第一章 緒論
1-1 前言 生物醫學材料
目前現在被應用在生物醫學的天然材料包括白蛋白、幾丁質、幾丁聚醣、
膠原蛋白、透明質酸、明膠及多醣類等。在合成材料方面包括PAA、PGA、
PLG及PLGA等。
一般常見的生物可吸收高分子應用有：韌帶重建、手術縫線、骨移植材 料、人工皮膚、藥物釋放載體、生物黏膠、組織支架等。生物可分解性及 生物可吸收性是指高分子材料植入人體後經過一段時間可被人體分解，降 解後的小分子經由體內的代謝作用排除人體，不需日後再以手術將植入物 取出。選擇這類材料時最重要要考量生物相容性，即無毒性、不與血液接 觸形成血栓、血漿蛋白與酵素不產生不良反應、無負面免疫反應、無致癌 性、無毒性。
細胞或血液對生物醫學材料的反應受材料表面性質影響，如表面粗糙 度、濕度、帶電性、化學組成、表面紋路、孔隙度及分子親疏水比等。目 前已有許多研究針對材料表面做各種物理或化學性之修飾，來改變表面性 質進而掌握材料之生物相容性。
幾丁聚醣在生醫材料上的特性
幾丁聚醣(chitosan)是一種具抗菌性、無生物毒性、生物相容性高又可降 解的材料，具有生物活性且分子結構可變性大，如聚合長度、聚合鍵結方 式等，所以生物醫學上引起許多學者的注意和研究。幾丁聚醣在生醫方面 的特點有：
1. 幾丁聚醣能刺激血液中血小板分泌凝血因子達到止血的功能。
2. 幾丁聚醣之化學結構與透明質酸（hyaluronic acid）類似。幾丁聚醣具有促 進傷口癒合的功效，且幾丁聚醣能有效地刺激成骨細胞分化以及促進骨骼 之形成。
3. 因為幾丁聚醣同時具備陽電荷及形成膠體和薄膜之特性，故可以運用在藥 物輸送上。
4. 幾丁聚醣分子上具amino和hydroxyl group，可易於化學修飾成其他衍生 物，因此極具發展潛力。
幾丁聚醣因只能溶解於稀酸水溶液中，故本研究即以幾丁聚醣為基 礎，利用接枝羧甲基酸、己醯基使成為同時具有親水/疏水性質，化學修飾 為特殊的兩性幾丁聚醣衍生物，可完全溶解於中性水溶液，大幅增加應用 性。兩性高分子材料是一直以來被商業與學術上所注意，現在許多研究將 兩性幾丁聚醣利用微胞這樣結構將疏水性藥物包覆在內，期望能安定油性 藥物的hydrophobic interaction，以微球形式攜帶藥物進入人體，達到藥物釋
放控制。且因羧甲基酸可產生負電荷，加上己醯基可穩定親疏水界面，血 液相容性期望能提升。兩性幾丁聚醣衍生物還有不輸给透明質酸的保濕能 力，不論在醫藥方面都能有更多應用。
1-2 研究動機及目的
幾丁聚醣雖然擁有許多優點，但因其只能溶解於稀酸水溶液中，這一大 缺點造成幾丁聚醣應用上的限制。所以利用化學合成方式改質幾丁聚醣，
改善其衍生物的溶解度。我們新合成出同時具有親水基/疏水基的兩性材 料，可包覆雙性藥物。特別是不同於未改質的幾丁聚醣，兩性幾丁聚醣可 溶解於中性純水中。另外還有合成出可溶解在有機溶劑的幾丁聚醣衍生物 O-hexanoyl chitosan、N,O-hexanoyl chitosan，更可用來包覆油性藥物。
水溶性N,O-carboxymethyl chitosan (NOCC)材料被研究已久。利用羧甲基 酸及己醯基新開發出兩性性質的生醫材料，且希望仍保有原NOCC的pH敏 感性，hexanoylated NOCC有更加顯著的pH敏感，可作為智慧型生醫材料。
期望比原有NOCC更具驚人保水能力，做為可經由注射攜帶藥物入人體的新 材料，同時在中性環境下仍有膨潤態，適合應用做軟骨組織工程細胞培養 及藥物載體。在此論文研究裡變換不同羧甲基酸及己醯基的接枝率，研究 材料化學、物理及熱穩定性，加上化學改質後對材料分子間氫鍵影響，進 而探討材料基本性質與吸濕、保濕能力。
第二章 文獻回顧
2-1 幾丁聚醣的介紹及其應用 幾丁聚醣的介紹
1811年法國植物學家Braconnot 以氫氧化鈉的稀溶液加熱處理洋菇時發 現有不溶物而命名為“fungine”。1823 年Odier又於昆蟲表皮堅硬部位發現類 似 物 質 ， 乃 命 名 為 幾 丁 質 （ Chitin ） ， 學 名 為 2-acetamido-2-deoxy- β(1-4)-D-glucopyranose。1859 年Rouget 發現經過氫氧化鉀濃液加熱後，可 將幾丁質轉變為溶於有機酸之物質。1894 年Hoppe—Seyler 將此物質命名 為幾丁聚醣（Chitosan，學名為N-amino-2-deoxy- β(1-4)-D-glucopyranose [1]。
O
NH O
HO OH
O
O O
HO
NH
OH
O
NH O
HO OH
C CH3 O
C CH3 O
C CH3 O
Fig.2-1 Molecular structure of chitin.
O
NH2 O HO
OH
O
O O
HO
NH2
OH
O
NH2 O HO
OH
Fig.2-2 Molecular structure of chitosan.
幾丁質(chitin)是和纖維素(cellulose)相似的天然多醣類，主要來源來自甲
殼類生物例如蝦、蟹等中而萃取出，在大自然中蘊涵量豐富，被大量運用 來做生醫材料。幾丁聚醣是幾丁質去乙醯基後的產物，分子量約為兩百萬 左右(視其來源及製造方法而有所差異)。幾丁質及幾丁聚醣的判別方法是以 去乙醯程度之高低來決定。然而其分界點並沒有明確的數值。Aiba [2] 等學 者在1992 年提出當幾丁聚醣分子內部之乙醯基含量少於40％以上，並且可 溶在微酸性的溶劑中，即可稱為幾丁聚醣。另外Roberts及Rinaudo [3，4]等 提出只要幾丁質類物質可以溶解在微酸性溶液中，即可稱之為幾丁聚醣。
幾丁聚醣的應用
幾丁質/幾丁聚醣高分子之特色：天然的高分子材料、蘊藏量豐富(僅次於 纖維素)、良好生物相容性、生物可分解性、非毒性、非過敏性、抗細菌性、
抗真菌性、抗病毒性、促進止血功能、促近傷口治癒、強吸濕性、保濕效 果良好、不易變性、機械強度良好、易於改質修飾。
其應用領域很廣，包括醫藥、食品、農業、化工、環境保護等領域。醫 藥及生物技術領域方面目前有應用於醫用紗布、手術縫合線、創傷敷料、
止血棉、牙周病治療、人工皮膚、人工血管、藥物釋放載體、酵素及細胞 固定載體、分離及純化蛋白質、離子交換樹脂等。
2-2 幾丁聚醣之製備
鈣及鹼液脫蛋白處理後，再經氧化脫色，得到幾近全白的幾丁質粉末。目 前商業上用以生產幾丁聚醣的方式乃是將幾丁質除去蛋白質及碳酸鈣之 後，在高溫(100℃~150℃)高濃度約50%NaOH的水溶液中反應，目的是將其 氮上的乙醯基脫去只留下胺基，經過不同反應時間處理，可達到去不同乙 醯度的幾丁聚醣。在製備幾丁聚醣的過程中，酸鹼的反應時間是一個必須 考量的重要因素，因為酸可造成多醣主鏈的斷鍵，降低幾丁質的分子量，
鹼則會脫除幾丁質上的乙醯基，降低乙醯化程度，相對的也提高了幾丁質 在酸性溶液中的溶解度，形成分離產物上的困難。除此之外，在生產過程 中所使用的大量酸鹼，也必須經過再處理，以免造成二次污染。
2-3 幾丁聚醣物理與化學性質 [5]
物理性質
幾丁質是長鏈高分子化合物，由於具有一級羥基、二級羥基及一級 胺基的存在，形成很強的的分子內及分子間氫鍵，有利於結晶的形成，
在加工上，可以製成強度較高的纖維材質和膜材料。
1963年Rundall根據X-Ray光譜得到的結果，提出幾丁質具有α、β、γ三種 晶型。
(a) α型為斜方晶系（rhombic），每個晶格由八個N-乙醯葡萄糖胺呈反方向 平行（anti-parallel）排列而成，其羰基及羥基會形成分子間/分子內氫鍵，
所以在水中較不易膨潤[6]，構形緻密且堅硬，為自然界最穩定、普遍之構 造，大部分昆蟲及甲殼類屬的外骨骼屬之。
(b) β型為單斜晶系（monoclinic）， 每個晶格由兩個N-乙醯葡萄糖胺呈平 行（parallel）排列，結構與纖維素相似，組織較為鬆散，烏賊軟骨中之幾 丁質屬之[7]。
(C) γ型則為α型及β型之混合體，如藻類或真菌中之幾丁質。
Fig.2-3 α-chitin conformation.
