第一節 實驗材料

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第三章 實驗材料及方法

第一節 實驗材料

1.藥材

本實驗所使用之中藥材係購自台中欣隆藥材行,經本所陳忠川所長 鑑定中藥材之基原採用如下:

黃連 Coptis chinensis

Wallich

(Rannuculcaceae)的乾燥根莖 黃芩 Scutellaria baicalensis

George

(Labiatae)的乾燥根 黃柏 Phellodendron amurense

Rupr

(Rutaceae)的乾燥樹皮 梔子 Gardenia jasminoides

Ellis

(Rubiaceae)的乾燥成熟果實

2.藥品及試劑

小蘗鹼(Berberine Chloride) 美國 Sigma Chemical Co.

黃芩 (Baicalin Hydrate) Aldrich Chemical Co.

梔子 (Geniposide) 日本 米山藥品工業株式會社 間羥基苯甲酸(m-hydroxy benzoic acid)

日本 和光純藥工業株式會社 肝素鈉(Heparin Sodium) Novo Industrial Co.5000 I.U./ml 磷酸(Phosphoric acid) Merck Co.

甲醇(Methanol) Merck Co.

乙 (Acetonitrile) Merck Co.

氫氧化鈉(Sodium hydroxide) 德國 R.D.H. Co.

藥用酒精(Ethanol) 臺灣煙酒公賣局

生理食鹽水 信東化學工業公司

(2)

氮氣 太利氮氣

*使用於高效液相層析儀之試劑均為 HPLC 級

3.儀器及材料

A.高效液相層析儀之裝備

幫浦(Pump): Jasco Model PU-980

偵測器(Detector): Jasco Model UV-970 Intelligent UV/VIS 積分儀(Integrator): Scientific Information Service

Corporation Integrator 自動取樣機(Auto Sampler):

Jasco Model AS-950

印表機(Printer): Heweltt Packard Deskjet 695C

層析管(Column): Inertsil 5 ODS-2(4.6

×

150mm) VERCOPAK

建吾台灣

保護管柱(Pre-column): VERCOPAK 5 ODS-2(4.6

×

150mm)

建吾台灣

B.實驗室裝備

電子天平: Sartorius Type 1801

減壓抽氣機: Eyela, Aspirator A-2S, Tokyo, Rikak Co.

微量移液管(Micropipette):

Socorex Transferpette: l - 10

µ

l 20 - 200

µ

l

100 - 1000 µ l

試管振盪器: Maxi Mix II Thermolyne Type 37600 Mixer 高速離心機: Hettich Zentrifugen D-7200 Tuttlingen,

Germany(5000 rpm)

酸鹼測定儀(pH meter): Suntex Microprocessor pH meter Model-2200 純水製造裝置: RiOs, TK-5/ZROS6016Y, Millipore Co.

and Milli-Q, FM-12OD/ZMQS600, Millipore Co.

(3)

超音波振盪器: BRANSON 5510, BRANSON ULTRASONIC Co. , USA

吹氣濃縮裝置: Organomation Associates INC. Model No.112.

過濾膜: Millipore Type HV, 0.45

µ

m, Millipore Co.

C.動物實驗所用器材

胃管(內徑 1.5 mm): 季勗儀器公司 針筒過濾器 0.22

µ

m: PRO-XTM(Lida)

注射針及針筒: Terumo Co.Tokyo, Japan

1 ml Syringe 25G

×

5/8〞(0.5

×

16 mm) 2.5 ml Syringe 24G

×

1〞(0.55

×

25 mm) 10 ml Syringe 22G

×

1 1/2〞(0.70

×

38 mm) 靜脈置留針及針塞: Terumo Co.Tokyo, Japan

IV Catheter 22G

×

1〞

Injection Plug, 0.2 ml

家兔固定器: 信德儀器公司

張口器、棉花、3M 膠帶、計時器 4.溶液製備

(1)小 蘗 鹼 、 黃 芩 及 梔 子 的標準溶液(Berberine, Baicalin and Geniposide stock standard solution)

精稱小蘗鹼、黃芩 及梔子 標準品各稱 10.0 mg 分別置入一個 20 ml 的容量瓶中,添加甲醇至刻度,即得濃度為 50.0 μg/ml 的小 蘗鹼、黃芩 及梔子 的標準溶液。使用時再以甲醇稀釋成所需濃度 之標準溶液。

