培養Cunningghamella echinulata和Bacillus cereus DYU-Too 12生產多元不飽和脂肪酸 邱怡翠、吳淑姿
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摘 要
本研究探討Cunninghamella echinulata與Bacillus cereus DYU-Too 12生合成多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)之最適化條件。先以一次一因子方式(one-factor-at-a-time)進行搖瓶培養，探討不同培養基組成，包括碳源、氮源、
碳源濃度、氮源濃度及不同培養條件(溫度和pH值) 對Cunninghamella echinulata與Bacillus cereus DYU-Too 12的菌體生長、
脂質累積及γ-次亞麻油酸(GLA)和二十碳五烯酸(EPA)生合成的影響，並利用實驗設計法進行中心混成之實驗(central composite design, CCD)。 經一次一因子實驗後得知，Cunninghamella echinulata搖瓶培養於25℃、100 rpm及pH 7.0下，以 葡萄糖35 g/L和氯化銨1 g/L為基礎培養基之主要營養源組成，可得較佳的生質重7.05 g/L、脂質重1.39 g/L及GLA產 量602.48 mg/L；Bacillus cereus DYU-Too 12搖瓶培養於30℃、100 rpm及pH 7.0下，以葡萄糖20 g/L和氯化銨1 g/L為基礎 培養基之主要營養源組成，可得較佳的生質重2.65 g/L、脂質重0.12 g/L及EPA產量35.45 mg/L。實驗為三因子以二水準之 中心混成設計，不同濃度氯化銨(0.5、1.0、1.5 g/L)和不同pH值(5、6、7)，在C. echinulata部分以35 g/L葡萄糖為中心點，
而Bacillus cereus DYU-Too 12以20 g/L葡萄糖為中心點並配合中心混成設計之補充實驗，計16組處理組合(8組因子試驗、6 組星點及2組中心點)，以隨機編排順序進行實驗，經中心混成實驗之結果，以統計軟體STATISTICA進行分析，C.
echinulata生合成GLA的最適條件為葡萄糖33.82 g/L、氯化銨1.04 g/L及pH 6.02，以最適化條件進行培養，生質量7.45 g/L
，而GLA產量為937.32 mg/L，產量達預測值的96%；Bacillus cereus DYU-Too 12生合成EPA的最適條件為葡萄糖19.00 g/L
、氯化銨0.91 g/L及pH 6.20，以最適化條件進行培養，生質量2.34 g/L，EPA產量為29.47 mg/L，達預測值的96.21%。
關鍵詞 : Cunninghamella echinulata ; Bacillus cereus DYU-Too 12 ; γ-次亞麻油酸 ; 二十碳五烯酸 ; 中心混成實驗 目錄
目 錄 封面內頁 簽名頁 授權書………...………iii 中文摘要………
……….iv 英文摘要………...vi 誌謝………
……….viii 目錄……….ix 圖目錄………
………....xii 表目錄………xv 第一章 緒 論………1 第二章 文獻回顧………3 2.1多 元不飽和脂肪酸………3 2.1.1多元不飽和脂肪酸簡介………3 2.1.2多元不飽和脂肪 酸之生合成途徑………6 2.1.3多元不飽和脂肪酸生理功能及臨床應用……9 2.2 γ-次亞麻油酸生產菌的研究…………
…………15 2.3 二十碳五烯酸生產菌的研究………19 2.4 影響微生物生合成多元不飽和脂肪酸的因子…….19 2.4.1培養基的組成……….19 2.4.2培養溫度……….21 2.4.3 起始pH值…
………..………...…21 2.4.4鹽濃度………...22 2.4.5培養時間及菌株年齡………...