Fig.2-4 β- chitin conformation.
化學性質
在溶解性質上，幾丁聚醣的一級胺基在弱酸中可和H+形成帶NH3+的陽離 子聚合物，因此可溶於弱酸中，如甲酸、醋酸、檸檬酸、丙酮酸及乳酸等，
但不溶於中性純水、鹼液或有機溶劑。且在鹼性溶液中則會凝聚形成膠狀，
其中又以甲酸為幾丁聚醣最佳溶劑。1977年Austin [8]提出了利用N,N-二甲 基乙醯胺(DMAc)或N-甲基-2-四氫吡咯(NMP)加入2%以上的氯化鋰做為甲 殼素的溶劑，使得幾丁聚醣有適當的溶劑來利用紫外光譜(UV)進行溶液性 質的研究，但是此一溶劑也會隨著甲殼素來源的不同而有不同的溶解度，
並非完全適用於所有種類的甲殼素。
同時分子量及去乙醯化程度也會影響到幾丁聚醣的溶解程度，去乙醯化
程度高的幾丁聚醣會顯現出較佳的溶解性質，低分子量的幾丁聚醣也有較 佳溶解性。影響幾丁聚醣溶解度的因子有：乙醯基含量與分佈方式、氫鍵、
分子量等，茲分述如下：
(a) 氫鍵
幾丁聚醣分子鏈上的乙醯胺基團（-NHCOCH3）、羥基(-OH)及胺基(-NH2) 彼 此 間 形 成 很 強 烈 的 分 子 間 和 分 子 內 氫 鍵 ， 導 致 細 微 結 晶 區 域
（microcrystalline regions）的產生，此乃造成幾丁聚醣不溶於水的主要原因 [9，10，11，12]。
(b)乙醯基含量與分佈
Sannan [9，13]等指出，若以均相鹼水解處理（homogeneous alkaline hydrolysis）進行幾丁質去乙醯化作用，當幾丁質去乙醯化程度達到48~55
﹪時，在酸性的條件下可溶解於水中，這是因為均相鹼水解處理會改變幾 丁質之二級結構（secondary structure），切掉乙醯基使胺基露出，使親水性 增加，並產生分子量之降解。
Kurita [14]以X 光繞射光譜（X-ray diffraction spectrum）來探討均相與非 均相鹼處理（heterogeneous alkaline hydrolysis）所得幾丁聚醣之乙醯基含量 與分佈對其的分子結構與溶解性質之影響，發現以非均相鹼處理所得的幾 丁聚醣（DD：45~81﹪）有結晶區產生，此時幾丁聚醣不溶於水中；而以
均相鹼處理所得的幾丁聚醣（DD：48~55﹪）無結晶區域產生，此時幾丁 聚醣可溶於水中，其差異可能來自於幾丁聚醣分子二級結構與幾丁聚醣分 子鏈上葡萄糖胺及N-乙醯葡萄糖胺的排列分佈不同有關。Shigemasa與Ottøy [15,16]指出，用非均相之鹼液處理而得之幾丁聚醣，其N-乙醯葡萄糖胺與 葡萄糖胺會以區段（block）方式各自聚集在一起形成聚集區；若使用均相 鹼液處理而得之幾丁聚醣，其N-乙醯葡萄糖胺與葡萄糖胺會以不規則方式
（random）排列不會形成聚集區，因此可溶於水溶液當中。
Kurita [17，18]等與Kubota and Eguchi [19]等亦以乙醯化法進行幾丁聚醣 之N-乙醯化作用，亦發現乙醯化所得去乙醯程度為50﹪的幾丁聚醣具有良 好的水溶性質。
(c) 分子量
分子量的大小影響著幾丁聚醣的溶解特性。利用高溫的鹼性溶液將幾丁 質去除乙醯基，當處理幾丁質的時間越長，其幾丁質上所接的乙醯基含量 越少就會形成幾丁聚醣。分子量也會隨著高溫的鹼性溶液處理的時間增加 而下降。另外幾丁聚醣若是經過像是強酸、超音波、剪力及微射流處理之 後，其分子量下降的程度會增加，方式如下:
強酸水解
Hasegawa [20]以85﹪磷酸水解幾丁聚醣1~6 週，以製備不同分子量的幾
丁聚醣，發現當降解物以重量平均分子量計算其聚合度為7.3時，可溶於純 水；聚合度為16.8時，不溶於純水。
鹽酸降解法是採用強酸以及熱鹼先將幾丁聚醣純化後，再添加濃鹽酸反 應。在添加濃鹽酸反應48 小時之後即可得到聚合度小於10 的幾丁寡醣-鹽 酸鹽(C8H11O5N-HCl)n，以此種方法反應後的分子量分布範圍比較廣泛。而 酸-亞硝酸鹽降解法則是將幾丁聚醣溶於稀酸中，再將亞硝酸鹽加入之後即 可製得平均分子量2000Da~3000Da 的低聚合物水溶性醣。
氧化降解法
1979 年日本學者等學者採用過氧化氫(H2O2)來將高分子量的幾丁聚醣降 解成低分子量之幾丁聚醣。至目前為止氧化降解法仍是目前研究比較多的 一種降解幾丁聚醣的方法。氧化降解法包括有H2O2、H2O2-HCl、H2O2 -NaClO2氧化法以及其他的氧化降解法。
H2O2 氧化法即是將H2O2 加入1%幾丁聚醣醋酸溶液中，在pH3~pH5 的 酸性條件下進行反應。其中在pH3.5、50℃下添加20％的H2O2，分子量最低 可製備出6000Da。
另外，H2O2-NaClO2 氧化法是在pH=8 之下加入0.004％~10％的NaClO2 與0.01％~3.5％的H2O2 反應，在反應過程之中添加適量的鹽酸參與反應的 進行。此種方法可製備出可溶於中性溶液的幾丁聚醣。
日本學者分別於1989 年以及1997 年提出H2O2-HCl氧化法從幾丁聚醣製
備幾丁寡醣，將10 g 幾丁聚醣溶於250 ml 的水中，添加5 ml 的鹽酸及1 ml28％的H2O2分別在50℃~80℃攪拌反應2 小時。
酵素法製備
主要是利用酵素的轉醣或直接水解等反應，配合各酵素本身的基質專一 特性來製備寡醣。而目前大約有三十多種酵素，其中有包括專一性酵素如 幾丁聚醣以及非專一性酵素如脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶、木瓜酵素、纖維 素分解酶等等。因此利用此法所製備出的寡醣，其聚合度較化學法來的高 且易控制。
2-4 化學修飾幾丁聚醣
由於幾丁聚醣只能溶於酸性溶液使其應用性受限，如何改善幾丁聚醣溶 解度一直被許多學者研究。故許多人在幾丁聚醣結構上的一級、二級羥基 與胺基進行化學改質，以改變幾丁聚醣的溶解性質，或進一步作為其他反 應的前驅物，以增加其應用性。
2-4-1 親水性幾丁聚醣
為改善原有幾丁聚醣只可溶解在酸性水溶液的缺點，利用接枝親水性基 團如-COOH、-SO3-、-PO4H2等，使幾丁聚醣溶解度大幅提升，而可溶解於 中性水溶液甚至更廣的pH值範圍，增加其在生物醫學材料方面的應用。
2-4-1-1 Carboxymethyl chitosan
1937年Rigby [21]發表carboxymethyl chitosan，因具有螯合金屬能力、高 黏度、高液動體積、低細胞毒性、有生物相容性等特殊化學、物理及生物 性質，特別是化學結構和透明質酸相似，所以其保濕能力幾乎能夠媲美透 明質酸，且價格低廉製程簡易[22，23]，所以被使用在食品、醫藥及化妝品 等方面。
Hayes及Muzzarelli [24，25]提出在幾丁聚醣的2-propanol懸浮溶液中加入 NaOH濃鹼液來使幾丁聚醣膨潤又使胺基、羥基去氫後，再添加氯乙酸加熱 至60℃反應3小時，非均相下溶液下製備出N,O-carboxymethyl chitosan。
O
NH2 O
HO CH2OH
m
(1) 10N NaOH(aq)
(2) ClCH2COOH O
NHCH2COOH O
HO OH
O O O
HO
NH2
OH
O
NH2 O
HO
OCH2COOH
m
Scheme 1. Synthesis of N,O-carboxymethyl chitosan.
