中藥黃麴毒素檢驗方法建立 及應注意事項

中藥黃麴毒素檢驗方法建立 及應注意事項

TFDA研究檢驗組食品生物檢驗科 廖家鼎 99.11.09

大 綱

¾

¾

¾

¾

衛生署抽驗越南進口的花生糖，結果3個月 內，連續3批越南花生糖，含有黃麴毒素，最 近一批甚至超標16倍，長期大量食用會傷肝 腎，嚴重的話甚至會導致肝癌；衛生署宣布，

越南進口的花生，從原先只抽驗5%，增加到 100%逐批檢驗，而抽檢不合格的這批，已經 在邊境被攔了下來，至於有沒有其他批貨流入 市面，會加強抽驗。

這一袋，就是衛生署抽驗出含有黃麴毒素的越 南花生糖，5千多公斤的貨，在越南邊界攔檢 之後，發現黃麴毒素的含量高達243ppb，比 法定值高出了16倍，8月還有一批貨也不合 格，花生同樣被驗出，含有傷肝腎黃麴毒素，

含量78ppb，也超標5.2倍。

2010-10-25 TVBS

新 聞 事 件

黃麴毒素(aflatoxin)

¾ 一群構造類似之黴菌次級代謝物，由 Aspergillus 及Penicillium 屬產生，以

Aspergillus flavus

Aspergillus parasiticus

¾ 1960年”Turkey X disease” 造成英國十多萬隻 火雞死亡事件，後續研究發現是由巴西進口飼 料中黃麴毒素所引起

Aspergillus flavus

(www.aflatoxin.info)

(http://www.ncga.com, http://aes.missouri.edu )

遭受黃麴毒素污染之玉米

黃麴毒素之常見種類及其化學結構

總黃麴毒素包括 Aflatoxin B1、B2、

G1、G2之總和

產生黃麴毒素之條件

¾ 將黃麴菌接種於培養基中觀察生長及產毒情形，發現 最適生長溫度為33~35℃、水活性(a_w)為0.99；毒素則 在24~28℃、水活性0.93~0.98下易生成。

¾ 台灣地處亞熱帶，高溫高濕環境有利黃麴菌繁殖，隨 風或昆蟲散播，落於土壤中污染農作物。

¾ 採收、運送、貯存、加工、銷售等過程，若環境過於 高溫潮濕，皆有可能產生。

¾ 無色無味，耐高溫。

¾

生殖力下降等症狀。半數致死劑量LD₅₀ 為0.5~10 mg/kg BW。

¾

¾

黃麴毒素之毒性

黃麴毒素之毒性

¾ 黃 麴 毒 素 B₁ 經 代 謝 為 毒 性 極 強 之 黃 麴 毒 素 2 , 3 - epoxide，再與核酸和蛋白質結合，並干擾DNA的轉 錄、轉譯過程。可導致突變、致畸胎與致癌性。

¾ 主要的症狀：嘔吐、腹痛、肺水腫、痙攣、昏迷、免 疫力下降、慢性肝炎、猛爆性肝炎、肝癌。有流行病 學研究指出，受到黃麴毒素污染嚴重的地區，人們通 常有較高的肝癌發生率。

¾ WHO所屬之國際癌症研究中心已於1987年確認黃麴毒 素為一級致癌物。目前尚未訂每日容許攝取量 。

黃麴毒素之相對致癌性

毒性：B₁＞M₁=G₁＞B₂＞G₂

黃麴毒素 相對致癌性

B1 100

M1 3

G1 3

B2 0.2

G2 0.1

常見遭受黃麴毒素污染之食材

¾

¾

¾

¾

¾

¾

食品中黃麴毒素限量標準

82.1.4.衛署食字第8189322號公告

食 品 種 類 總黃麴毒素限量（包括Aflatoxin B1，

B2，G1，G2）

花生 、 玉米 15 ppb 以下

米、高粱、豆類、麥類

及堅果類 10 ppb 以下

食用油脂 10 ppb 以下

其他食品 10 ppb 以下

嬰兒食品 不得檢出

鮮乳 0.5 ppb以下 (以M1計) 乳粉 5.0 ppb以下 (以M1計)

全球制定食品中總黃麴毒素 限量標準之國家數目

(FAO, 2003)

全球制定食品中黃麴毒素B ₁ 限量標準之國家數目

(FAO, 2003)

全球制定牛奶中黃麴毒素M ₁ 限量標準之國家數目

(FAO, 2003)

總黃麴毒素 (ppb) 黃麴毒素B1 (ppb)

美國 20

歐盟 4 2

日本 10

中國 20 5

主要國家訂定食品中黃麴毒素

之限量標準

中藥材中黃麴毒素限量標準(95.11)

