訊號強度

(1)

Introduction Introduction

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ProteinLynx

^TM

Global SERVER export to PDQuest Annotation Tools

PDQuest Annotation Tools

C L I C

K

(2)

Proteomics

Protein extracts

In Gel Digestion*

Proteome or Sub-proteome

Image Analysis

1 2D Gel

2 *workshop for digestion

MALDI MS + MS/MS**

3

In Solution Digestion*

MALDI plate MALDI-Q-TOF MALDI-TOFTOF

C18 Capillary nanoLC column

nanoESI- Q-TOF Direct offline nanoESI MS Analysis

nanoLC- nanoESI- MS/MS**

4

**entry point = tryptic digests; service inclusive of MS data processing, generation of meta data for database search; also include search results against SwissProt for single spot/band protein ID

MS Informatics

5 workshop for database search and result interpretation

6 protein/peptide mw determination Workshop and Analytical Service

provided by the core facilities

(monthly)

MALDI

MALDI - - Q Q - - TOF TOF

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Peptide CHCA

Peptide結晶結晶

將待分析之樣品與基質 (Matrix)做混合，我們這裡僅以CHCA(α-cyano- 4-hydroxycinnamic acid) 為例。

Matrix的功能是吸收雷射能量然後轉移給peptide 促使其質子化而游離。

將與Matrix混合完全之待測樣品均勻點至金屬盤 (Mass target plate)之樣品槽中，待溶劑揮發後在金屬盤上產生結晶。

(3)

樣品上機樣品上機

Sample 1

Sample 2 MS

Survey Scan Switch to MS/MS

MS Survey Scan

Switch to MS/MS

Automated MS and MS/MS Acquisition

using MALDI-Q-TOF

laser

analysis time

In one run, using 10%of sample MS for PMF

± MS/MS for confirmation

質量電荷比(m/z)

訊號強度

Peptide

Peptide質量指紋質量指紋(PMF) (PMF)

四極桿軸 collision cell

TOF Pulser

Reflectron Reflectron

經雷射光束打擊結晶，使蛋白質質子化接著蛋白質就會脫附漂進真空電場之中。

此時四極桿是無功能的它會讓所有的分子漂過。

collision cell在這個階段也是沒有功能的。

當分子穿過四極桿及 collision cell之後即進入 TOF 。

Pulser會使分子轉向並增加移動的能量。

當分子經過TOF內的 reflectron時分子會以拋物線的方式轉向，本過程最主要是藉由離心力拉大分子量相近的分子之飛行

(4)

質量電荷比(m/z)

訊號強度

當得到 Peptide質量指紋後，質譜儀會先將 Trypsin訊號去除，然挑選訊號最強的peptide優先進行碎裂。

TOF Pulser

如此就可得到Trypsin切過的Peptide質量指紋之後會以每秒10發雷射的頻率重複上述流程直至累積到足夠的訊號強度為止。

Peptide

Peptide質量指紋質量指紋(PMF) (PMF)

訊號強度

質量電荷比(m/z)

TOF Pulser

之後這些斷片即被導入TOF而被偵測，最後我們就是依照這些斷片資訊於電腦中計算出蛋白質的部份氨基酸序列。

Peptide Peptide定序定序

collision cell內開始充入鈍氣(氬) 。分子游離脫附後進入四極桿，此時四極桿僅讓特定分子量之分子通過。

特定分子進入 collision cell和氬氣原子衝撞產生逢機斷片。

一般蛋白質分子內的peptide bond是屬於比較弱的鍵結，因此我們幾乎可以認為peptide是以氨基酸為最小單位進行逢機斷裂。

b2

b1 b3 b4

MS/MS of peptide for sequence information MS/MS of peptide for sequence information

Ionization M

H⁺

m/z Molecular Ion

CID

m/z

y1 y2

y₃ y4

MS/MS spectrum H₂N-CH-C

O N-CH--C

O H

N---CH-C O H

N-CH-C O H

N-CH-C-OH O H

y₁ y₂ y₃ b₁

y₄

b₂ b₃ b₄ a2

z₃ x₃

c2

(5)

Peptide

Peptide質量指紋質量指紋(PMF) (PMF)

(6)

質譜輸出之電子化數據質譜輸出之電子化數據

PKL檔在一般電腦的作業系統中並無開啟它的軟體，但是在微軟出品的Windows作業系統下可用Notepad開啟瀏覽。

本單元我們將以Waters公司生產的MALDI-Q-TOF為例說明。

質譜分析結束後，經由軟體運算整理後可得到兩種格式的檔案，一為副檔名為txt的文字文件，一為副檔名為pkl 的PKL檔案。

文字文件記載著偵測到的各種質量的peptide及其訊號強度數質。

PKL檔記載著偵測到的各個 peptide經碎裂後的逢機斷片質量資訊。

訊號強度數值質量電荷比(m/z)

