 cells 1.9 100ug 0.3µg 0.015µg 45.2 µg 4 2000 cells 1.78 60 ug 0.18µg 0.009µg 40.25 µg 5 2000 cells 1.95 66 ug 0.198µg 0.0099µg 42 µg 6 2000 cells 1.9 40 ug 0.12µg 0.006µg 41.9 µg

表一 total RNA 從肝癌組織抽取的情形及利用放大技術所得的 antisense-RNA 的放大情形

此外我們也送了一組檢體給百恩諾公 司，利用它們的 cDNA 微列晶片進行分 析，確定我們的檢體的確是可以進行 的，結果如表三，此結果為分析後取 得有意義的分析數據，由此可找出有 意義的候選基因進一步進行基因的功 能分析，但是只是一組檢體，所以必 須將所有檢體，預計 60 個檢體皆進行 LCM 的篩選、RNA 的放大及晶片分析後 才可得到有意義且可信的數據，以便 進行下一步基因功能的研究。 在本計畫當中，進行的部分已確 定整個放大的步驟所產生的 RNA 濃度 是可以達到進行 cDNA 微陣列雜交分 析，所以我們已經初步克服了利用 LCM 得到的 RNA 無足夠的量進行微陣列雜 交分析的困難。接下來我們將會收集 60 個檢體，經過 LCM、RNA 放大後即可 送至到國外 Affymetrix 公司，進行基 因差異的分析。 五、計畫成果自評： 在肝癌的研究過程中，由 LCM 到 把 RNA 放大到可以進行微陣列晶片研 究的步驟一直是大家努力的目標，此 計畫我們克服了在 LCM 到微陣列晶片 分析之間的障礙，成功的放大 RNA，使 得下一步的研究得以進行，此乃一大 突破。在於 cDNA 紋陣列晶片上的研究 雖與百恩諾公司有所合作，但是礙於 晶片的基因點數太少，無法達到我們 研究的指標，所以我們預計將檢體送 至國外並與 Affymetrix 公司合作，利 用真核 GeneChip，配合高敏感性的螢 光偵測平台辨識技術，將可獲得高解 析度的螢光影像，對檢體檢測的結果 將可更精確的作分析與歸納。但是在 與國外的廠商進一步討論的結果,因 為在我們的實驗中經過 RNA 放大的產 物其 RNA OD260/280 ratio 一直指能 達到 1.9，而在 Affymetrix GeneChip 的要求下,需要 RNA OD260/280 ratio 達到 2.0 以上，而要使得 RNA OD ratio 達到 2.0 的要求必須對取得的組織做 好品質控管，所以對於所取得的組織 我們做了以下的品質管理； (1) 所使用的組織需要新鮮，保存時間 不可超過半年以上。 (2) 在 手 術 的 開 刀 過 程 中 ， 從 血 管 clamp 的時間開始計時，直到取下 組織以及包好 OCT 為止，所耗費的 時間須有紀錄(耗時越久，RNA 品質 越差，將影響之後 RNA 放大的結 果)。 (3) 組織離開人體後到包好 OCT 的時間 儘量不超過 15 分鐘。 (4) 包好 OCT 的組織需盡快凍入-80℃ 保存，並於六個月之內完成 LCM 及 RNA amplification 等步驟。 β -actin Cases

Amplification rate

1

6543.650794

2

4052

3

3013.333333

4

4472.222222

5

4242.424242

6

6983.333333

圖一. 利用 PCR，確定整個放大過程 中，RNA 的品質。(A)第一股 DNA 形成後

進行β-actin PCR。(B)第二股 DNA 形成 後進行β-actin PCR。 表二.放大後的 aRNA 與最 初 total RNA 之濃度比較所 得的放大倍率 (A) β -actin (B)

六、面臨的問題： 所收集的 60 個病人組織多數為庫 存超過一年的檢體，所以所得到的 RNA 品質較不佳，不易達到國外 GeneChip 的要求，根據品質管理的四項條件， 我們已從新收集病人組織檢體，並根 據四項條件及做法控制 RNA 的品質， 以達到在 RNA amplification 後，RNA 品質的優良以及 OD260/280 ration 在 2.0 以 上 ， 以 方 便 送 至 國 外 進 行 Microarray 的分析。 但我們仍汲汲於對此言研究付出 相當的努力，希望找到適當的候選基 因，了解對於不同的病毒作用，B 型肝 炎病毒與 C 型肝炎病毒的致病機轉上 的不同，以及了解在非 B 及非 C 型肝 炎其可能的基因表徵，以應用於未來 臨床治療、基因治療的發展上。

表三

Name Accession UG_LINK Function_Category Ratio of Mean SEC15 (S.cerevisiae) -like AA188366 Hs.110454 8.268

Phosphoglucomutase 1 AA488504 Hs.1869

m-phosphoglucomutas e

6.811

Kelch (Drosophila) -like R51524 Hs.101108 6.798

Twist (Drosophila) homolog 6.691

Myosin, heavy polypeptide – like (110KD) 6.614

Anti – Mullerian hormone 6.522

Homo sapiens beta-dystrobrevin (BDTN) mRNA, complete cds

AA159359 Hs.13451

Binding protein/muscle

6.472

Homo sapiens mRNA for RB18A protein AA453404 Hs.15589

Binding protein/transcription 6.466 Phosphoribosylglycinamide formy;transferase, Phosphoribosylglycinamide synthetase, Phosphoribosylglycinamidazole synthetase AA895487 Hs.82285 m-synthetase 6.453

ELK3, ETS – domain protein (SRF accessory protein 2) NOTE:Symbol and name provisional.