(2)內部標準溶液(internal standard solution)

精稱間羥基苯甲酸(m-hydroxy benzoic acid)10 mg 置於 100 ml 定

(4)

量瓶中,先加入適量乙 (Acetonitrile)使之溶解,再加入乙 至刻度,

可得濃度為 100

µ

g/ml 間羥基苯甲酸之儲備液;取 1.0 ml 之儲備液置 於 100 ml 容量瓶,加入乙 至刻度並混合均勻,即得濃度為 1

µ

g/ml 的內部標準溶液。

(3)肝素鈉溶液(Heparin sodium solution)

精取肝素鈉注射液(5,000 IU/ml)2.5 ml 加於 500 ml 生理食鹽水 中,即得 25 I.U./ml 抗凝血肝素鈉溶液。

(4)小 蘗 鹼 、 黃 芩 及 梔 子 靜脈注射液(Berberine, Baicalin and Geniposide solution for intravenaous injection)

精稱所須的小蘗鹼、黃芩 及梔子 後,再加入注射用水混合,

滴加 1-2 滴 1N NaOH 溶液使之溶解,調控 pH 值至 7.5-8.1 之間,再 經 0.22 µm 過濾薄膜過濾除菌即得。

(5)黃連解毒湯口服溶液(Huang-Lian-Jiee-Dwu-Tang oral solution)

依黃連解毒湯方中各藥材用量比例 3:2:2:1,秤取飲片黃連 150g、黃芩 100g、黃柏 100g 及梔子 50g,加入水 1000 ml 浸濕後,

以 90∼100℃煎煮一小時後過濾去渣。將過濾出之藥渣以前述步驟操 作,每次再加水 1000 ml 煎煮六十分鐘兩次,合併濾液約 2400 ml。

將濾液以減壓濃縮至 240 ml,放冷後置於-30℃冷凍櫃備用。用 HPLC 對黃連解毒湯口服液中之小蘗鹼、黃芩 及梔子 之含量進行分析,

發現各成分含量分別為 29.81mg/ml,22.556mg/ml,11.191mg/ml。

(6)黃連解毒湯靜脈注射液 (Huang-Lian-Jiee-Dwu-Tang solution for intravenaous injection )

試驗用黃連解毒湯注射液之製備過程,如同上述口服溶液方法,

放置於 5℃下冷藏過夜,隔天傾出上清液,將上清液用高速離心機將

(5)

沉澱物沉降之,取出澄明的上清液集中合併,經濾紙過濾。再濃縮至 100 ml 調控 pH 值至 7.5-8.1 之間,經 0.45

µ

m 過濾。調控 pH 值,最 後得到 60ml 的澄明藥液,經 0.22

µ

m 過濾,即得黃連解毒湯注射液。

用 HPLC 對黃連解毒湯注射液中之小蘗鹼、黃芩 及梔子 之含量 進行分析,發現各成分含量分別為 9.54mg/ml,7.22mg/ml,3.58mg/ml。

操作流程如下:

黃連解毒湯

黃連 150g、黃芩 100g、黃柏 100g 及梔子 50g(3:2:2:1)

先以水 1000ml 煎煮一小時 依上述再煎煮 2 次

藥渣 濾液

濃縮至 240ml

濾液 A 140ml 濾液 B 100ml 黃連解毒湯口服液 離心、過濾

沉澱 濾液 調控 pH7.5-8.1 經 0.45μm 濾膜過濾

濾液 調控 pH7.5-8.1 經 0.22μm 濾膜過濾

濾液 60ml

黃連解毒湯注射液

(6)

第二節 實驗方法

1.黃連解毒湯製劑中指標成分之 HPLC 定量分析方法

A.HPLC 分析條件

層析管(Column) Inertsil 5 ODS-2(4.6

×

150mm) VERCOPAK 保護管柱(Pre-column) ODS-2 VERCOPAK(4.6×35mm)

檢測波長 0-18 min,UV 240 nm ; 18-42 min,UV 277 nm 流速 1.0 ml/min

注入量 20

µ

l 分析時間 42 min.