接著將文子文件內數字與右下方的peptide質量指紋圖比照，可發現訊號最強的peptide為1396Da ，而其同一根peak又標示有另兩組1396點多的數字，

此乃自然界存在之同位素所造成，在此請忽略此差異之後的計算將以無同位素的理論值運算。

質譜輸出之電子化數據質譜輸出之電子化數據

打開文字文件後，我們可以看到如右上圖所列，左邊顯示的為peptide質荷比，但是在以MALDI為游離源的系統中所帶電荷均為+1 ，因此右上圖左邊所列的數字也可說是質量，至於右邊所列的為所累積的訊號強度。

訊號強度數值母

離子及逢機斷片質荷比

質譜輸出之電子化數據質譜輸出之電子化數據

以Notepad開啟瀏覽PKL 檔。

開啟後可見訊號強度最強的1396Da母離子及其逢機斷片或稱為子離子，列於所有資料的第一筆。

最右邊的質譜圖下方紅色的為含有1396Da peptide的peptide質量指紋圖之部份，上方綠色的為1396Da peptide及其子離子的質譜圖。

Databank search Databank search

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(7)

MASCOT

MASCOT 搜尋引擎搜尋引擎

右圖為

matrixscience.com 的數據處理流程。

右圖中的Peak List即代表我們先前說明的文字文件檔案及PKL 檔案。

Matrixscience網站會將質譜輸出的Peak List轉換成Mascot 輸入檔案後轉入 Mascot Serach Engine ，然後與全球的蛋白質序列資料庫比對，最後將所得結果反推回質譜型態之數據或將資訊轉給特定的實驗室管理系統LIMS。

實際操作實際操作

首先進入網址

http://www.matrixscience.com/

點選MASCOT

Peptide質量指紋鑑定(PMF) Peptide質量指紋鑑定 Peptide 質量指紋鑑定

(8)

Peptide

Peptide質量指紋鑑定質量指紋鑑定

Your name及E-mail的部份請詳實填寫。

Search title的部份可以不填。

Database的部份請選取 SwissProt， SwissProt是一般最常使用之資料庫。

Allow up to_missed cleavage的部份選取 1，這個部份是預測 Trypsin可能有漏切的現象。

Peptide

Peptide質量指紋鑑定質量指紋鑑定

Taxonomy則選擇分析樣品的生物物種來源或選擇All entries作全盤的搜尋。

Enzyme的部份則選擇Trypsin，因為接下來的範例是使用 Trypsin作水解反應。

zFixed modifications 是指對蛋白質上已知一定存在的修飾本範例不作任何選擇。

zVariable modifications 是指不一定但可能會有的修飾在本範例中必須選擇兩種一為 Carbamidometyl(C)這是在氧化還原反應時由環還原劑 IAA (Iodoacetamide)所造成的另一個是Oxidation(M) 這是一般膠內水解或多或少都會對氨基酸 Methionine所造成的修飾

z由選單中選擇兩種以上選項時只要按住電腦

Peptide

Peptide質量指紋鑑定質量指紋鑑定

zProtein mass因望往往都無法肯定分析前完整蛋白質精確質量所以不作任何設定。

zPeptide tol.±是質譜儀的誤差範圍，這裡我們選擇50ppm 。 zMass values選擇 MH⁺，因為以 MALDI為游離源的系統中所帶電荷均為 +1 。

z點選 Monoisotopic 。 z按下瀏覽選取本地端電腦內的文字文件檔案。

z點選Start Search Peptide質量指紋鑑定

(9)

z右圖是搜尋結果之部份。

z圖表Probability Based Mowse Score中綠色區域代表可信度較低的搜尋結果，而綠色區域以外有一支分數101 分的有效搜尋結果，可對應到下方身份號碼P24142號的蛋白質。

z點選P24142檢視氨基酸序列。

Peptide質量指紋鑑定

z右圖是搜尋結果之部份。

z點選P24142檢視氨基酸序列資訊。

Peptide質量指紋鑑定

Peptide定序鑑定

z接下來我們要分析peptide定序鑑定所以點選MS/MS Ion Search

Peptide定序鑑定 z右圖紅色虛線框選之部份設定同 peptide質量指紋之設定在此我們不再描述。

zProtein mass因望往往都無法肯定分析前完整蛋白質精確質量所以不作任何設定。

zICAT在此範例不選，詳細解說請請參考工業技術研究院生物醫學工程中心陳頌方講師的蛋白質體學概論。

(10)