Muzzarelli [26]等人將幾丁聚醣的稀酸水溶液和glyoxylic acid快速反應形 成Schiff base後，加入NaCNBH3還原所形成的imine，得到N-carboxymethyl chitosan，產物可溶在pH3~pH11 水溶液。
Scheme 2. Synthesis of N-carboxymethyl chitosan.
Nudga [27]等利用幾丁聚醣在乙醇中加入salicylaldehyde反應，接著又以 NaOH、sodium chloroacetate、2-propanol與對二甲苯的混合溶劑在80℃下反 應即可得O-carboxymethyl chitosan。
O
NH2 O
HO
CH2OH
m
(1) salicylaldehyde
(2) NaOH, sodium chloroacetate
(3)i-ProH, xylene O
O
NH2 O
HO
OCH2COOH
m
Scheme 3. Synthesis of O-carboxymethyl chitosan.
2-4-1-2 N-methylene phosphonic chitosan
Herasa，Rodri´guezb [28]等人新發展出幾丁聚醣以稀酸溶解後滴入磷酸又 加入甲醛後加熱迴流7小時，得到N-methylene phosphonic chitosan。相較未 改質chitosan可溶解於更廣的pH值範圍，同時磷酸根可和二價金屬形成螯合 物吸附金屬能力大增。
Fig.2-5 Molecular structure of N-methylene phosphonic chitosan
2-4-1-3 Sulfate chitosan
Chen等人發現幾丁聚醣磺酸化後可以增加幾丁聚醣在水中的溶解度，研
究在不同溫度、pH 值及硫含量之下，對於幾丁聚醣水溶性的影響，他們並 發現磺酸化幾丁聚醣的抗菌性較未磺酸化幾丁聚醣有顯著的改進，且其抗 菌性會受到磺酸化幾丁聚醣硫含量的影響[29，30]。另外，Fong等人研究發 現羥乙基幾丁聚醣磺酸鹽( hydroxyethyl chitosan sulfonate )擁有好的水溶 性，且由IR 光譜的結果顯示其具有類肝磷脂( heparin，具抗凝血性)結構，
而預期這樣類肝素( heparin-like )材料在未來具有發展成類肝素藥物的潛 力，有希望製成新型抗凝血劑[31]。
Holme [32]等合成出N-sulfate chitosan。另外Focher等人也做出O-sulfate chitosan[33-36]。
Scheme 4. Synthesis of N-sulfate chitosan.
2-4-1-4 N-trimethyl chitosan
Muzzarelli、Tanfani、Kim、Zhishon [37]等發展出呈陽離子性的高分子電 解質N,N,N-trimethyl chitosan (TMP)，可溶在酸性和鹼性水溶液。幾丁聚醣
以1%AcOH溶解後加入甲醛室溫下反應一小時形成Shiff base，將pH值調至 4.5以NaBH4進行還原反應。之後在鹼性環境下以N-甲基-2-四氫吡咯(NMP) 當溶劑，以CH3I在胺基上做甲基化。
Scheme 5. Synthesis of quaternized N-trimethyl chitosan.
N-trimethyl chitosan有促進強效吸收能力，能開啟緊閉上皮細胞通道讓藥 物通過，在in vitro實驗中發現可降低Caco-2細胞單層的皮膜離子通道電阻 值，這可以增進藥物運輸進入腸的上皮細胞，另外N-trimethyl chitosan還能 夠提昇親水性藥物滲透通過細胞單層[38]。
2-4-1-5 Succinyl chitosan
Zhang [39]等人利用phthalic anhydride保護胺基只讓succinyl group接上羥 基，以降低幾丁聚醣分子間氫鍵和結晶結構，因有carboxyl group而對水溶 解性更佳。
Scheme 6. Synthesis of O-succinyl group.
Scheme 7. Synthesis of N-succinyl group [40].
.
N-succinyl-chitosan具有生物相容性、低細胞毒性和能經由靜脈注射後長 時間停滯在人體，所以適合用來做為攜帶藥物。雖然N-succinyl-chitosan一 開始是被發展做為傷口敷材，也有應用在化妝品方面和用在關節炎治療 [41]。
2-5-2 疏水性幾丁聚醣
改質幾丁聚醣使可溶在有機溶劑，進而包覆親油性藥物，或做為不易降 解的身體植入物，還可同時攜帶治療效果藥物及細胞成長因子，成為多功 能智慧型生醫材料。
2-4-2-1 Alkyl chitosan
2-羥乙基幾丁質(2-hydroxyethyl-chitin)是種已商業化、能溶於水中且常用 來當作檢驗幾丁質細胞溶解酵素(chitinoylytic enzyme)的基質。製備方法是 幾丁質與環氧乙烷在鹼性的環境下反應而得到[42]，但會有副反應發生，主 要是因為環氧乙烷在鹼性環境中會發生陰離子聚合，若改用2-氯乙醇 (2-chloroethanol)也可得到相同產物。當在酸性環境中，幾乎只發生N-烷化 反應，而在鹼性環境中，O-烷化反應速率則較快[43，44]。
Scheme 8. Synthesis of alkyl chitosan.
2-4-2-2 Acyl chitosan
β形式的幾丁聚醣雖無法和一般的有機溶劑互溶，但可和許多溶劑例如在 甲醇中產生膨潤現象。故Kurita等人將β形式幾丁聚醣與醋酸酐置於甲醇 中，在胺基位置進行乙醯化反應，產生單一結構的幾丁聚醣(N-乙醯-D-葡萄 糖) [45]。若將β形式的幾丁聚醣和醋酸酐置於中，以4-二乙基氨基吡啶 (4-dimethylaminopyridine)當催化劑，可生成全乙醯化的幾丁聚醣(scheme
9.)。然而在相似的條件下，α形式的幾丁聚醣卻無法進行此類反應。由此可 知，α形式的幾丁聚醣因為質地堅硬，不易溶解，而β形式的幾丁聚醣則對 水和有機溶劑有較高的親和力，造成在改質反應進行上，β形式的幾丁聚醣 會是一個較好的選擇[46]。但無論是使用醋酸酐或乙醯氯進行乙醯化反應，
胺基的反應速率皆快於羥基。
醯化幾丁聚醣增添疏水性也會改變原有結構性質。己醯化幾丁聚醣在水 中有膨潤現象，但當碳鏈增長至C8–C16卻反而有收縮行為[47]。N-acyl chitosan也表現出好的血液相容性，尤其相較下N-hexanoyl chitosan有最好血 液相容性，N-acyl chitosan也比未改質幾丁聚醣更易被溶菌酶降解[48]。
Scheme 9. Synthesis of acetyl chitosan.
除了乙醯化，幾丁聚醣尚可進行其他的醯化反應，如Fujii等人就將幾丁聚 醣與長碳鏈的醯氯，如己醯氯(Hexanoyl chloride)、十四醯氯(tetra- decanoyl chloride)溶於氯仿和吡啶混合溶劑中進行醯化反應，製備出可溶於氯仿的醯 化產物[49]。
Scheme 10. Synthesis of acylated chitosan.