有害物質 限量 適用範圍

黃麴毒素

(Aflatoxin) 15 ppb

八角茴香、紅棗、大腹皮、女 貞子、山楂、山茱萸、枸杞子

、胡椒、麴類、小茴香、延胡 索、橘皮、黃耆、蓮子

(共14品項)

黃麴毒素分析檢驗工具

ELISA Kit (免疫酵素連結法) TLC (薄層層析)

HPLC (高效液相層析) LC/MS/MS (液相層析串聯質譜) 螢光判讀機

黃麴毒素檢驗方法

¾ 酵素聯結免疫分析法

(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

¾ 化學分析法

22

ELISA原理

免疫酵素聯結反應

¾ 使用對黃麴毒素具專一性之抗 體

¾ 操作簡單，價格低廉，可作為 篩選工具(screening)

¾ 過去產品需搭配Elisa Reader，

測定固定波長下之吸光值，比 對標準曲線後定量黃麴毒素濃 度。新產品(快速檢測試紙)僅需 3分鐘即可得知是否大於10 ppb / 20 ppb

(www.vicam.com)

化學分析法

取樣(Sampling) 萃取

淨化

定性及定量分析

取樣之概念

¾

¾

¾

¾

¾

¾

萃取與淨化

¾

•

¾

•

•

SPE原理

IAC原理

( European Mycotoxin Awareness Network)

(AOAC official method 991.31)

定性及定量分析

¾

¾

¾

螢光判讀法

¾

¾

¾

¾

高效液相層析法

¾

•

•

•

碘衍生化反應原理

高效液相層析法-2

¾

•

•

•

光化學衍生化反應原理

•美國AURA公司製造之KRC 25-25光化學反應器，構造係將長25公尺之PTFE材質細 管(1/16 inch OD × 0.25 mm ID)編織成長方形並固定於具254 nm紫外線照射之不透光 燈盒內，使AFB₁、AFG₁流經此管中轉變為AFB_2a、AFG_2a。

液相層析質譜法

¾

¾

¾

¾

(Lattanzio et al., 2007)

國內目前應用之方法

¾ 中華民國國家標準方法CNS4090，類號N6097 方法(衛署授食字第0900002652號指定為公告 方法)。(螢光判讀法及HPLC碘衍生法)

¾ 99年10月15日署授食字第0991903564號 (HPLC光化學衍生法)

www.fda.gov.tw /業務專區/研究檢驗/公告檢驗方法

檢液製備-I

檢體磨碎混勻

↓稱取25 g，置於不銹鋼杯中

↓加氯化鈉 5 g

↓加 60﹪甲醇/水 125 mL

↓以 15,000 rpm 均質 2 分鐘後，用 Whatman 1 號濾紙過濾

↓取濾液 20 mL

↓加去離子水 20 mL

↓用玻璃纖維濾紙作細過濾

檢液製備-II

↓取濾液 10 mL，以

1 滴/秒

疫親和管

↓以去離子水 10 mL 清洗免疫親和管2次

↓取 LC 級

甲醇

↓收集純化後之檢液於玻璃試管

↓加去離子水定量至2 mL

↓ HPLC分析 ^{加溴發展液，}_{螢光判讀分析}

螢光判讀

¾ 校正螢光判讀機：使用Vicam校正用標準 液套組。

¾ 黃麴毒素總量之測定：將檢液與等體積 之溴發展液( 當日配製並儲存於褐色瓶中 之0.003 % 溴水)混合後，置於螢光判讀 機中判讀結果。僅需60秒。

層析條件

¾ 標準液及檢液注入量： 50 μL

¾ 分 析 管 柱 ： 4 . 6 mm × 25 cm，5 μm，

Cosmosil 5C18-AR 管柱

¾ 移動相：45 ％甲醇水溶液，流速：1 mL / min

¾ 管柱後衍生系統：0.5 mm × 610 cm 鐵弗龍管 於 70 ℃中保溫反應

¾ 後衍生化溶液：0.05％

碘溶液

¾ 螢光偵測器：激發光 360 nm 發射光 440 nm

黃麴毒素標準液製備

¾ 原液:美國 SUPELCO 公司 Aflatoxin Mix Kit-M

¾ 原液濃度AFB₁ 1μg/mL、AFB₂ 0.3μg/mL、

AFG₁ 1μg/mL、AFG₂ 0.3 μg/mL，製備出各 種濃度之黃麴毒素標準液，並製作標準曲線供 定量分析用

計算公式

¾ W＝ 25 g ×（20 mL / 125 mL）×（10 mL / 40 mL)