…………22 2.5能生合成多元不飽和脂肪酸菌株之篩選…………..24 2.6實驗設計………..………...……….27 2.6.1一次一因子探討………...…28 2.6.2中心混成實驗………...………28 第三章 材料與方法
………31 3.1 實驗儀器………..………31 3.2 實驗藥品………
…...………32 3.3 培養基……….33 3.3.1菌株活化培養基………
…...………33 3.3.2基礎培養基組成………...……33 3.3.3篩菌培養基組成………...…33 3.4 實 驗流程………...37 3.5 實驗菌株………..………….37 3.5.1Cunninghamella echinulata………….…….…..37 3.5.2自行篩選菌株………..………...40 3.6菌體顯微鏡觀察………
…………....42 3.6.1 Cunninghamella echinulata………..…42 3.6.2 Bacillus cereus DYU-Too 12……….42 3.7 一 次一因子條件探討……….45 3.7.1碳源………...46 3.7.2氮源………
………...…….…...46 3.7.3葡萄糖濃度………..….46 3.7.4氯化銨濃度………
……...47 3.7.5 pH值……….………47 3.7.6溫度………...……47 3.7.7中心混 成實驗設計………...…47 3.8分析方法……….…...…50 3.8.1分析樣品處理流程圖…
………...…50 3.8.2生質量之測定………...………50 3.8.3脂質萃取………...………
…53 3.8.4脂肪酸甲酯之製備………...……53 3.8.5脂肪酸鑑定方法………...………54 3.8.6碳源測定…
………...………54 3.8.7氮源測定………...……56 第四章 材料與方法………
……..………58 4.1γ-次亞麻油酸之生產………58 4.1.1Cunninghamella echinulata顯微鏡觀
察…….…58 4.1.2Cunninghamella echinulata一次一因子 條件探討……….……...58 4.1.2.1碳源…………
……….….58 4.1.2.2氮源………....61 4.1.2.3葡萄糖濃度………61 4.1.2.4氯化銨濃度………64 4.1.2.5 pH值………...64 4.1.2.6溫度………
……...……..67 4.1.3 Cunninghamella echinulata中心混成實 驗設計………67 4.1.4
Cunninghamella echinulata 發酵槽擴大培養..79 4.2二十碳五烯酸之生產………80 4.2.1Bacillus cereus DYU-Too 12顯微鏡之觀察….80 4.2.2菌體脂肪酸分析………...………....83 4.2.3Bacillus cereus DYU-Too 12一次一 因子 條件探討………..………..83 4.2.3.1碳源………....83 4.2.3.2氮源………
………....87 4.2.3.3葡萄糖濃度………87 4.2.3.4氯化銨濃度………..90 4.2.3.5 pH值………..……….90 4.2.3.6溫度………93 4.2.4 Bacillus cereus DYU-Too 12中心 混成實 驗設計………93 第五章 結論與未來展望………106 5.1 結論………106 5.2未來展望………107 參考文獻……
………109 圖目錄 圖2.1 微生物體內多元不飽和脂肪酸之生合成途徑及結構………5 圖2.2 脂質之生合成途徑………...………...………..7 圖2.3 酵母或黴菌於批次培養下生質量與脂肪累積的情形
……..23 圖2.4 實驗設計之概念圖(中心混成設計) ………..….29 圖3.1 實驗流程圖………
…………..……38 圖3.2 篩菌流程圖………...41 圖3.3 Neubauer計數器………
………...………43 圖3.4 蘇丹黑B染色步驟………...44 圖3.5 樣品分析流程圖………
………...52 圖3.6 脂肪酸甲酯化流程圖………..55 圖4.1 於位相差顯微 鏡下(1,000x)觀察之 Cunninghamella echinulata孢子……….59 圖4.2 碳源對Cunninghamella echinulata生產 γ-次亞麻油酸之影響……….60 圖4.3 氮源對Cunninghamella echinulata生產 γ-次亞麻油酸之影 響……….62 圖4.4 葡萄糖濃度對Cunninghamella echinulata生產 γ-次亞麻油酸之影響…………
……….63 圖4.5 氯化銨濃度對Cunninghamella echinulata生產 γ-次亞麻油酸之影響………
……….65 圖4.6 起始pH值對Cunninghamella echinulata生產 γ-次亞麻油酸之影響………