2-4-2-3 Tosylation
為了改善幾丁聚醣的溶解性，Kurita 等人將巨大的官能基團如甲苯磺醯 基(tosyl group)導入幾丁聚醣結構中，主要是因為巨大的官能基團能有效地 破壞多醣體緊密的晶格排列所造成。一開始是將幾丁聚醣和甲苯磺醯氯 (Tosyl chloride)置於吡啶中進行異相反應，即使加熱至100℃，反應依舊緩 慢。於是改成在零度下將溶於氯仿的甲苯磺醯氯，滴入鹼性的幾丁聚醣溶 液中，則反應會在兩者混合物的界面溫和地進行[50] (Scheme 11.)。當O-甲 苯磺醯化幾丁聚醣的接枝率小於0.3，具有高度的親水性且可微溶於水中。
但 當 接 枝 率 大 於0.4 ， 開 始 變 得 疏 水 且 只 能 溶 於 極 性 的 有 機 溶 劑中 如 dimethylsulfoxide (DMSO)，N,N-dimethyl acetamide (DMAc) [51]。
Scheme 11.Tosylated chitosan.
對於更進一步改質反應而言，O-甲苯磺醯化幾丁聚醣是個不錯的中間反 應物。如在80度下將溶於DMSO的O-甲苯磺醯化幾丁聚醣和NaBH4進行還原
反應，得到脫氧幾丁聚醣[51]。或者將O-甲苯磺醯化幾丁聚醣和硫代乙酸乙 酯鈉(potassium thioacetate)反應，將乙醯硫基導入，接著加入MeONa得到有 硫醇基的幾丁聚醣。此產物可用來當固定酵素的載體，或當自由基共聚合 反應的起始劑[52]。
Scheme 12. Modified synthesis of tosyl chitosan.
2-4-2-4 Phthaloylation
Nishimura [53]等人將幾丁聚醣懸浮於N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中，在 120℃ 到 130℃ 下 加 入 過 量 的 酞 酐 (phthalic anhydride) 進 行 反 應 (Scheme 13.)，由於酞酐會對自由胺基進行保護，得到可溶於DMSO的N-苯二甲醯化 幾丁聚醣，除了保護作用外，另一方面也因氮上接了苯二甲醯基而無法形 成分子間氫鍵，而提高了幾丁聚醣在有機溶劑中的溶解度。
由於以上的特性，使得N-苯二甲醯化幾丁聚醣可更進一步進行其他的改 質反應，如當進行三苯基甲烷化反應(triphenylmethylation)或甲苯磺醯化反 應(tosylation)時，由於一級胺基已被保護，故只會和第六個碳上的羥基發生 反應，於是接下來的反應便可在第三個碳上的二級羥基進行，最後使用聯
胺(hydrazine，H2N-NH2)脫去苯二甲醯基，即可恢復成為自由胺基。
Scheme 13. Synthesis of phthaloyl chitosan.
Scheme 14. Modified synthesis of phthaloyl chitosan.
2-4-2-5 Silylation
三甲基矽烷化幾丁聚醣因破壞了分子間的氫鍵，所以可溶於丙酮、吡啶 或在其他有機溶劑中膨潤；而由於良好的溶解性加上矽烷基容易移除，故 經常用其溶液來成膜或當作反應的前驅物。如將三甲基矽烷化幾丁聚醣以 10- 樟 腦 硫 酸 (10-camphorsulfonic acid) 當 催 化 劑 進 行 醣 化 改 質 (glycosylation)，在羥基位置上導入具有藥物活性的多醣體，接著加鹼移除
氧-乙醯基的保護[54]。
AcO
O OAc
AcO N O
Me
CSA
Scheme 15. Modified synthesis of silyl chitosan.
2-4-3 兩性幾丁聚醣
同時具有親水基/疏水基的兩性高分子材料是一直以來被商業與學術上所 注意，低分子量的雙性高分子通常用來當乳化劑平衡油水性的界面。
2-4-3-1 Palmitoyl glycol chitosan [55]
現在有人將兩性幾丁聚醣利用微胞這樣結構將疏水性藥物包覆在內，期 望能安定油性藥物的 hydrophobic interaction，以微球形式攜帶藥物進入人 體，達到藥物釋放控制[56]，特別是因含有疏水端的幾丁聚醣更易把油性藥 物攜帶通過磷脂層進入細胞中 Martina [57]等人也是利用 palmitoyl glycol chitosan 包覆油性藥物。
Scheme 16. Synthesis of palmitoyl glycol chitosan.
2-4-3-2 Carboxymethylation of acetyl chitosan
Acety chitosan即是將幾丁聚醣乙醯化成chitin，carboxymethyl chitin是水溶 性甲殼質衍生物，已成功應用來做藥物載體、攜帶免疫抗體、吸附鈣離子 [58-60]。Feng [61]等人發現alkali-frozen方式將chitin浸置50%NaOH溶液 -22℃下三天，可破壞chitin結晶使更能完全進入分子內部進行反應。
O NH2
O HO
CH2OH
acetyl anhydride MeOH
O
NH O HO
C O
CH3 CH2OH
O O
NHCOCH3 O HO
OCH2COOH
m m
(1) alkali-frozen (2) ClCH2COOH
m
Scheme 17. Carboxymethylated reaction of acetyl chitosan.
2-4-3-3 N-alkyl-O-sulfate chitosan
Zhang [ 62]等將這樣的兩性幾丁聚醣衍生物製備成約100~400 nm大小的 微胞，攜帶包覆疏水抗癌藥物紫杉醇。紫杉醇是由提煉出新型抗癌藥物，
因不溶於水應用上一直受限於其溶解性問題，目前還未能找到對人體無毒
害又是對紫杉醇的很好溶劑
O
NH2 HO
OH
O
CH3(CH2)6CHO O
HO N OH
O
CH(CH2)6CH3 Methanol
KBH4 O
HO HN OH
O
CH2(CH2)6CH3
DMF
Chlorsulhanic acid O
HO HN OSO3H
O
CH2(CH2)6CH3
Scheme 18. Synthesis of N-alkyl-O-sulfate chitosan.
2-4-3-4 N-lauryl-N-methylene phosphonic chitosan
Ramos, Rodrı´guez [63]將原本水溶性N-methylene phosphonic chitosan又接 枝上長鏈烷基以提供溶於有機溶劑，可做為乳化劑應用於醫藥及化妝品。
O
HO N OH
O
H3C(H2C)11 CH2PO3H2 O
NH2
HO OH
O
(1) H3PO4
(2) Formaldehyde water/methanol Lauryl aldehyde
Scheme 19. N-lauryl-N-methylene phosphonic chitosan.
2-5 水膠
2-5-1 水膠的定義
最早的水膠是由Wichterle 與Lim [64]於1960 年所提出的PHEMA
(poly( 2-hydroxyethyl methacrylate ))，由於其親水性與生物相容性，帶起日 後人們對於水膠生醫發展潛力的興趣。Lim和Sun [65]成功地將藻酸鈣 (Calcium Alginate)應用在cell encapsulation；Yannas [66] 等人將膠原蛋白與 鯊魚軟骨導入水膠中，作為治療燙傷的人工敷料。種種成功的案例促使人
們在開發新水膠方面的研究絡繹不絕，水膠種類也跟著日漸繁多，範圍橫 跨人工合成親水性高分子與天然物。
水膠是指親水性的單體或高分子經化學或物理鍵結後，產生交聯現象 (Crosslinking)進而形成3-D 網狀結構如Fig. 2-6所圖示，此類網狀結構高分 子置於水中，不會崩塌溶解，反而吸水膨脹至一平衡狀態[67，68]如Fig. 2-7 所圖示。
Fig.2-6 Crosslinked hydrogel.
Fig.2-7 Hydrogels are insoluble network of polymer chains that swell in aqueous solution.