移動相 A:乙

B:0.02% Phosphoric acid pH=2.6 濃度梯度

Time (min) A B

0 84 16

19 84 16

20 78 22

30 78 22

31 70 30

42 70 30

(7)

B.標準溶液檢量線之製作

精確量取 20

µ

l 含不同濃度之小蘗鹼(Berberine)、黃芩 (Baicalin) 和梔子 (Geniposide)標準溶液用甲醇 180

µ

l 稀釋成濃度為 0.05 至 50.0

µ

g/ml 之標準溶液。再加入含 1

µ

g/ml 間羥基苯甲酸(m-hydroxy benzoic acid)內標準品之乙 溶液 600µl,以振盪器振盪 20 秒,使 蛋白沉澱。再以 5000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液置於另一試 管中,以氮氣噴吹至乙 完全逸離後,以適當甲醇 200

µ

l 溶解之。

接著以 HPLC 分析,由所得之小蘗鹼、黃芩 和梔子 與間羥基 苯甲酸之面積比與校正液濃度作線性回歸以製作檢量線。

C.黃連解毒湯注射液中指標成分的定量

精確量取黃連解毒湯注射液 0.10 ml 置於 10 ml 容量瓶中,先加入 適量甲醇(Methanol)使之溶解,再加入甲醇至刻度,可得稀釋濃度 100 倍之黃連解毒湯注射液﹐用 0.45

µ

m 過濾薄膜過濾後;精確量 取此稀釋之黃連解毒湯注射液 200.0

µ

l 置入試管中,加入含 1

µ

g/ml 間羥基苯甲酸(m-hydroxy benzoic acid)內標準品之乙 溶液 600

µ

l,以振盪器振盪 20 秒。再以 5000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清 液置於另一試管中,以氮氣噴吹至乙 完全逸離後,以適當甲醇 200

µ

l 溶解,接著以 HPLC 分析。

D.黃連解毒湯口服液中指標成分的定量

精確量取黃連解毒湯口服液 0.10 ml 置於 10 ml 容量瓶中,先加入適 量甲醇使之溶解,再加入甲醇至刻度,可得稀釋濃度 100 倍之黃連 解毒湯口服液﹐用 0.45

µ

m 過濾薄膜過濾後;精確量取此稀釋之黃 連解毒湯口服液 200.0 µl 置入試管中,加入含 1

µ

g/ml 間羥基苯甲酸 (m-hydroxy benzoic acid)內標準品之乙 溶液 600 µl,以振盪器振盪 20 秒。再以 5000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液置於另一試管中,

(8)

以氮氣噴吹至乙 完全逸離後,以適當甲醇 200

µ

l 溶解,接著以 HPLC 分析。

2.黃連解毒湯血漿檢品中指標成分之 HPLC 定量分析方 法

A.HPLC 分析條件

如同上述黃連解毒湯製劑中指標成分之 HPLC 定量分析方法。

B.血漿檢品之前處理

精確量取血漿檢品 200.0

µ

l 置入試管中,加入含 1

µ

g/ml 間羥基苯甲 酸(m-hydroxy benzoic acid)內標準品之乙 溶液 600

µ

l,並以振盪器 振盪 20 秒,使蛋白沉澱。再以 5000 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 置於另一試管中,以氮氣噴吹至乙 完全逸離後,以適當甲醇 200 µl 溶解之。接著以 HPLC 分析。

C.檢量線之製作

精確量取家兔空白血漿 180

µ

l 加入 20.0

µ

l 含不同濃度之小蘗鹼 (Berberine)、黃芩 (Baicalin) 與梔子 (Geniposide)標準溶液,配製 成濃度為 0.05 至 50.0

µ

g/ml 之標準血漿檢品液(Table 5)。再加入含 1

µ

g/ml 間羥基苯甲酸(m-hydroxy benzoic acid)內標準品之乙 溶液 600

µ

l,以振盪器振盪 20 秒,使蛋白沉澱。再離心 20 分鐘。以氮 氣噴吹至乙 完全逸離後,以甲醇 200 µl 溶解之。接著以 HPLC 分 析,由所得之小蘗鹼、黃芩 、梔子 與間羥基苯甲酸之面積比與 校正液濃度作線性回歸以製作檢量線。

