第一節 實驗材料

第三章 實驗材料及方法

第一節 實驗材料

1.藥材

本實驗所使用之中藥材係購自台中欣隆藥材行，經本所陳忠川所長 鑑定中藥材之基原採用如下:

黃連 Coptis chinensis

^Wallich

George

Rupr

Ellis

2.藥品及試劑

小蘗鹼(Berberine Chloride) 美國 Sigma Chemical Co.

黃芩 (Baicalin Hydrate) Aldrich Chemical Co.

梔子 (Geniposide) 日本 米山藥品工業株式會社 間羥基苯甲酸(m-hydroxy benzoic acid)

日本 和光純藥工業株式會社 肝素鈉(Heparin Sodium) Novo Industrial Co.5000 I.U./ml 磷酸(Phosphoric acid) Merck Co.

甲醇(Methanol) Merck Co.

乙 (Acetonitrile) Merck Co.

氫氧化鈉(Sodium hydroxide) 德國 R.D.H. Co.

藥用酒精(Ethanol) 臺灣煙酒公賣局

生理食鹽水 信東化學工業公司

氮氣 太利氮氣

＊使用於高效液相層析儀之試劑均為 HPLC 級

3.儀器及材料

A.高效液相層析儀之裝備

幫浦(Pump)： Jasco Model PU-980

偵測器(Detector)： Jasco Model UV-970 Intelligent UV/VIS 積分儀(Integrator)： Scientific Information Service

Corporation Integrator 自動取樣機(Auto Sampler)：

Jasco Model AS-950

印表機(Printer)： Heweltt Packard Deskjet 695C

層析管(Column)： Inertsil 5 ODS-2(4.6

×

建吾台灣

保護管柱(Pre-column)： VERCOPAK 5 ODS-2(4.6

×

建吾台灣

B.實驗室裝備

電子天平： Sartorius Type 1801

減壓抽氣機： Eyela, Aspirator A-2S, Tokyo, Rikak Co.

微量移液管(Micropipette)：

Socorex Transferpette： l - 10

µ

µ

100 - 1000 µ l

Germany(5000 rpm)

酸鹼測定儀(pH meter)： Suntex Microprocessor pH meter Model-2200 純水製造裝置： RiOs, TK-5/ZROS6016Y, Millipore Co.

and Milli-Q, FM-12OD/ZMQS600, Millipore Co.

超音波振盪器： BRANSON 5510, BRANSON ULTRASONIC Co. , USA

吹氣濃縮裝置： Organomation Associates INC. Model No.112.

過濾膜： Millipore Type HV, 0.45

µ

C.動物實驗所用器材

胃管(內徑 1.5 mm)： 季勗儀器公司 針筒過濾器 0.22

µ

注射針及針筒： Terumo Co.Tokyo, Japan

1 ml Syringe 25_G

×

×

×

×

×

×

IV Catheter 22G

×

Injection Plug, 0.2 ml

家兔固定器： 信德儀器公司

張口器、棉花、3M 膠帶、計時器 4.溶液製備

(1)小 蘗 鹼 、 黃 芩 及 梔 子 的標準溶液(Berberine, Baicalin and Geniposide stock standard solution)

精稱小蘗鹼、黃芩 及梔子 標準品各稱 10.0 mg 分別置入一個 20 ml 的容量瓶中，添加甲醇至刻度，即得濃度為 50.0 μg/ml 的小 蘗鹼、黃芩 及梔子 的標準溶液。使用時再以甲醇稀釋成所需濃度 之標準溶液。

(2)內部標準溶液(internal standard solution)

精稱間羥基苯甲酸(m-hydroxy benzoic acid)10 mg 置於 100 ml 定

量瓶中，先加入適量乙 (Acetonitrile)使之溶解，再加入乙 至刻度，

可得濃度為 100

µ

µ

(3)肝素鈉溶液(Heparin sodium solution)

精取肝素鈉注射液(5,000 IU/ml)2.5 ml 加於 500 ml 生理食鹽水 中，即得 25 I.U./ml 抗凝血肝素鈉溶液。

(4)小 蘗 鹼 、 黃 芩 及 梔 子 靜脈注射液(Berberine, Baicalin and Geniposide solution for intravenaous injection)

精稱所須的小蘗鹼、黃芩 及梔子 後，再加入注射用水混合，

滴加 1-2 滴 1N NaOH 溶液使之溶解，調控 pH 值至 7.5-8.1 之間，再 經 0.22 µm 過濾薄膜過濾除菌即得。

(5)黃連解毒湯口服溶液(Huang-Lian-Jiee-Dwu-Tang oral solution)

依黃連解毒湯方中各藥材用量比例 3：2：2：1，秤取飲片黃連 150g、黃芩 100g、黃柏 100g 及梔子 50g，加入水 1000 ml 浸濕後，

以 90∼100℃煎煮一小時後過濾去渣。將過濾出之藥渣以前述步驟操 作，每次再加水 1000 ml 煎煮六十分鐘兩次，合併濾液約 2400 ml。

將濾液以減壓濃縮至 240 ml，放冷後置於-30℃冷凍櫃備用。用 HPLC 對黃連解毒湯口服液中之小蘗鹼、黃芩 及梔子 之含量進行分析，

發現各成分含量分別為 29.81mg/ml，22.556mg/ml，11.191mg/ml。

(6)黃連解毒湯靜脈注射液 (Huang-Lian-Jiee-Dwu-Tang solution for intravenaous injection )