Peptide定序鑑定

zPeptide tol.±與 MS/MS tol.±均與質譜誤差範圍相關，本範例則選擇Peptide tol.±50ppm與MS/MS tol.±0.25Da 。 zPeptide charge請選擇+1 ，因為以 MALDI為游離源的系統中所帶電荷均為 +1 。

z點選 Monoisotopic 。 z按下瀏覽選取本地端電腦內的PKL檔案。

zData format 點選 Micrromass(.PKL) 。

Peptide定序鑑定

zInstrument則選擇本次所使用的質譜儀種類MALDI-QUAD- TOF 。

zPrecursor可設定欲搜尋之特定母離子之質量，在此我們則不作任何設定。 z點選Start Search。

Peptide定序鑑定 z右圖是搜尋結果之部份。

z紅色虛線框選之部份代表六個有被挑選進行碎裂而定序之peptide ，點選後可檢視定序相關資訊。

(11)

蛋白質身份鑑定蛋白質身份鑑定蛋白質身份鑑定

Databank Databank

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(12)

蛋白質氨基酸定序蛋白質氨基酸定序

蛋白質的定序方法不外乎Sanger’s method、Edman degradation、Protein peptide sequenator………等，但是這些方法有些限制例如：蛋白質的量要夠（2D gel來源經常不夠）、不能有太大或完全不能有轉譯後修飾……等，因此在只想鑑定Protein ID而不需完整定序的要求下質譜似乎是快速又經濟的選則，以下所題到的蛋白質定序皆是指以質譜的方式。

DNA與蛋白質取得質量指紋比較 DNA 與蛋白質取得質量指紋比較

DNA sequence Protein sequence Restriction enzyme Trypsin

電泳電泳 MASS MASS

得到完整map 得到完整 map 得到非常不完整得到非常不完整 map(可能不到 map( 可能不到 1/2) 1/2)

為什麼為什麼? ?

影響

影響Peptide Peptide游離效果的因素游離效果的因素

z20種氨基酸的排列組合導致

^，

特別是陰電性氨基 iii酸比例高時

z轉錄後修飾(磷酸化

^、

醣基化…………..等)

z離子源的選用及質譜儀的設定及規格

z其他

(13)

Peptide

Peptide游離的實際狀況描述游離的實際狀況描述

Trypsin Trypsindigestdigest

Mass Analysis Mass Analysis

MS/MS result MS/MS result RAAL(or

RAAL(orI)G??YT???MNKI)G??YT???MNK

不完全的游離

Databank search Databank search

Actual Sequence :

Actual Sequence : RAAIGCDYTHQEMNKRAAIGCDYTHQEMNK

Actual Sequence : LQSIGTENTEENRR Best Candidate : RPESSQESLTSRNR

PepSeq – Peptide sequencing

Sequencing results from MS-MS of m/z 841.5

(14)

資料庫的來源資料庫的來源

完全的蛋白質氨基酸定序

完全的蛋白質氨基酸定序有技術上有技術上的困難的困難

基因體全定序基因體全定序

現階段不可行現階段不可行

生物資生物資訊演算

訊演算演算出的氨基酸序列演算出的氨基酸序列

演算方式演算方式

z直接由DNA上一段預測的open reading fram z文獻發表過的mRNA或cDNA

z研究已解出的蛋白質

由基因體資訊來源資料庫的問題由基因體資訊來源資料庫的問題

z很難考慮轉錄後修飾的問題（2DE上MW、PI與預測不同）

zOpen reading fram來源序列在真核生物上，因沒考慮RNA splicing的問題所以導致PMF data 不可信，只能依靠MS/MS （2DE上MW、PI與預測不同）

z即使氨基酸序列來自mRNA ，於真核生物中因一

個基因可能有數種RNA splicing form ，所以往往可

於2DE的不同位置上測得同樣ID的蛋白質

(15)

Neurofilament triplet L protein (P19527)

Heat shock cognate 71 kDa protein (P63018)

Serum albumin precursor (P02770)

Vimentin (P31000)

Peripherin(P21807)

Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin) (P60711)

Aldose reductase (P07943)

pH4 pH7

14kD 66kD

45kD

30kD

20kD Splicing forms or modification?

實例實例實例實例

Selected spots from 2-D gel identified by MALDI-Q-TOF and SwissProt database search

Spot Peptide sequence (MS/MS) Protein name Accession no.

(P63018) ssp4701

ssp4702

ssp4703

ssp5701

ARFEELNADLFR TVTNAVVTVPAYFNDSQR

Heat shock cognate 71 kDa protein (P63018)

ARFEELNADLFR

Heat shock-related 70 kDa protein 2(Testis-specific) Heat shock cognate 71 kDa protein

(P14659)

ARFEELNADLFR (P63018)

Heat shock-related 70 kDa protein 2(Testis-specific) Heat shock cognate 71 kDa protein

(P14659)

ARFEELNADLFR (P63018)

Heat shock-related 70 kDa protein 2(Testis-specificHeat shock cognate 71 kDa protein) (P14659)

ssp3406 ssp3513 ssp4506 ssp1301 ssp1302

Vimentin (P31000)

ISLPLPNFSSLNLR

Vimentin (P31000)

ISLPLPNFSSLNLR

Vimentin (P31000)