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Table 4 小蘗鹼、黃芩 與梔子 標準濃度血漿檢品溶液之製備

標準溶液濃度 (

µ

g/ml) (取 20

µ

l)

空白血漿體積 (

µ

l) 濃度 (

µ

g/ml)

500.0 180 50.0 250.0 180 25.0 100.0 180 10.0 50.0 180 5.00 10.0 180 1.00 5.00 180 0.50 1.00 180 0.10 0.50 180 0.05

D.回收率試驗

目的在比較添加小蘗鹼、黃芩 及梔子 在空白血漿和空白溶液 (Methanol)中,經血漿檢品之前處理步驟處理後檢出量之差異。實驗步 驟如同校正曲線製作中對檢品之處理過程。回收率可從下式求得:

plasma standard peak area ratio

Recovery (%)= × 100 % methanol standard peak area ratio

E.精確性試驗

為了確認小蘗鹼(Berberine)、黃芩 (Baicalin)及梔子 (Geniposide) 定量分析方法之精確性,因此做同日內(Intraday)及間日內(Interday)的精 確性比較。同日內試驗是以不同濃度之含小蘗鹼、黃芩 及梔子 標準

(10)

濃度血漿檢品,分別於同一日的早上、中午、晚上各取濃度為 0.50, 10.0, 100

µ

g/ml 之含小蘗鹼、黃芩 及梔子 標準溶液 500

µ

l,加入 4500

µ

l 之空白血漿中,振盪一分鐘以混合均勻,即得濃度為 0.05, 1.00, 10.0

µ

l/ml 之血漿檢品(n=2),計算各個校正液濃度之平均值(Mean)、標準 偏差(S.D.)及變異係數(C.V.)。若於不同天以同法操作則可得到間日內的 精確性比較。

F.靈敏度試驗

分析過程中,欲找出能被檢定出之最低濃度,但不需要能夠被定 量,故做偵測極限試驗(Limit of detection, LOD),經使用指標成分小蘗 鹼、黃芩 及梔子 標準品溶液逐步稀釋後,溶液以 HPLC 法分析,

由 Signal 對 Noise 比 3:1 為度。而偵測極量(Limit of quantitation, LOQ) 將依前述「檢量線之製作」,採標準濃度血漿檢品製備方法,取六次檢 品分析決定之。

LOD=S/N>3/1 LOQ= LOD×3.3 S:Signal N:Noise G.安定性試驗

(1)小蘗鹼、黃芩 及梔子 在家兔血漿中於-30℃下之安定性試驗 取濃度為 10.0, 50.0, 100

µ

g/ml 之含小蘗鹼、黃芩 及梔子 準溶液 500 µl,加入 4500

µ

l 之空白血漿中,振盪一分鐘以混合均勻,

即得濃度為 1.00, 5.00, 10.0

µ

l/ml 之血漿檢品,將之分裝後置於-30℃

的冷凍櫃中,於第 0, 1, 3, 6, 10, 15, 21 天分別取出一組檢品(n=3)。解 凍後,依血漿檢品之前處理方法處理後,以 HPLC 分析,觀察小蘗 鹼、黃芩 及梔子 之濃度變化情形。

(11)

(2)小蘗鹼、黃芩 及梔子 在家兔血漿中於 37℃下之安定性試驗 取濃度為 10.0, 50.0, 100

µ

g/ml 之含小蘗鹼、黃芩 及梔子 準溶液 500

µ

l,加入 4500

µ

l 之空白血漿中,振盪一分鐘以混合均勻,

即得濃度為 1.00, 5.00, 10.0 µl/ml 之血漿檢品,將之分裝後置於 37

±

2

℃的恆溫箱中,於第 0, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 小時,分別取出一組檢品 (n=3),依血漿檢品之前處理方法處理後,以 HPLC 分析,觀察小蘗 鹼、黃芩 及梔子 之濃度變化情形。