6.266

hippocalcin – like 1 6.157

ATPase, H＋ transpoting, lysosomal ( vacuolar proton pump ) 42 KD

H05768 Hs.86905 Transporter 6.043

DNA primase polypeptide 2A (58 KD) AA434404 Hs.74519

DNA replication/DNA primase 5.854 圖二. 經過放大的 antisense-RNA，其 產量與品質的的情形。Lane1：positive control；lane2：antisense-RNA。 5 ul 2 ul 1 ul 0.5 ul 0.25 ul

Homo sapiens secretory carrier-associated membrane protein ( SCAMP) mRNA, complete cds

AA490945 Hs.31218 Membrane protein 5.812

Protein kinase C, alpha binding prtein 5.805

ISL1 transcription factor, LIM / homeodomain, (islet - 1)

AA018683 Hs.505 Transcription factor 5.712

Human homeobox gene (clone HHO.c13) AA447692 Hs.93574 Transcription factor 5.517

Annexin A9 AA425022 Hs.104871 5.352

A kinase (PRKA) anchor protein 11 T61647 Hs.232076 Cell matrix protein 5.284

ELKL motif kinase 5.191

v-raf murine sacroma viral oncogene homolog B1

W88566 Hs.622 Oncogene/kinase 5.173

Homo sapiens mitotic checkpoint kinase Mad3L (MAD3L) mRNA, complete cds

AA488324 Hs.36708 Cell cycle / kinase 5.159

ACETYLCHOLINESTERASE PRECURSOR N63940 Hs.157124 5.137

vav 3 oncogene H10045 Hs.37331 Oncogene 5.019

TATA element modulatory factor 1 AA252318 Hs.74985 4.863 Homo sapiens mRNA for Hic – 5, partial cds AA454619 Hs.25511 Growth factor 4.806 Fatty-acid-Coenzyme A ligase, long-chain 4 AA633818 Hs.81452 m – ligase 4.756 ATPase, Na＋

/K＋

transporting, beta 2 polypeptide

H14841 Hs.246929 Transporter 4.625

Adrenergic, alpha-2C-, receptor 4.624

H.sapiens mRNA for

protein-tyrosine-phosphatase D1

H03504 Hs.155693 m – phosphatase 4.475

Homolog 2 of Drosophila large discs R60019 Hs.23205

Kinase / mambrane protein

4.460

Zinc finger protein 131 (clone pHZ-10) AA449429 Hs.253197 4.457

Early B-cell factor AA504812 Hs.192824 4.127

Insulin-like growth factor binding protein 2 (36KD)

H79047 Hs.162 Binding protein 4.097

Human MAP kinase phosphatase (MKP-2) mRNA, complete cds

AA444049 Hs.2359 m – phosphatase 3.961

UDP-Gal:betaGlcNAc beta

1,4-galactosyltransferase, polypeptide 2

3.921

Carcinoembryonic antigen-related cell adhension molecule 7

AA058357 Hs.74466 Antigen 3.885

MAD protein (MAX-binding protein) H86558 Hs.109012 Transcription factor 3.851 Human Hs-cul-4A mRNA, partial cds AA598836 Hs.119252 Cell cycle / apoptosis 3.845

Lutheran blood group (Auberger b antigen included)

3.829

Insulin-like growth factor-binding protein 4 3.813

SPARC / osteonectin H95960 Hs.111779

Binding protein / calcium / collagen

3.776

Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 AA456324 Hs.75866 3.706

synaptojanin 2 AA191573 Hs.58596 3.691

RAS guanyl releasing protein 2 (calcium and DAG-regulated)

3.671

Dipeptidylpeptidase VI W96197 Hs.34074 m – peptidase 3.630 Natural resistance-associated macrophage

protein 2

AA133656 Hs.57435 transporter 3.605

Human IgG Fc receptor hFcRn mRNA, complete cds

AA430668 Hs.160741 Receptor 3.572

HEAT SHOCK FACTOR PROTEIN 1 AA449119 Hs.1499 Apoptosis 3.537 Early growth response protein 1 AA486628 Hs.738 DNA binding protein 3.486 Homo sapiens peroxisome biogenesis disorder

protein 1 (PEX1) mRNA, complete cds

AA598527 Hs.99847

Binding protein / transport

3.474

Human capping protein alpha subunit isoform 1 mRNA, complete cds

AA449037 Hs.184270

Binding protein / cytoskeleton

3.463

Protein tyrosine phosphatase, receptor type, beta polypeptide

H18633 Hs.123641 3.417

Human Gu protein mRNA, partial cds AA465386 Hs.5122 3.369 Homo sapiens Kruppel-like zinc finger protein

(EZF) mRNA,complete cds

H4571 Hs.182965 Transcrption factor 3.367

Endoglin(Osler-Rendu-Weber syndrome 1) AA446108 Hs.76753 Receptor 3.258 Protein kinase, cAMP – dependent, regulatory,

type II, beta

AA181500 Hs.77439 kinase 3.216

EH domain containing 2 AA708621 Hs.20733 3.207

Ribosomal protein L17 AA708144 Hs.82202 3.185

3’(2’), 5’-bisphosphate nucleotidase 1 AA197334 Hs.86112 3.174

六、參考文獻：

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