ISLPLPNFSSLNLR

Vimentin (P31000)

ISLPLPNFSSLNLR

Vimentin (P31000)

ISLPLPNFSSLNLR

MW/pI theoretical

MW/pI experimental 70.8/5.4

69.4/5.4 70.8/5.4

69.4/5.23

69.4/5.28

69.3/5.33

69.2/5.39

53.5/5.0 53.5/5.0 53.5/5.0 53.5/5.0

53.5/5.0 44.4/4.64 44.4/4.68 56.0/5.15 56.0/5.11

56.0/5.20

(16)

Fasta

Fasta 檔案格式檔案格式

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納豆菌食品納豆菌食品

z 枯草桿菌發酵大豆，起源于中國。

z 西元754年，唐代鑒真和尚東渡日本傳經，開始在日本的寺院傳播，其後傳到民間。

z 1053 年，藤原明衡在「新猿樂記」提及納所之豆。

z 大豆煮熟後，用稻草包起來，使其保持一定的溫度，並充分發酵製成

z 每年的7月10日被稱做為「納豆日」。

納豆菌的機能：強力血栓溶解劑

z 溶纖維蛋白（plasmin）: 1987年日本富崎醫科大學的須見洋行教授發現納豆激脢（ Nattokinase ）於胃或腸中都不會失去活性。

z 人体實驗結果發現，納豆可以 : 縮短血栓溶解時間

增加血栓溶解面積增加血栓分解產物。

z 此外，納豆亦可維持血管疏通促進血液循環。

納豆菌的機能：預防高血壓

z 日本帝國女子大學營養學林教授的研究小組進行納豆預防高血壓的實驗發現：

z 遺傳性高血壓的老鼠每天攝入含菌納豆其血壓

平穩正常，反之對照於攝入等量大豆的老鼠則

發現其血壓逐漸升高，而達250mmH

(17)

Nattokinase Nattokinase

z 納豆發酵過程中，枯草桿菌會産生一種絲氨酸蛋白酶。

z 等電點是8.7；分子量是25000。

z 具有很強的纖維蛋白溶解能力。

z 並具有彈性酶和尿激酶活性。

z 在自然狀態下較穩定：在胃或腸中都不會失去活性。

z 命名為納豆激酶 ( Nattokinase )。

(18)

(19)

(20)

http://bbsc.imb.sinica.edu.tw/services/course/PyMOL.pdf

http://bbsc.imb.sinica.edu.tw/services/course/swisspdb.pdf http://203.68.17.101/MK/NCBI%20Part1.ppt

http://www.expasy.org/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html

http://swissmodel.expasy.org/

http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/static.do?p=download/web_download/index.html

http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank/

http://string.embl.de/

補充教材

好用的網站

Chronic constriction injury (CCI)

CCI site

0202

Neuropathic pain (CCI) model

Chronic constrictive injury of the right common sciatic nerve was performed, according to the method described by Bennett and Xie (1988). Briefly, the rat’s right common s c i a t i c n e r v e w a s e x p o s e d a n d a 5 m m l o n g n e r v e s e g m e n t w a s then dissected. Four loose ligatures (4-0

chromic gut) were made around the sciatic nerve with a 1 mm interval between each of them. .

Proteomic research

Pathway algorithm

06

Spinal cord sample for 2-D electrophoresis

Neurofilament triplet L protein (P19527)

Heat shock cognate 71 kDa protein (P63018)

Serum albumin precursor (P02770)

Vimentin (P31000)

Peripherin(P21807)

Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin) (P60711)

Aldose reductase (P07943)

pH4 pH7

14kD 66kD

45kD

30kD

20kD

Control Control

Splicing forms or modification?

IEF was performed by using ready-cast IPG strips (pH4–7,18 c m ; G E H e a l t h c a r e ) . S e c o n d - dimensional electrophoresis was p e r f o r m e d b y u s i n g 1 2 . 5 % polyacrylamide.The gels were scanned by Molecular Imager FX(Bio-Rad). Image analysis was using PDQuest7.3 software(Bio- Rad).Six well-separated gels of each sample were used to create

“replicate groups” . Statistic and quantitative “analysis sets” were created between control group and CCI group. In the statistic sets, the Student’s t-test and significance level of 95%(P<0.05) and 90%(p<0.1) were chosen. In the quantitative sets, the upper limit and the lower limit were set t o 2 . 0 a n d 0 . 5 ( i n c r e a s e o r decrease 2-fold).Spots displaying reproducible change patterns w e r e c o n s i d e r e d t o b e

12

Aldose reductase P07943

The rate-limiting enzyme for polyol pathway is aldose reductase, which is expressed on lens, prostate, astrocyte, Schwann cells and more.