3.黃連解毒湯指標成分在家兔體內之藥物動力學

A.實驗設計

取雄性家兔六隻,體重介於 2.2 至 2.8 公斤之間,每隻家兔進行指 標成分注射液靜脈注射、黃連解毒

靜脈注射與黃連解毒

口服(P.O.) 給藥,實驗家兔之重量、給藥順序及劑量示於 Table 6,每次給藥後至 下次給藥,時間須相隔一週以上。

Table 5 實驗家兔之體重

Rabbit No. 1 2 3 4 5 6 2.4 2.2 2.2 2.6 2.3 2.5 2.3 2.6 2.3 2.4 2.6 2.8 Weight (kg)

2.5 2.4 2.5 2.2 2.2 2.3

Table 6 實驗家兔之劑量

指標成份 指標成份注射液 黃連解毒

注射液 黃連解毒

口服液 小蘗鹼 10 mg/kg 9.54 mg/kg 149.05 mg/kg 黃芩 15 mg/kg 7.22 mg/kg 112.78 mg/kg 梔子 2.5 mg/kg 3.58 mg/kg 55.95 mg/kg

(12)

B.給藥法及檢品處理

(1)指標成分注射液靜脈注射給藥及血漿檢品之處理:

實驗前家兔先稱重記錄實際體重以便配製注射溶液。實驗時將兩 耳之毛剃除後關入限制籠內,接著以燈泡照射兔耳使其血管擴張,再 以酒精棉消毒並助血管擴張,隨即插入靜脈留置針,將針塞(Injection plug)注滿肝素鈉溶液後,固定於靜脈留置針上。每次採血後均由針 塞注入 25 I.U./ml 之肝素鈉溶液約 0.2 ml,以防靜脈留置針管內之血 液凝固。投藥前先抽取 1.5ml 之空白血液,由另一耳靜脈投藥後,分 別於投藥後 2.5, 5, 10, l5, 20, 30, 45, 60, 90, 120, l50, l80, 210, 240, 300 及 360 分鐘由靜脈留置針之針塞抽取 l.5ml 血液,置於試管中,以 5000 rpm 轉速離心 20 分鐘後,取出上層血漿,即保存於-30℃之冷凍櫃中。

血漿檢品之前處理,檢量線及分析條件均依前述方法操作,小蘗 鹼、黃芩 及梔子 之濃度則由標準曲線經內插法推算而得。

(2)黃連解毒湯靜脈注射給藥及血漿檢品處理:

如同上述指標成分靜脈注射給藥方式。

(3).黃連解毒湯口服給藥及血漿檢品處理:

口服給藥實驗前家兔至少禁食 24 小時,實驗期間亦不進食。實 驗時家兔之處理如同上述靜脈注射給藥方式,惟口服給藥法是以張口 器將家兔之口張開後,再以胃管插入給藥。而其採血點為給藥後之 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, l80, 210, 240, 270, 300, 360, 420, 480 分 鐘。

C.數據處理及統計方法

(13)

各種給藥法所取得之血漿檢品經 HPLC 法定量後,依標準曲線換 算黃連解毒湯指標成分,小蘗鹼(Berberine)、黃芩 (Baicalin)及梔子 (Geniposide)之血中濃度數據後,利用電腦程式 JANA, WINNONLIN 及 LAGRAN-P,統計軟體 SPSS Independent-Samples T-test 和 One-Way ANOVA,分別利用配適後的分室及非分室理論來計算相關之藥物動力 學參數。

(1)二室體模式(Two Compartment Model)

分析而得之各個指標成分血中濃度數據,經 JANA PROGRAM 作 Weighting 、Two Exponential Curve stripping 處理,取其 A、B、

α

β的數值。再用 WINNONLIN PROGRAM 作曲線配適(Curve Fitting)

取最適合的室體模式,求其相關藥動學參數。

(2)非分室理論

以靜脈注射及口服給予家兔所得血漿檢品,由分析而得之各個指 標成分血中濃度數據,經 LAGRAN-P PROGRAM 處理,可由非分室 理論計算相關藥動學參數。由上述所得之藥動學參數以統計學 t-test 比較 WINNONLIN 及 LAGRAN-P 二種程式處理後所得之藥物學參 數(AUC, CL, T1/2 , VDSS),另以統計學 One-Way ANOVA 處理,比較 不同投藥間藥動學參數之差異。

數據

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參考文獻

相關主題 : 第一節 實驗材料