分子間作用力以網狀般纏繞糾結在一起或第二引力作用如離子鍵、氫鍵 或疏水性鍵結的水膠，則稱為物理性或可逆性水膠。物理性水膠為非均一 相，是由不同分子纏繞糾結的clusters、疏水性連結或離子力鍵結區域則產
Polymer
NetworkÆhydrogel
Cross-linking
生的水膠內有不均勻相。Alginate(褐藻酸鹽)其交聯作用力是來自於本身羧 酸根與酸根鈣離子的靜電吸引力而成。
若是由交聯劑產生分子間共價鍵來維持網狀結構，則稱作化學性交聯所 形成的水膠為化學性水膠(Chemical hydrogel)，如：PNIPAAm 水膠，便是 以N,N’-methylenbisacrlamide (MBAAm)兩端的C=C 與NIPAAm 上C=C 反 應，在高分子鏈間形成共價鍵結。一般來說當吸水性高分子可吸水達原先 乾燥狀態時總重20%以上即可被稱為水膠(Hydrogel)，若吸水量可達乾重時 的20 倍以上，即可稱為超吸水性高分子[69]。
2-5-2 功能性水膠
水膠可以依外在環境的變化而可逆地改變本身的體積，根據不同物理與 化學刺激可分為溫度敏感性、酸鹼敏感性、電敏感性、光敏感性、葡萄糖 敏感性等。
溫度敏感性材料：
溫度敏感性材料都帶有一個疏水基，如：甲基、異丙基等，疏水基會與 材料中的親水基(或是氫鍵)競爭，當溫度較低時，水分子與高分子間有氫鍵 作用，高分子可在水中完全展開形成均勻溶夜，但當溫度高於LCST（lower critical solution temperature）以上時，分子間氫鍵變弱，疏水基在水中聚集，
使的高分子變成不溶於水中，產生渾濁不溶的現象，此類溫度敏感型分子
的LCST大多介於25~32℃，調整材料結構組成可以控制相轉移溫度與應答 速度，其原因為當低溫時水膠的親水鏈段與水分子間的氫鍵作用力較強，
所以能溶於水中，當溫度提升後水膠的疏水鏈段彼此間的作用力提高，而 與水分子間的氫鍵變弱降低溶解性，如Fig. 2-8所圖示。若增加其親水鏈長 會提高相轉移溫度，反之疏水基增多會降低；相較於原本無序排列吸水網 狀結構，具有巨孔(Macroporous structure)與梳狀結構 (Comb-like structure) 溫感型水膠能夠更迅速地對環境做出應答。
PS = polymer solution
P + S = two-phase region: polymer-rich, polymer-poor
溫度敏感型高分子如三團聯共聚合物poly-oxyethylene-polyoxy
propylene-polyoxyethylene (PEO-PPO-PEO, Pluronics®)；PEG- PLGAPEG為 兼具生物可分解性的溫感性材料；NIPAAm 為生物可相容性的溫感性材料 [70]。
Fig.2-8 溫度敏感型高分子(PNIPAAm)可逆式型態變化圖
酸鹼敏感性水膠：
酸鹼敏感性水膠是利用水膠周遭環境中pH值的變化來控制水膠體積變 化，此類材料上必帶有一酸基或是鹼基，可以接受或是放出質(H+)，如聚甲 基丙烯酸(Polymethacrylic acid, PMA )與聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG) 的接枝共聚合物，當共聚物處於低pH值環境時，PMA與PEG之間形成氫鍵，
使的水膠體積收縮，高pH值時，PMA上的質子放出形成離子化，造成分子 間氫鍵消失體積會變大[71]。
電致動高分子：
當高分子被施加一個電場於其上便產生形變彎曲，即可稱之為電致動高 分子(Electroactive polymer, EAP)，目前對於此類形變仍未有一個完整理 論，但普遍認為導致電致動高分子形變是來自於電場誘發的離子移動，更 具體的說，是溶液中離子移動令高分子兩側產生滲透壓差，此滲透壓差造 成高分子兩側膨潤程度不同，使高分子水膠本身產生彎曲現象(如圖2-3 所
Temperature increase
Temperature decrease
Expanded conformation Compact conformation
= H2O
示)。Kim [72]使聚丙二醇(Polypropylene glycol, PPG)與聚丙烯酸(Polyacrylic acid, PAA)形成電敏感性互穿式網狀結構高分子(Interpenetrating polymer network, IPN)，在0.6wt% NaCl(aq)時有最大彎曲角度與彎曲速度，此水膠有 發展類肌肉組織收縮結構、電控式藥物釋放的潛力。
光敏感性高分子：
光敏感性高分子顧名思義就是會對光產生應答的高分子，此類高分子經 過光照後轉換光能為機械能而產生形變，根據Irie [73] 的研究指出，帶有 leucocyanides 的棒狀聚丙醯胺水膠，經UV 光照射後會膨脹，若放置黑暗 處則會回復至原先尺寸，若照光時再施加電場於水膠上，水膠負極面會膨 脹的比正極面多，造成水膠雖然不移動，但是會彎向負極，照光所產生水 膠應答現象可由leucocyanides的光分解解釋，當leucocyanides 照光後會分解 出CN-，此舉會造成水膠內外滲透壓差異與高分子鏈間正電荷排斥，使已達 平衡水膠再度吸水，而且外加電場則會造成CN-移動，令CN-靠向正極，相 較於排斥力較小的水膠正極面，負極面由於高分子鏈上大量正電荷會彼此 排斥，故水膠負極面會澎潤程度較大，水膠進而彎向負極。
葡萄糖敏感性高分子：
葡萄糖敏感性高分子開發目的是在於控制胰島素在糖尿病患者體內釋放 的速度與劑量，以往胰島素注射不容易掌控到人體實際需要的劑量，容易
有過量的情形，導致患者血糖含量嚴重下降，所以如果能夠應用葡萄糖敏 感性分子到糖尿病療法上，控制胰島素的釋放，這樣對病人而言不僅省時 省 力 ， 也 可 減 少 治 療 的 風 險 ，Matsumoto [74] 等 人 令 帶 有 低 pKa {4-(1,6-dioxo-2,5-diaza-7-oxamyl)phenylboronic acid,DDOPBA} 與 NIPAAm 或N-isopropylmethacrylamide (NIPMAAm)行共聚合反應生成一具有葡萄糖 與pH敏感性高分子，DDOPBA可與葡萄糖上的雙醇官能基形成可逆的共價 鍵錯合物，當葡萄糖濃度上升，使帶有負電硼酸錯合物增多，此錯合物相 較於先前中性DDOPBA具有更高親水性，而且帶有負電高分子水膠亦會誘 發正離子流動造成滲透壓增加，使得水膠膨潤變大釋放胰島素，反之則萎 縮變小停止釋放藥物；單從LCST來看，葡萄糖存在會產生高親水性的硼酸 錯合物，使共聚物親水性較先前中性狀態時更高，LCST會隨親水性提升而 提升，故LCST會因為加入葡萄糖而昇高，以含有18.4 M硼酸根共聚物 PNIPM-D-18.4為例，在pH=7.4時，加入葡萄糖會使PNIPM-D-18.4的LCST 從22℃升到34℃。
2-5-3 水膠之應用
組織工程是一種結合細胞、基材、特定生長因子的新興醫學技術，這項 技術被認為能夠有效地解決器官來源短缺的問題，還能避免捐贈者與病患 間的免疫排斥問題，使眾多病人從病痛中解脫，最終將使人類壽命突破以
往的侷限。
基材是組織工程三要素之一，沒有基材輔助，細胞無論是在體內或體外 培養都只會分裂增生而不會形成所需的立體組織。而基材本身所具有的物 理性質(如：降解性、孔隙度、機械強度)及生物表現性質(細胞貼附性與生 物相容性)都會影響基材的適用與否。與基材適用性相關的決定要素中，以 生物相容性最為重要，持續引起發炎反應的基材既不適用於細胞培養，更 遑論後續組織的生成，合成高分子容易引起人體排斥，在使用上較天然高 分子受限；基材降解性必須配合所需組織生長速率，理想狀態下基材能夠 適時地分解產生孔洞，讓細胞逐漸進駐，待基材完全分解，即生成全新組 織取代患部；從機械強度方面來看，基材需維持一定的空間形狀供細胞增 生與組織發展，而且細胞貼附與基因表現也會跟基材的機械強度有關；細 胞貼附會影響到細胞增生、轉移與分化，而基材與細胞間的互動又與細胞 貼附息息相關，對於與細胞間互動性低的基材，可導入具生物活性分子，
增進基材與細胞間的互動。目前開發作組織工程細胞培養用的水膠種類很 多，主要可分作三類: (Ⅰ)人工合成高分子水膠(Ⅱ)天然高分子水膠(Ⅲ)人工 與天然高分子共聚物[67，75，76]。水膠擁有許多適用作組織工程基材的優 點:
(1) 高含水量：膨潤水膠內部的含水通道可供養分、廢物及特定分子傳輸。
(2) 水溶液環境：與生物組織環境相仿，有利於細胞、DNA、蛋白質及藥物
保存。
(3) 生物相容性佳：人體排斥反應低，不易發炎。
(4) 易於化學改質：可接上特定細胞活性分子(如：RGD-peptide.)增進基材 適用性。
(5) Minimally invasive application：將溶液狀水膠注入患部，再經離子、溫 度及光等刺激，即可在體內形成固態水膠，不需繁瑣的外科手術。水 膠的技術從Whichterle 到現在累積了許多經驗與技術，可是水膠仍存在 一些有待改進的缺點，如：機械強度弱不易使用、不易消毒滅菌，這 些缺點將會是未來努力的重點。
第三章 實驗方法
3-1 藥品
1. 幾丁聚醣(chitosan) MW=21 萬，去乙醯度=91.3%，誠麗實業股份有限 公司。
2. 異丙醇(isopropanol) CH3CH2OHCH3，FW=61，ACS grade，TEDIA。