試驗用黃連解毒湯注射液之製備過程，如同上述口服溶液方法，

放置於 5℃下冷藏過夜，隔天傾出上清液，將上清液用高速離心機將

沉澱物沉降之，取出澄明的上清液集中合併，經濾紙過濾。再濃縮至 100 ml 調控 pH 值至 7.5-8.1 之間，經 0.45

µ

µ

用 HPLC 對黃連解毒湯注射液中之小蘗鹼、黃芩 及梔子 之含量 進行分析，發現各成分含量分別為 9.54mg/ml，7.22mg/ml，3.58mg/ml。

操作流程如下：

黃連解毒湯

黃連 150g、黃芩 100g、黃柏 100g 及梔子 50g（3：2：2：1）

先以水 1000ml 煎煮一小時 依上述再煎煮 2 次

藥渣 濾液

濃縮至 240ml

濾液 A 140ml 濾液 B 100ml 黃連解毒湯口服液 離心、過濾

沉澱 濾液 調控 pH7.5-8.1 經 0.45μm 濾膜過濾

濾液 調控 pH7.5-8.1 經 0.22μm 濾膜過濾

濾液 60ml

黃連解毒湯注射液

第二節 實驗方法

1.黃連解毒湯製劑中指標成分之 HPLC 定量分析方法

A.HPLC 分析條件

層析管(Column) Inertsil 5 ODS-2(4.6

×

檢測波長 0-18 min，UV 240 nm ； 18-42 min，UV 277 nm 流速 1.0 ml/min

注入量 20

µ

移動相 A：乙

B：0.02% Phosphoric acid pH=2.6 濃度梯度

Time (min) A B

0 84 16

19 84 16

20 78 22

30 78 22

31 70 30

42 70 30

B.標準溶液檢量線之製作

精確量取 20

µ

µ

µ

µ

µ

接著以 HPLC 分析，由所得之小蘗鹼、黃芩 和梔子 與間羥基 苯甲酸之面積比與校正液濃度作線性回歸以製作檢量線。

C.黃連解毒湯注射液中指標成分的定量

精確量取黃連解毒湯注射液 0.10 ml 置於 10 ml 容量瓶中，先加入 適量甲醇(Methanol)使之溶解，再加入甲醇至刻度，可得稀釋濃度 100 倍之黃連解毒湯注射液﹐用 0.45

µ

µ

µ

µ

µ

D.黃連解毒湯口服液中指標成分的定量

精確量取黃連解毒湯口服液 0.10 ml 置於 10 ml 容量瓶中，先加入適 量甲醇使之溶解，再加入甲醇至刻度，可得稀釋濃度 100 倍之黃連 解毒湯口服液﹐用 0.45

µ

µ

以氮氣噴吹至乙 完全逸離後，以適當甲醇 200

µ

2.黃連解毒湯血漿檢品中指標成分之 HPLC 定量分析方 法

A.HPLC 分析條件

如同上述黃連解毒湯製劑中指標成分之 HPLC 定量分析方法。

B.血漿檢品之前處理

精確量取血漿檢品 200.0

µ

µ

µ

C.檢量線之製作

精確量取家兔空白血漿 180

µ

µ

µ

µ

µ

Table 4 小蘗鹼、黃芩 與梔子 標準濃度血漿檢品溶液之製備

標準溶液濃度 (

µ

µ

空白血漿體積 (

µ

µ

500.0 180 50.0 250.0 180 25.0 100.0 180 10.0 50.0 180 5.00 10.0 180 1.00 5.00 180 0.50 1.00 180 0.10 0.50 180 0.05

D.回收率試驗

目的在比較添加小蘗鹼、黃芩 及梔子 在空白血漿和空白溶液 (Methanol)中，經血漿檢品之前處理步驟處理後檢出量之差異。實驗步 驟如同校正曲線製作中對檢品之處理過程。回收率可從下式求得:

plasma standard peak area ratio

Recovery (%)= × 100 % methanol standard peak area ratio

E.精確性試驗

為了確認小蘗鹼(Berberine)、黃芩 (Baicalin)及梔子 (Geniposide) 定量分析方法之精確性，因此做同日內(Intraday)及間日內(Interday)的精 確性比較。同日內試驗是以不同濃度之含小蘗鹼、黃芩 及梔子 標準

濃度血漿檢品，分別於同一日的早上、中午、晚上各取濃度為 0.50, 10.0, 100

µ

µ

µ

µ

F.靈敏度試驗

分析過程中，欲找出能被檢定出之最低濃度，但不需要能夠被定 量，故做偵測極限試驗(Limit of detection, LOD)，經使用指標成分小蘗 鹼、黃芩 及梔子 標準品溶液逐步稀釋後，溶液以 HPLC 法分析，