When intracellular glucose c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e , aldose reductase activity is stimulated and catalyzes the formation of sorbitol. Sorbitol accumulates intracellularly, c a u s i n g c e l l d a m a g e . Furthermore, stress-sensitive signaling pathways including p 3 8 M A P K a n d J N K a r e strongly activated by sorbitol (Endocrine Reviews, October 2002, 23(5):599–622). .

Control CCI

P<0.05:＊＊

downregulationfold change :3 ▼ ▼ ▼

＊＊

▼

(21)

1414

Protein interaction networks were derived using STRING

http://string.embl.de/

ALDOSE REDUCTASE MAP KINASE P38ALPHA

MAP KINASE P38ALPHA

NEUROFILAMENT TRIPLET L PROTEIN VIMENTIN JNK

Erk

1515

Vimentin ▲▼

Heat shock cognate 71 kDa protein ▼

Aldose reductase ▼

Current Opinion in Cell Biology Vol. 11, Issue 2 , April 1999, 211-218

Result summarized in MAP kinase pathway

Neurofilament triplet L protein ▼

?

▲

▼ Inhibition Interaction

Increase Decrease Activation

Chronic Constrictive

injury Chronic Chronic C Constrictiveonstrictive

injury injury

posibility posibility posibility

?

Aldose reductase

p38

Mitogen-Activated Protein Kinase p38 Mediates Reduced Nerve Conduction Velocity in Experimental Diabetic Neuropathy

Interactions With Aldose Reductase

Sally A. Price, Sithiporn Agthong, Alicia B. Middlemas, and David R. Tomlinson

Insulin and aldose reductase

inhibitors can prevent excess

polyol pathway flux, and hence

t h e s e a g e n t s m a y p r e v e n t

NCV(nerve conduction velocity)

deficits by preventing p38 MAP

kinase activation. .

(22)

世界の神経変性疾患治療市場の分析と予測：2005-2009 年

World Neurodegeneratives Disease Markets, 2005-2009

New Developments: Aldose Reductase Inhibitors

糖尿病腎病變

~唐家駿 " 方基存

血糖的控制：根據研究統計顯示，在胰島素依賴型的病人，用胰島素作積極的血糖控制發現可以減緩糖尿病腎病變的進行速度，也可以減緩其他小血管病變的速度（如視網膜病變及神經病變）。另外，也有人嘗試用Aminoguanidine來減少AGE的形成，或使用 Sorbinil藥物經由抑制Aldose reductase的活性，以減少Sorbitol的累積，也都證實可能 是有效的附加治療。

長庚內科通訊

(23)

C14H9N1O4 alrestatin

EXPT00502

C5H9N1O3 n-acetylalanine

EXPT00596

C2H7O2As1 hydroxydimethylarsine

oxide EXPT00823

C6H8O7 citric acid

EXPT00922

C12H10N3O4F1 fidarestat(stereoisomer)

EXPT01436

C12H10N3O4F1 fidarestat(stereoisomer)

EXPT01435

C12H10N3O4F1 fidarestat

EXPT01433

C6H13O9P1 alpha-d-glucose-6-phosphate

EXPT01537

C17H10N2O4F4S1 idd552

EXPT01836

C19H22N2O5S1 inhibitor idd 384

EXPT01819

C21H28N7O17P3 2'-monophosphoadenosine

5'-diphosphoribose EXPT02293

C16H14N1O3F3S1 tolrestat

EXPT03082

C17H11N2O4Br1Cl1F1 [3-(4-bromo-2-fluoro-benzyl)-7-chloro-2,4-

dioxo-3,4-dihydro-2h-quinazolin-1-yl]-acetic acid EXPT03287

C11H9FN2O3 sorbinil

EXPT03309

Chemical Formula Generic Name

Accession No

Ligand binding site

Homology modelling from the human aldose reductase

(PDB ID:1t40A)

RAT HUMAN

Homology modelling from the human aldose reductase

(PDB ID:1t40A) RAT

HUMAN

(24)

Trp20

Try48

His110

Trp111

Phe115 Phe122

Leu300

Cys303

Homology modelling from the human aldose reductase

(PDB ID:1t40A)

RAT HUMAN

Homology modelling of ligand binding site

(PDB ID:1t40A)

RAT HUMAN

Ligand binding site

Homology modelling of ligand binding site

(PDB ID:1t40A)

RAT HUMAN

Trp20

Try48

His110

Phe115 Phe122

Leu300

Cys303

Homology modelling of ligand binding site

(PDB ID:1t40A)

RAT HUMAN

(25)

Mitogen-Activated Protein Kinase p38 Mediates Reduced Nerve Conduction Velocity in Experimental Diabetic Neuropathy

Interactions With Aldose Reductase

Sally A. Price, Sithiporn Agthong, Alicia B. Middlemas, and David R. Tomlinson

Insulin and aldose reductase inhibitors can prevent excess polyol pathway flux, and hence t h e s e a g e n t s m a y p r e v e n t NCV(nerve conduction velocity) deficits by preventing p38 MAP kinase activation. .