3. 氫氧化鈉(sodium hydroxide) NaOH，FW=40， SHOWA。
4. 氯乙酸(chloroacetic acid) ClCH2COOH，FW=94.5，J.T Baker。
5. 甲醇(methanol) CH3OH, FW=32，ACS grade，TEDIA。
6. 乙酸酐(acetic anhydride) (CH3CO)2O，FW=102.09，100% purity，
ACROS。
7. 己 酸 酐 (hexanoic anhydride) (CH3(CH2)4CO)2O, FW=214.31, 99%
purity，ACROS。
8. 乙酸(acetic acid) CH3COOH，FW=60，99.9% purity，
Riedel-deHaën。
9. 乙醇(ethanol) CH3CH2OH，FW=46，ACS grade，TEDIA。
10. 氯仿(chloroform) CHCl3，FW=119.5，ACS grade，TEDIA。
11. 吡啶(pyridine) C5H5N, FW=79.1，anhydrous，TEDIA。
12. 五氧化二磷(phosphorus pentoxide) P2O5，FW=141.94，ACS reagent ，
98.0% purity，powder，Aldrich。
13. 氫化鈣(calcium hydride) CaH2，FW=42.09，powder，99.99% purity，
Aldrich。
14. 己醯氯(hexanoyl chloride) CH3(CH2)4COCl，FW=134，97% purity，
Aldrich。
15. 二氯甲烷(dichloromethane) CH2Cl2，FW=97，ACS grade，
Riedel-de Haën。
16 氫氯酸(hydrochloric acid) HCl，FW=36.46，37% aqueous，
Riedel-de Haën。
17. 甲磺酸(methanesulfonic acid) CH3SO3H，FW=96.11，98% purity，
Lancaster。
18. 碳酸氫鈉(sodium hydrogencarbonate) NaHCO3，FW=84.01， Aldrich。
19. 透析膜(dialysis tubing cellulose membrane) avg. flat width 33 mm (1.3 in.)，Retains>90% of cytochrome C (M.W. 12,400) in solution over a 10-hour period，Sigma。
20. 硫酸胺(ammonium sulfate) (NH4)2SO4，FW=132.14，SHOWA。
21. silica gel 230~400mesh。
22. Buffer solution pH7，TEDIA。
23. Buffer solution pH10，Riedel-de Haën。
24. Deuterium oxide 99.9%D D2O，Aldrich。
25. Chloroform-D 99.8%D CDCl3，Aldrich。
26. Trifluoroacetic acid-D CF3COOD，Aldrich。
27. 碳酸鉀(potassium carbonate) K2CO3，FW= 138.21，ACS, Scharlau。
28. 氯化銅(copper(II) chloride) CuCl2，FW=134.45，SHOWA。
29. Genipin，FW=226，嘉年生化科技。
30. Buffer solution pH4，Riedel-de Haën。
40. Buffer solution pH1，TEDIA。
41. Buffer solution pH6，Riedel-de Haën
42. Albumin bovine serum(BSA) 98% purity，Sigma。
43. Palmitic anhydride (CH3(CH2)14CO)2O，FW=494.83，TCI。
3-2 儀器設備
1. 紫外-可見光光譜儀(UV-Vis):Metertech UV/Vis SP8001
2. 傅 立 葉 紅 外 光 譜 儀 (FTIR): Nicolet PROTE’GE’TM 460 MAGNA TECHNOLOGY
3. 全反射傅立葉紅外光譜儀(FTIR-ATR): 加拿大Bomem, DA8.3
4. 高 磁 場 核 磁 共 振 光 譜 儀 (NMR): VARIAN UNITYINOVA 500 NMR SPECTROMETER ;
VARIAN UNITYINOVA 300 NMR SPECTROMETER
5. 熱重分析儀器(TGA): TA Instrument TGA Q500
6. 示差掃描熱卡分析儀(DSC): Perkin Elmer Diamond DSC 7. 微拉力機(MTS): MTS TytronTM 250
8. 場發射掃描式電子顯微鏡(FESEM): JSM-6500F
9. 恆溫震盪培養箱: YIH DER TU-400 orbital shaker incubator 10. 低溫培養烘箱: YEONG SHIN DB45
11. 細胞超音波碎質機: Cole-Parmer 500-Watt Ultrasonic processors 12. 數字式厚薄計: Mitutoyo 543-128F5
13. 數字式溫溼度計: Matsutek HTM-120CK 14. 數字式游標尺: Mitutoyo 500-171
15. 偏光顯微鏡:OLYMPUS
3-3 改質幾丁聚醣
3-3-1 親水性幾丁聚醣合成
◆ Synthesis of N,O-carboxymethyl chitosan (NOCC)
(a)
1. 在 250 ml 單頸圓底瓶中放入 5g chitosan，加入 50 ml 異丙醇攪拌 30 min，
呈懸浮溶液。
2. 加入 12.5 ml 的 10 N NaOH(aq)，要分成五等份一次 2.5 ml 每隔五分鐘分 別加入反應瓶中。
3. 固定氫氧化鈉濃度下加入不同當量濃度氯乙酸:
而後攪拌三十分鐘後，再將 25 g(或 7 g)氯乙酸分五等份在五分鐘之內倒 入瓶中。
4. 油浴加熱至 60℃。
5. 4 小時後待冷卻以抽氣過濾方式收集產物，以水/甲醇(體積比 1:9)把產物 邊過濾邊洗淨。
6. 在 65℃烘箱乾燥 24 小時，產物成淡白色粉末，可溶於水。
7. 與 7 g 氯乙酸反應得到的產物為 NOCC-1。
O
NH2 O
HO CH2OH
O O
HO
HOH2C
NHCOCH3
m (1) NaOH(aq) (2) ClCH2COOH chitosan
O
NHCH2COOH O
HO OH
O O O
HO
NHCOCH3
OH
O
NH2 O
HO
OCH2COOH
m NOCC
(b)
1. NOCC 的合成步驟已在論文[77,78]有詳細說明。在 250 ml 單頸圓底瓶中 放入 5g chitosan(白色粉末)，加入 50 ml 異丙醇攪拌 30 min，呈懸浮溶液。
2. 兩種氫氧化鈉濃度的變數被加入:
加入12.5 ml 的不同濃度的10 N(或13.3 N) NaOH(aq)，要分成五等份一次 2.5 ml每隔五分鐘分別加入反應瓶中。整個過程是非均相反應，幾丁聚醣 因氫氧化鈉的加入變得有點膨潤糊狀，會讓更易進入分子內部反應，同 時拔去-OH、-NH2上的H來加速反應。Xi-Guang Chen, Hyun-Jin Park [79]
提到當氫氧化鈉和異丙醇的體積比1:4時可達最高的產率。
3. 而後攪拌三十分鐘後，再將 25 g 氯乙酸分五等份在五分鐘之內加入。
4. 油浴加熱至 60℃。
5. 4 小時後待冷卻以抽氣過濾方式收集產物，以水/甲醇(體積比 1:9)把產物 邊過濾邊洗淨。
6. 在 65℃烘箱乾燥 24 小時，產物成淡黃色粉末，可溶於水。
7. 低羧甲基酸接枝率的命名為 NOCC-2；高羧甲基酸接枝率的命名為 NOCC-3。
3-3-2 油性幾丁聚醣合成
◆ Synthesis of N,O-hexanoyl chitosan
O
NH2 O HO
CH2OH
O O
HO
HOH2C
NHCOCH3
m
1. 實驗步驟根據Zong等人在2000年發表論文中提及acylated chitosan做法 [80]。pyridine及chloroform事先分別添加以CaH2、P2O5完全攪拌除水一 天，再將溶劑通氮氣下蒸餾冷凝出來密封放在乾燥箱保存。
2. 取一個 500 ml 三頸圓底瓶內置一磁石，秤取 3.2g chitosan 放入瓶中，在 氮氣下抽取 45ml pyridine 注入瓶後浸置一星期。
3. 一星期後將上述 2.的反應瓶以玻璃針筒注入 90 ml chloroform，攪拌一 天。整個實驗過程都要在氮氣下，水氣存在會讓實驗失敗。
O
N O
O C O
C C O O
CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3
CH3 OC
CH2CH2CH2CH2CH3 O
CH3(CH2)4COCl
m pyridine/chloroform
120O C , reflux 12 h
full NOHC 10 equiv.