由 Signal 對 Noise 比 3：1 為度。而偵測極量(Limit of quantitation, LOQ）， 將依前述「檢量線之製作」，採標準濃度血漿檢品製備方法，取六次檢 品分析決定之。

LOD=S/N＞3/1 LOQ= LOD×3.3 S：Signal N：Noise G.安定性試驗

(1)小蘗鹼、黃芩 及梔子 在家兔血漿中於-30℃下之安定性試驗 取濃度為 10.0, 50.0, 100

µ

µ

即得濃度為 1.00, 5.00, 10.0

µ

的冷凍櫃中，於第 0, 1, 3, 6, 10, 15, 21 天分別取出一組檢品(n=3)。解 凍後，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC 分析，觀察小蘗 鹼、黃芩 及梔子 之濃度變化情形。

(2)小蘗鹼、黃芩 及梔子 在家兔血漿中於 37℃下之安定性試驗 取濃度為 10.0, 50.0, 100

µ

µ

µ

即得濃度為 1.00, 5.00, 10.0 µl/ml 之血漿檢品，將之分裝後置於 37

±

℃的恆溫箱中，於第 0, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 小時，分別取出一組檢品 (n=3)，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC 分析，觀察小蘗 鹼、黃芩 及梔子 之濃度變化情形。

3.黃連解毒湯指標成分在家兔體內之藥物動力學

A.實驗設計

取雄性家兔六隻，體重介於 2.2 至 2.8 公斤之間，每隻家兔進行指 標成分注射液靜脈注射、黃連解毒

湯

湯

Table 5 實驗家兔之體重

Rabbit No. 1 2 3 4 5 6 2.4 2.2 2.2 2.6 2.3 2.5 2.3 2.6 2.3 2.4 2.6 2.8 Weight (kg)

2.5 2.4 2.5 2.2 2.2 2.3

Table 6 實驗家兔之劑量

指標成份 指標成份注射液 黃連解毒

湯

湯

B.給藥法及檢品處理

(1)指標成分注射液靜脈注射給藥及血漿檢品之處理：

實驗前家兔先稱重記錄實際體重以便配製注射溶液。實驗時將兩 耳之毛剃除後關入限制籠內，接著以燈泡照射兔耳使其血管擴張，再 以酒精棉消毒並助血管擴張，隨即插入靜脈留置針，將針塞(Injection plug)注滿肝素鈉溶液後，固定於靜脈留置針上。每次採血後均由針 塞注入 25 I.U./ml 之肝素鈉溶液約 0.2 ml，以防靜脈留置針管內之血 液凝固。投藥前先抽取 1.5ml 之空白血液，由另一耳靜脈投藥後，分 別於投藥後 2.5, 5, 10, l5, 20, 30, 45, 60, 90, 120, l50, l80, 210, 240, 300 及 360 分鐘由靜脈留置針之針塞抽取 l.5ml 血液，置於試管中，以 5000 rpm 轉速離心 20 分鐘後，取出上層血漿，即保存於-30℃之冷凍櫃中。

血漿檢品之前處理，檢量線及分析條件均依前述方法操作，小蘗 鹼、黃芩 及梔子 之濃度則由標準曲線經內插法推算而得。

(2)黃連解毒湯靜脈注射給藥及血漿檢品處理：

如同上述指標成分靜脈注射給藥方式。

(3).黃連解毒湯口服給藥及血漿檢品處理：

口服給藥實驗前家兔至少禁食 24 小時，實驗期間亦不進食。實 驗時家兔之處理如同上述靜脈注射給藥方式，惟口服給藥法是以張口 器將家兔之口張開後，再以胃管插入給藥。而其採血點為給藥後之 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, l80, 210, 240, 270, 300, 360, 420, 480 分 鐘。

C.數據處理及統計方法

各種給藥法所取得之血漿檢品經 HPLC 法定量後，依標準曲線換 算黃連解毒湯指標成分，小蘗鹼(Berberine)、黃芩 (Baicalin)及梔子 (Geniposide)之血中濃度數據後，利用電腦程式 JANA, WINNONLIN 及 LAGRAN-P，統計軟體 SPSS Independent-Samples T-test 和 One-Way ANOVA，分別利用配適後的分室及非分室理論來計算相關之藥物動力 學參數。

(1)二室體模式(Two Compartment Model)

分析而得之各個指標成分血中濃度數據，經 JANA PROGRAM 作 Weighting 、Two Exponential Curve stripping 處理，取其 A、B、

α

β的數值。再用 WINNONLIN PROGRAM 作曲線配適(Curve Fitting)

(2)非分室理論

以靜脈注射及口服給予家兔所得血漿檢品，由分析而得之各個指 標成分血中濃度數據，經 LAGRAN-P PROGRAM 處理，可由非分室 理論計算相關藥動學參數。由上述所得之藥動學參數以統計學 t-test 比較 WINNONLIN 及 LAGRAN-P 二種程式處理後所得之藥物學參 數(AUC, CL, T1/2 , VD_SS)，另以統計學 One-Way ANOVA 處理，比較 不同投藥間藥動學參數之差異。