系統生物資訊系統生物資訊

全球科學家在辛苦工作了15年後，於2001年發表了人類基因組29億個核甘酸序列的初步圖譜。Celera Genomics與Internationl Human Genome Sequencing Consortium兩個機構出版了各自的基因初步圖譜，但是圖譜中仍然存有一些缺陷。令人驚訝的是，由圖譜估算，

人類約有32,000個基因，其中26,383個是確認的基因，另外的 12,000個則是推測的基因這與先前科學家預做的五到十萬個基因，

兩者間有著極大的差距，因此部分科學家認為，人類的基因數目應該不僅衹於此，他們認為人類的基因數目不會少於25,000個，但是上限可能還有討論的空間。圖譜顯示，人類基因組中雖然僅有1.1％

～1.5％的序列可能會表現蛋白質，但是平均而言，每個基因可以表現3個以上的蛋白質，因此要研究人體的蛋白質組成將是非常艱鉅的挑戰。另外一個現象是，有些區域的單一核甘酸多型性變異

（Single-nucleotide polymorphisms， SNP）機率特別高，有些區域則很低。

在人類基因體序列公佈後,資訊科學與生命科學的合作日益重

要。系統生物學即是以一個整合性的觀點,來研究生物系統中

單元與單元的相互關係。此方面的研究需要處理龐大的資料量

與計算量,故生物資訊學是其不可分割的一部分。

(26)

由大而小，再由小而大的生物學研究

現在我們知道我們無法僅由研究個別的基因、個別的蛋白質來了解整體的生命。真正的生命現象必須由各種基因組、蛋白質組、

mRNA等的整體作用，或其相互間的作用關係才能了解。因此，

我們又必須由小分子生物學研究慢慢進入系統生物學（systems biology）又稱大系統生物學的研究。根據美國科學家胡德

（L﹒Hood 1999）對系統生物學的定義，它是研究一個生物系統中所有組成分，包括基因、mRNA、蛋白質等，以及在特定條件下這些組成分的相互關係。也就是說，系統生物學是一種整合型大科學，它要整合過去垂直型的經典分子生物學研究，例如：採用多種手段研究個別的基因和蛋白質，和現代的水平型研究，即以單一的手段同時研究成千上萬個基因或蛋白質。故系統生物學不只是一種將水平型研究和垂直型研究整合起來，成為一種立體

（三維）的研究，同時也是一種典型的學科交叉研究，它需要生命科學、電腦及計算機科學、數學、生物物理及生物化學等各種學科的學者共同參與

。

至於系統生物學的研究，則是將包括ＤＮＡ、

ＲＮＡ、蛋白質以及蛋白質間的交互作用等資訊，加以整合，並運用這些資料去建立數學計量模型，以期能掌握所有生物基因與組織間的關係及運作。

近年來系統生物學的研究方式可行，主要在於人類基因定序計畫，已經建立人類基因的基本資料庫，加上有許多電腦工具的開發應用，

讓生命科學專家可以運用這些工具，掌握與整合相關的生物資訊。

Future?

•Metabonomics

•Organomics Proteomics

• Function

• Networks

• Modifications

• Expression levels Knowledge

Information Genomics

• DNA

• mRNA

FROM GENOMICS TO PROTEOMICS

(27)

How do we translate complex molecular interactions into therapeutic benefit?

WNT

Cell

ECM

Growth factors (e.g. EGF, amphiregulin TGFα)

Nuclear receptors (e.g. oestrogen) Survival factors

(e.g. IGF1)

Cytokines (e.g. ILs, IFNs)

Death factors (e.g. FasL) Anti-growth factors

(e.g. TGFβ)

GPCR ligands

Frizzled Dishevelled GSK-3β

APC Tubulin

TCF

Integrins

β-Cutenin β-Cutenin:TCF E-Cadherin

CdC42 PI3K Rac

Fak Cas Crk Src

Fyn Shc NF1

RTK Grb2Ras

SOS Ral MEKMAPK MAPK

MEKK PLC

PKCMos MKKs JNKs

ELK

Myc:Max Max:Max

Fos JUN

Abl 7-TMR

CdC42 Rac Rho

G-Prol Ad Cycl PKA CREB

PKC NF-κB

NHR (e.g. ER) NF-κB P13K Akt Akka IKB

? PTEN

Stat 3.5 Stat 3.5

Stat 3.5

Bcl XL Caspase 9 Cytochrome C

Jaks

Bad Mitochondria Bid

Bim, etc.