O
NH2 O HO
CH2OH
O O
HO
HOH2C
NHCOCH3
m
pyridine 2 equiv.
hexanoyl chloride O
NHCR O
HO
OC (CH2)4CH3 O
O
O O
O NHCR
O O
(CH2)4CH3 C O
(CH2)4CH3
C O
m
partial NOHC
4. 在冰鹽浴下約-10~-22℃下以很慢速率慢慢滴入不同當量濃度 hexanoyl chloride (97% purity, 約 30 ml, 10 equiv.；約 6.6 ml, 2.2 equiv.)，需時約三 十分鐘。此時會大量放熱冒煙要很小心，整個溶液會因hexanoyl chloride 添加量逐漸增加而逐漸由橘色變深褐色。等白煙不在出現就可移除冰浴。
5. 室溫下攪拌二小時。
6. 然後氮氣下油浴加熱迴流至 115℃穩定反應 8 小時。
7. 等溫度冷卻後冰浴下在反應溶液中加入大量 300ml 冰甲醇，會有黃色產 物析出。
8. 抽氣過濾收集產物，以甲醇洗淨。再將產物以二氯甲烷溶解，又加入大 量甲醇析出產物，再次過濾洗淨，期望去除雜質。
9. 而後產物又以索氏脂肪連續萃取器連續以甲醇洗淨一天。
10. 產物在 70℃烘箱中烘乾。
11. 如此又再從步驟 1.按步操作，重複 3~4 次直到產物能完全溶解於 chloroform，產物呈黃色，命名為 full NOHC；但添加 2.2 當量濃度 hexanoyl chloride 的反應只需做一次 cycle，命名為 partial NOHC。
◆ Synthesis of O-hexanoyl chitosan (OHC) [81]
O O
HO HOH2C
NHCOCH3
CH3SO3H O
NH2 O HO
CH2OH
O HO
O +NH3 CH2OH
O O
HO HOH2C
NHCOCH3
-SO3CH3
(1) (CH3(CH2)4CO)2O
m m
(2) NaHCO3
10 equiv. O
O
NH2 O HO
C CH2CH2CH2CH2CH3 O
O
O
O HO
NCHOCH3
C CH2CH2CH2CH2CH3 O
OHC
m
1. 取2 g chitosan置入250 ml反應器中，滴入40 ml甲磺酸，室溫下均勻攪拌 至呈現黃褐色均勻相，約一小時。再滴入28.64 ml hexanoyl anhydride(98%
purity, 10 equiv.)，在60℃下反應六小時。
2. 反應時間結束後，加入約50克的冰塊終止反應。將反應物在流動水中透 析三天，移除己醯酸及甲磺酸。
3. 然後使用濃度為1N的氫氧化鈉水溶液進行中和，利用變色範圍為 pH=1~14的石蕊試紙來進行測定，將反應物滴定至pH=7的終點。
中和完畢之後，過濾出沈澱物，再將沈澱物置入二次水中透析一天天以 移除殘留酸及離子。
4. 過濾出產物放入烘箱乾燥至少二天，再取出保存於乾燥箱中。
◆ Synthesis of N-hexanoyl chitosan (NHC)
1. 根據[82]中所描述，取 3 g chitosan 溶於 150 ml 1%醋酸水溶液，加入 150 ml 甲醇混合均勻。
2. 加入 5.6 ml hexanoyl anhydride(98% purity, 1.3 equive.)，攪拌一陣子即變 成不透明 gel 果凍狀，這是因溶解度變差關係。加熱至 40℃反應 4 小時。
3. 以氫氧化鈉水溶液中和後，又以乙醇萃取出過量未反應的 hexanoyl anhydride。再以純水透析三天。
4. 抽氣過濾產物，以乙醇洗淨後，在 70℃烘箱乾燥。
5. 所得產物 NHC 材料堅硬。
O NH2
O HO
CH2OH
hexanoic anhydride MeOH
O
NH O HO
C O
CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH2OH
m
m 1.6 equiv.
NHC
3-3-3 兩性幾丁聚醣合成
◆ Synthesis of Hexanotlated NOCC (HNOCC)
1. 分別取 2 g 兩種不同羧甲酸基接枝率的 NOCC 於 150 ml 反應瓶， 內 置一磁石，添加 50 ml 純水完全攪拌溶解一天。
2. 加入 50 ml 甲醇混合均勻後，再加入不同當量濃度的 hexanoyl anhydride (99% purity, 約 0.7 ml, 0.3 eqive. ; 約 1.4 ml, 0.5 eqive.)，在不同反應時間 條件的控制上，分別為六小時與十二小時。
3. Hexanoyl anhydride 雖會與所使用的溶劑水、醇類反應，但與幾丁聚醣上 的胺基反應速率較快。
4. 而後反應溶液以透析袋收集，對純水和乙醇混合液(1:4)透析一天去除酸 及離子，再以純乙醇透析一天。
5. 產物可完全溶於純水溶液及水/乙醇(2:3, v:v)混合溶液。
O
NHCH2COOH O
HO OH
O O O
HO
NHCOCH3
OH
*
O
NH2 O
HO
OCH2COOH
NOCC
m
O NH
O HO
C CH2COOH O
O CH2 CH2 CH2 CH2 CH3
O O
HO NHCOCH3
OH
O O
CH2COOH O NH2 HO
O O
HO NHCH2COOH
OH
CH3 O NH
O HO
OH
C O
CH2 CH2 CH2 CH2
m
HNOCC
hexanoic anhydride MeOH
3-4 代號命名及膜的製備 代號命名
對不同羧甲基酸接枝量和己醯基接枝率的幾丁聚醣衍生物簡化名稱，之 後將以代號命名代表不同種的幾丁聚醣衍生物。
N- O- N- O- FW.
Table 1. Degree of the substitutions of carboxymethyl groups and hexanoyl groups on nitrogen and oxygen.