….66 圖4.7 培養溫度對Cunninghamella echinulata生產 γ-次亞麻油酸之影響……….68 圖4.8 培 養條件對GLA產量影響之回應曲面與等高線圖…….. 72 圖4.9發酵槽擴大培養Cunninghamella echinulata生合成 γ-次亞麻油 酸……….…81 圖4.10 光學顯微鏡下觀察之Bacillus cereus DYU-Too 12 內生孢子…………
………..………82 圖4.11 Bacillus cereus DYU-Too 12位相差顯微鏡圖………..84 圖4.12Bacillus cereus DYU-Too 脂肪酸甲酯之氣相層析圖……..85 圖4.13碳源對Bacillus cereus DYU-Too 12生產EPA的影響……86 圖4.14氮 源對Bacillus cereus DYU-Too 12生產EPA的影響……88 圖4.15葡萄糖濃度對Bacillus cereus DYU-Too 12 生產EPA的影響……
………..………….89 圖4.16氯化銨濃度對Bacillus cereus DYU-Too 12 生產EPA的影響………
………..……….…91 圖4.17起始pH值對Bacillus cereus DYU-Too 12 生產EPA的影響………..…………
92 圖4.18溫度培養對Bacillus cereus DYU-Too 12 生產EPA的影響………..………… 94 圖4.19 培養條件 對EPA產量影響之回應曲面與等高線圖……...97 表目錄 表2.1 多元不飽和脂肪酸……….…...4 表2.2 生理調節物質之功用……….….12 表2.3 美國人的膳食導引之脂肪酸建議攝取量……….
…...14 表2.4 微生物生合成γ-次亞麻油酸………..…...17 表2.5 多元不飽和脂肪酸目前與替代來源……….
……….25 表2.6 DHA的來源………..……….…….…...26 表3.1 PDA培養基組成………
……….…...34 表3.2 無機鹽液組成……….………...34 表3.3 微量金屬溶液組成……
……….…...35 表3.4 維生素溶液組成……….….…....35 表3.5 篩菌培養基組 成……….……….…....36 表3.6 Cunninghamella echinulata之生物學分類……….…….39 表3.7 23因 子設計控制因子與水準………...………48 表3.8 中心混成設計補充實驗之控因………...…...49 表3.9 中心混成實驗設計表………...…...51 表4.1 碳源對生質量、脂質及GLA生成量之影響……….…
…...60 表4.2 氮源對生質量、脂質及GLA生成量之影響………62 表4.3 葡萄糖濃度對生質量、脂質及GLA生成量之 影響………63 表4.4 氯化銨濃度對生質量、脂質及GLA生成量之影響………65 表4.5 起始pH值對生質量、脂質及GLA生成 量之影響……….66 表4.6 培養溫度對生質量、脂質及GLA生成量之影響…………68 表4.7 GLA中心混成設計之實驗與結果
……..……….…...70 表4.8 Cunninghamella echinulata生質量、脂質及 GLA生成量之中心混成設計………
………….71 表4.9 GLA之正則分析結果………...…74 表4.10 誤差變異數分析表…………..…………
………...75 表4.11 純誤差之變異數分析表……….…76 表4.12中心混成設計GLA生合成量之 變異數分析………...77 表4.13 GLA生合成量二階模式之統計迴歸分析結果………78 表4.14 碳源對生質量、脂質 及EPA生成量之影響…….……...86 表4.15 氮源對生質量、脂質及EPA生成量之影響…….………..88 表4.16 葡萄糖濃度對 生質量、脂質及EPA生成量之影響……...89 表4.17 氯化銨濃度對生質量、脂質及EPA生成量之影響……...91 表4.18 起始pH 值對生質量、脂質及EPA生成量之影響………92 表4.19 培養溫度對生質量、脂質及EPA生成量之影響………...94 表4.20 EPA中心混成設計之實驗與結果………..………….……..95 表4.21 Bacillus cereus DYU-Too 12生質量、脂質及 EPA生成量之 中心混成設計………..96 表4.22 EPA之正則分析結果………...100 表4.23 EPA 誤差變異數分析表……….…..101 表4.24 EPA純誤差之變異數分析表………...102
表4.25中心混成設計EPA生合成量之變異數分析…………..…103 表4.26 EPA生合成量二階模式之統計迴歸分析結果………
…...104 參考文獻
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