＝ 1 g

¾ 檢體中黃麴毒素含量

C’（ppb）＝ C×Tv / W

¾ W：最終定容檢液所含檢體重（1 g）

¾ Tv：最終定容檢液體積 （2 mL）

¾ C：檢液之黃麴毒素濃度（ng/mL）

G₂

G₁

B₂

B₁

mv

minutes

高效液相層析圖譜

0 5 10 15 20 25

0 50 100 150

實驗操作注意事項

¾

¾

47

本局歷年來針對花生製品中 黃麴毒素之調查結果

抽驗年份

（民國） 件數 檢出件數

（%）

不合格件數

（%）

86 130 38（29.2） 9（6.9）

87 218 88（40.4） 15（6.9）

88 83 31（37.3） 9（10.8）

89 95 22（23.2） 4（4.2）

90 118 13（11.0） 2（1.7）

93 126 53（42.0） 6（4.8）

94 178 67（37.6） 8（4.5）

95 108 27（25.0） 12（11.1）

96 163 46（28.2） 16（9.8）

97 140 42（30.0） 15（10.7）

98 133 45（33.8） 8（6.0）

99 135 30（22.2） 5（3.7）

合 計 1627 502（30.9） 109（6.7）

本局91~93年中藥材中黃麴毒素之調查結果

(黃耆、薏苡芢、延胡索、蓮子、山藥)

年度 藥材名稱 檢出件數/總件數(%) 超出15 ppb件數/總件數(%) 檢出含量範圍(ppb)

91 黃耆 9/100 (9) 2/100 (2) 4.5~55.1

92 薏苡芢 11/100 (11) 1/100 (1) 1.3~13.0

93 延胡索 3/50 (6) 2/50 (4) 3.0~18.1

93 蓮子 1/50 (2) 1/50 (2) 62.3

93 山藥 0/50 (0) 0/50 (0)

檢體來源：台灣各地區中藥廠及中藥店

本局96年中藥材中黃麴毒素之調查結果

本局97年中藥材中黃麴毒素之調查結果

延胡索：2.3 ~ 258.6 ppb 蓮子： 22.4 ~ 429.5 ppb

¾ 延胡索及蓮子之污染情形最嚴重，多為大陸進口。

¾ 檢出黃麴毒素B1最多，B2次之。G1及G2較少。

送TFDA審查時應準備之文件

¾

檢驗方法SOP

¾

檢驗結果報告

¾

其他確效試驗資料

準備確效試驗資料之原因

¾ 現參考之黃麴毒素公告檢驗方法為「食品中黴菌毒素 檢驗方法—黃麴毒素之檢驗」。免疫親合管柱商品之 開發與檢驗方法設計皆以「食品」為主要基質，如花 生與穀類。

¾ 此方法是否適用於中藥材中黃麴毒素之檢驗，須由藥 廠提供相關確效資料，以證明此方法亦可進行該項中 藥材(單方或濃縮製劑)中黃麴毒素之檢驗。

確效試驗資料—添加回收率試驗

¾ 需取空白的中藥檢體進行添加回收率試驗。如檢驗對 象為延胡索，需以未檢出黃麴毒素之延胡索為空白檢 體，添加黃麴毒素標準品，添加濃度以低、中、高濃 度各一點為宜(如1、5及20 ppb)。標準品須在檢體萃 取前添加，進行完整個前處理流程之後上機分析。

¾ 回收率(%)=

標準品添加濃度 上機分析後濃度

× 100%

確效試驗資料—添加回收率試驗

標準品spike 1 ppb，如何做？

100 ng/g × 0.25 mL = 25 ng 1000 ng/g × 0.025 mL = 25 ng

25 ng / 25 g = 1 ppb

標準品溶質重 取樣檢體重

標準品spike 5 ppb，如何做？

※即將檢體粉末25g與NaCl 5g加入不銹鋼杯中，將1000 ng/g黃麴毒素B1標準品加入，再添加 125 mL甲醇萃取溶液，進行均質與後續過濾、淨化等流程

確效試驗資料—添加回收率試驗

¾ 添加回收率試驗結果，黃麴毒素B1、B2、G1及G2應 分別計算，理想的回收率介於60~120%之間。

¾ 請附上標準品與檢體之層析圖譜至少各1張，標準品 須註明濃度，圖譜上需有波峰面積數字，以供作回收 率計算之證明。

確效試驗資料

¾ 若分析儀器不是使用公告方法中的HPLC，而是使用 LC/MS/MS，請詳細列出LC/MS/MS分析條件。

¾ 檢驗方法SOP與檢驗結果報告中均應寫出該方法之檢 出限量(detection limit)。黃麴毒素B1、B2、G1及G2 之檢出限量總和應不可高於法規限量標準15 ppb之一 半(7.5 ppb)。

常見問題

¾ 未進行添加回收率試驗

¾ 添加回收率試驗未用該中藥當作空白基質進行

¾ 添加回收率試驗中所添加之標準品濃度太高

¾ 添加回收率試驗中所添加標準品之時機不對

¾ 未註明檢出限量(如檢驗結果僅寫N.D.未檢出)

¾ 檢出限量太高

¾ 未附檢驗報告書

¾ 其他書面上疏失

Thank you for your attention !

02-2653-1461 cdliao@fda.gov.tw