Abnormality sensor

Bcl-2 Cell Death (Apoptosis) Caspase 8

Fap FADD Bcl-2 Bax ARF

p53

Mitochondria MDM2

DNA damage sensor Cell Proliferation (cell cycle) Changes in Gene Expression

Cycl E:CDK2 p21 p27 E2Fs

Rb p16

Cycl D:CDK+ p15 Smads

RTK

Cytokine R

Decoy R Fas

Surface Ag TGFβR

HPVE7

Hanahan D, Weinberg RA. Cell 2000;100:57–70

Pathway Interaction:

Nitric Oxide links IP

₃

and

cGMP pathways

GMP

cGMP PDE

(-) Viagra

Nobel Prize, 1998

(28)

一氧化氮(nitric oxide，NO)在化學結構上是一種自由基(free radical)，即其外圍電子軌域的電子不成對，它非常不穩定，半衰期只有幾秒鐘。它是空氣污染主要成份，普遍存在於汽車排放的廢氣中，它也是酸雨形成的主要因子。它也是一種神經傳導物質，亦即血管內皮舒張因子 (endothelial-derived relaxing factor ，EDRF)。

Viagra (for erectile dysfunction) 成份及作用原理

1.Viagra(Sildenafil citrate) 是剛於1998年3月27日美國食品及藥物管理局(FDA)所批准上市的處方藥(必須由醫師處方才可使用). 也是 FDA批准的第一種治療陽萎的藥品.

2.Viagra(Sildenafil citrate) 的化學成份為:1-[[3-(6,7-dihydro-1-

methyl-7-oxo-3-propyl-1H-pyrazolo [4,3-d]pyrimidin-5-yl)-4-

ethoxyphenyl]sulfonyl]-4-methylpiperazine citrate. 3.Viagra的作

用原理當性興奮時, Viagra能在陰莖內的海綿體產生Nitric oxide(簡

稱NO), NO 能活化guanylate cyclase, 進而增加cyclic guanosine

monophosphate (簡稱cGMP) 的產生, cGMP能使海綿體的平滑肌

鬆弛, 平滑一肌鬆弛, 大量的血液就會注入海綿體而使陰莖勃起.

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

當男性受到性刺激時，性衝動引起的電波傳到陰莖海綿體內，其內的nonadrenergic noncholinergic(NANC)的神經元及海綿體肌肉的內皮細胞(endothelial cells)就會釋放出氧化氮(NO)，使細胞內的催化酵素—(Guanylate cyclase)產生作用，將(GTP)轉化為 (cGMP)，這種化學產物會讓陰莖海綿體的肌肉鬆弛，血管擴張使血液大量湧入引起勃起反應。男性只要持續受到性刺激，便會不斷地分泌出cGMP，但同時，陰莖海綿體細胞會分泌另一種酵素5(PDE 5)，這種酵素會摧毀cGMP使它轉變成為不具活動性的 (GMP)，使陰莖勃起消退，結果是消長維持均衡，使陰莖保持勃起

Endothelial Cells

NO NANC cells

GTP

GMP

Guanylate Cyclase (s,p)

Phosphodiesterase - 5

cGMP ^relaxation

Erection

↓ Ca2+

corpora smooth muscle cell

PKG

ATP

(35)

PDE5 inhibition in erectile dysfunction

Endothelial Cells

NO NANC cells

GTP

GMP

Guanylate Cyclase

Phosphodiesterase - 5

cGMP ^relaxation Improved

Erection

↓ Ca2+

corpora smooth muscle cell

Sildenafil

PKG

ATP

Phosphodiesterases (PDEs)

Phototransduction Retina

PDE6

penile detumescence, vasodilation, plt inhib.

Corpus cav, vascular smooth muscle, plts PDE5

airway dil, inhibition, CNS modulation kidney, sm/sk muscle,

heart, lung lymphocyte PDE4

+ inotropy, vascular and airway dilation, plt

inhibition Corpus cav, sm heart,

sm muscle, plt, kidney, liver PDE3

unknown brain, heart , corpus

cav, sm/sk muscle, adr PDE2

CNS modulation, vasoliation brain, heart, peripheral

nerves, sm/sk muscle liver, kidney PDE1

Assumed Role Tissue

Isoform

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

5’GMP

alignment with

VIAGRA

(42)

訊號強度

Introduction Introduction

中央研究院

蛋白質體研究核心設施

ProteinLynx

Global SERVER export to PDQuest Annotation Tools

PDQuest Annotation Tools

C L I C

K

Proteomics

MALDI

MALDI - - Q Q - - TOF TOF

中央研究院

蛋白質體研究核心設施

Peptide CHCA

Peptide結晶 結晶

樣品上機 樣品上機

質量電荷比(m/z)

訊號強度

Peptide

Peptide質量指紋 質量指紋(PMF) (PMF)

質量電荷比(m/z)

訊號強度

Peptide

Peptide質量指紋 質量指紋(PMF) (PMF)

訊號強度

質量電荷比(m/z)

Peptide Peptide定序 定序

MS/MS of peptide for sequence information MS/MS of peptide for sequence information

Peptide

Peptide質量指紋 質量指紋(PMF) (PMF)