Chitosan 0 0 0 0 165.654 NOCC-1 0.070 0 0 0 169.644 NOCC-2 0.157 0.159 0 0 183.894 HNOCC-2A 0.157 0.159 0.259 0 209.374 HNOCC-2B 0.157 0.159 0.441 0 227.014 NOCC-3 0.246 0.251 0 0 194.154 HNOCC-3A 0.246 0.251 0.232 0 216.658 HNOCC-3B 0.246 0.251 0.445 0 237.319 Full NOHC 0 0 2 2 541.879 Partial NOHC 0 0 0.896 0.773 358.654 NHC 0 0 0.861 0 240.344 OHC 0 0 0 0.920 253.894
DS DH
膜的製備
(A) 未交聯過薄膜
將 chitosan 溶於 0.5% (v/v)乙酸水溶液以配置成 1.3% (w/v)的幾丁聚醣溶 液，取約 18.27 g 的上述幾丁聚醣溶液倒入直徑 9 cm 塑膠培養皿，在通風 處靜置一天後換置到 50℃烘箱中直達乾燥成膜，自皿中輕輕取下成膜的試 樣以備之後量測材料性質使用；而其他化學改質而成的衍生物也同樣配置 成 1.3% (w/v)水溶液，並在直徑 9 cm 塑膠培養皿乾燥成膜，可得具強度的
黃色半透明薄膜，膜厚約 0.076 mm。
(B) 水膠
將 chitosan 溶於 0.5% (v/v)乙酸水溶液以配置成 1.3% (w/v)的幾丁聚醣溶 液，取約 2.763 g 的上述幾丁聚醣溶液，接著與 1% (w/v) genipin 水溶液混 合使(chitosan 單體 mole : genipin mole=1 : 300)，之後倒入直徑 3.5 cm 塑膠 培養皿並密封緊閉，放進50℃烘箱中進行交聯反應二天，再在 50℃烘箱中 乾燥成膜，自皿中輕輕取下成膜的試樣以備之後量測膨潤度使用；而其他 化學改質而成的衍生物也同樣配置成 1.3% (w/v)水溶液，並在直徑 3.5 cm 塑膠培養皿交聯成膜，可得具強度的淡藍色半透明薄膜，膜厚約 0.076 mm，
保存於乾燥箱。
3-5 攜藥水膠的製備 3-5-1 膨潤度測試
欲了解不同水膠在不同酸鹼環境下膨潤度的差異及變化。
膨潤度測試
把將上述 3-4 小節製備所得之不同種交聯過水膠置放進不同 pH 值的緩衝 溶液(pH=1、pH=4、pH=6、pH=7、pH=10)，經歷平衡一天後將水膠拿出，
以吸水紙吸去水交表面多餘的水，精確量秤水膠溼重。
3-5-2 Ibuprofen 釋放實驗
欲了解不同水膠包覆油性藥物 ibuprofen 後，在 PBS 緩衝液(pH=7)的生理 環境下 ibuprofen 釋放情形。
(A) 製備水膠
將化學改質而成的衍生物配置成 1.3% (w/v)水溶液，加入預先準備 ibuprofen 水溶液，使 ibuprofen 在總溶液中濃度達 1.2 mg/ml 並加熱至 60℃
攪拌，以期 ibuprofen 完全溶解，文獻上 ibuprofen 在 pH=1.4 下的飽和濃度 為0.036 mg/ml，pH=7.4 下的飽和濃度為 6.14 mg/ml。接著與 1% (w/v) genipin 水溶液混合使(chitosan 單體 mole : genipin mole=1 : 114)，之後倒入直徑 3.5 cm 塑膠培養皿並密封緊閉，放進 50℃烘箱中進行交聯反應二天，再在 50℃
烘箱中乾燥成膜，自皿中輕輕取下成膜的試樣置入，保存於乾燥箱。
(B) Ibuprofen 釋放實驗
把將上述製備所得之不同種包覆 ibuprofen 的水膠置放進 20 ml PBS 緩衝 液，固定時間間隔抽取釋放溶液，以UV/Vis 光譜儀量測波長在 264.4 nm 之 吸收值，再代入 ibuprofen 檢量線進而算出 ibuprofen 的釋放量。
Ibuprofen 蛋白質檢量線:
(1) 首先配製 ibuprofen 的 PBS 溶液之標準溶液 1.2 mg/ml，依數列稀釋方式 ibuprofen 溶液濃度為 0.6 mg/ml、0.3 mg/ml、0.15 mg/ml、0.075µg/ml。
(2) 分別取上述不同 ibuprofen 濃度的標準溶液利用 UV/Vis 光譜儀量測波長 在 264.4 nm 之吸收值(以 PBS 為 blank)
(3) 將 UV 吸收值對 ibuprofen 溶液濃度做圖可得檢量線。
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0 5 0 5 0
mg/ml Ibuprofen standard calibration curve Y=0.03851+1.67047X
R=0.99953
Fig.3-1 Ibuprofen standard calibration curve.
3-6 材料分析 3-6-1 基本性質分析
3-6-1-1 傅立葉紅外光譜(FTIR)
紅外線吸收光譜是種常見來鑑定各種有機或無機分子結構的方法，主要 原理是不同型態的分子鍵結中，會造成不同的振動頻率，而產生特定頻率 的紅外光吸收，可判斷樣品中具有哪些特殊的官能基。
目的:
以FTIR光譜鑑定分析合成出的幾丁聚醣衍生物之化學結構，及從中探討 分析其氫鍵效應與計算己醯基接枝率。
方法:
將在烘箱乾燥一天過後試樣粉末與KBr混合研磨10分鐘以上，之後以直徑 一公分的模具壓成厚度均勻半透光的鹽片。但某些樣品因不是粉狀亦不易 研磨，必須將樣品溶液滴在事先壓好的純KBr鹽片上，再經完全乾燥後才能 量測穿透式FTIR。以純KBr鹽片做背景值，掃瞄次數48次，解析度4 ㎝-1。 掃描的波長範圍從400~ 4000 cm-1。
3-6-1-2 減弱全反射-傅立葉轉換紅外光譜儀（FTIR-ATR）
一般是用在少量的薄膜、液態、氣態樣品或IR光無法穿透之樣品的定性 分析。ATR的樣品測量的好處，主要來自於樣品測量的路徑較短或IR光進入 樣品的滲透深度較小，如此才可控制IR的吸收值在適當的範圍，分析材料 表面分子結構之振動行為。
目的:
幾丁聚醣衍生物所製作的薄膜雖呈淡黃半透明，但以一般FTIR做分析時 大部分的紅外線皆被薄膜所吸收，造成吸收光強度超過偵測範圍，不易分 別出薄膜中官能基變化的狀況。
方法:
將製備好的薄膜裁成大小約4 cm × 0.5 cm，掃瞄次數200次，解析度2 ㎝
-1。掃描的波長範圍從400~4000 cm-1。
3-6-1-3 高磁場核磁共振光譜(NMR)
核磁共振光譜對於鑑定有機化合物的結構是相當有用的工具，可解析出 不同化學環境的氫原子構。除了鑑定氫核外，會產生核自旋的13C、15N、19F、
31P 等元素也可藉由核磁共振光譜檢測出來，利用光譜中的化學位、主峰面
積、自旋-自旋分裂(spin-spin spliting)、偶合常數(coupling constant)等，可用 來鑑定有機化合物的結構、或做定量分析及化學動力學的研究。
目的:
利用高磁場核磁共振儀得到H1-NMR光譜，以鑑定分析幾丁聚醣衍生物化 學結構，同時獲得特徵訊號之積分面積來計算羧甲基酸接枝量與己醯基接 枝率。
3-6-1-4 熱重分析(TGA)
熱重力分析儀即是用來觀察試樣在不同溫度條件下，重量損失變化情 況，所得數據可用來判斷高分子的裂解溫度、裂解速率、脫水量以及不同 成分的差異。
目的:
量測幾丁聚醣衍生物的熱重損失，以判斷改質後產物的熱裂解溫度及熱
穩定性。
方法:
以 TGA 專用的白金坩鍋做重量歸零後，試樣置入白金坩鍋約 7 mg~18 mg，平衡氮氣流量 40.0 ml/min；樣品氮氣流量 60.0 ml/min；升溫範圍 36 ~900℃ ℃；升溫速率 10 /min℃ 。
3-6-1-5 微拉力機(MTS)
Tytron微拉力試驗機是MTS 公司專為測試微小位移與微小力量所開發之 材料試驗機，由線性馬達驅動，可做靜態之拉伸或壓縮，也可進行動態之 疲勞實驗。
目的:
利用微拉力儀對薄膜帶進行微拉力測試，以正向拉伸方式測試材料的強 度，可得薄膜帶拉力與位移量的關係，藉此可以計算出應力與應變的關係。
方法:
將膜裁成3 mm×0.07 mm×40 mm的長條狀，長條膜的兩端以快乾膠黏上一小 塊砂紙，在將膜兩端固定好在MTS夾具上，砂紙可讓膜確實固定夾好於夾 具中，拉伸速率為30 mm/50 min。
3-6-2 含水材料分析
3-6-2-1 示差掃描熱卡分析(DSC)