質譜輸出之電子化數據 質譜輸出之電子化數據

質譜輸出之電子化數據 質譜輸出之電子化數據

質譜輸出之電子化數據 質譜輸出之電子化數據

Databank search Databank search

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蛋白質體研究核心設施

MASCOT

MASCOT 搜尋引擎 搜尋引擎

實際操作 實際操作

Peptide質量指紋鑑定(PMF) Peptide質量指紋鑑定 Peptide 質量指紋鑑定

Peptide

Peptide質量指紋鑑定 質量指紋鑑定

Peptide

Peptide質量指紋鑑定 質量指紋鑑定

Peptide

Peptide質量指紋鑑定 質量指紋鑑定

蛋白質身份鑑定 蛋白質身份鑑定 蛋白質身份鑑定

Databank Databank

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蛋白質體研究核心設施

蛋白質氨基酸定序 蛋白質氨基酸定序

DNA與蛋白質取得質量指紋比較 DNA 與蛋白質取得質量指紋比較

電泳 電泳 MASS MASS

得到完整map 得到完整 map 得到非常不完整 得到非常不完整 map(可能不到 map( 可能不到 1/2) 1/2)

為什麼 為什麼? ?

影響

影響Peptide Peptide游離效果的因素 游離效果的因素

z20種氨基酸的排列組合導致

特別是陰電性氨基 iii酸比例高時

z轉錄後修飾(磷酸化

醣基化…………..等)

z離子源的選用及質譜儀的設定及規格

z其他

Peptide

Peptide游離的實際狀況描述 游離的實際狀況描述

Sequencing results from MS-MS of m/z 841.5

資料庫的來源 資料庫的來源

完全的蛋白質氨基酸定序

完全的蛋白質氨基酸定序 有技術上 有技術上 的困難 的困難

基因體全定序 基因體全定序

現階段不可行 現階段不可行

生物資 生物資 訊演算

訊演算 演算出的氨基酸序列 演算出的氨基酸序列

演算方式 演算方式

z直接由DNA上一段預測的open reading fram z文獻發表過的mRNA或cDNA

z研究已解出的蛋白質

由基因體資訊來源資料庫的問題 由基因體資訊來源資料庫的問題

z很難考慮轉錄後修飾的問題（2DE上MW、PI與預 測不同）

zOpen reading fram來源序列在真核生物上，因沒 考慮RNA splicing的問題所以導致PMF data 不可 信，只能依靠MS/MS （2DE上MW、PI與預測不 同）

Peptide結晶結晶

樣品上機樣品上機

Peptide質量指紋質量指紋(PMF) (PMF)

Peptide質量指紋質量指紋(PMF) (PMF)

Peptide Peptide定序定序

Peptide質量指紋質量指紋(PMF) (PMF)

質譜輸出之電子化數據質譜輸出之電子化數據

質譜輸出之電子化數據質譜輸出之電子化數據

質譜輸出之電子化數據質譜輸出之電子化數據

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實際操作實際操作

Peptide質量指紋鑑定質量指紋鑑定

Peptide質量指紋鑑定質量指紋鑑定

Peptide質量指紋鑑定質量指紋鑑定

蛋白質身份鑑定蛋白質身份鑑定蛋白質身份鑑定

蛋白質氨基酸定序蛋白質氨基酸定序

電泳電泳 MASS MASS

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為什麼為什麼? ?

影響Peptide Peptide游離效果的因素游離效果的因素

Peptide游離的實際狀況描述游離的實際狀況描述

資料庫的來源資料庫的來源

完全的蛋白質氨基酸定序有技術上有技術上的困難的困難

基因體全定序基因體全定序

現階段不可行現階段不可行

生物資生物資訊演算

訊演算演算出的氨基酸序列演算出的氨基酸序列

演算方式演算方式

由基因體資訊來源資料庫的問題由基因體資訊來源資料庫的問題

z很難考慮轉錄後修飾的問題（2DE上MW、PI與預測不同）

zOpen reading fram來源序列在真核生物上，因沒考慮RNA splicing的問題所以導致PMF data 不可信，只能依靠MS/MS （2DE上MW、PI與預測不同）

實例實例實例實例

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納豆菌食品納豆菌食品

z 西元754年，唐代鑒真和尚東渡日本傳經，開始在日本的寺院傳播，其後傳到民間。

z 1053 年，藤原明衡在「新猿樂記」提及納所之豆。

z 大豆煮熟後，用稻草包起來，使其保持一定的溫度，並充分發酵製成

z 每年的7月10日被稱做為「納豆日」。

z 溶纖維蛋白（plasmin）: 1987年日本富崎醫科大學的須見洋行教授發現納豆激脢（ Nattokinase ）於胃或腸中都不會失去活性。

增加血栓溶解面積增加血栓分解產物。

z 日本帝國女子大學營養學林教授的研究小組進行納豆預防高血壓的實驗發現：

系統生物資訊系統生物資訊

兩者間有著極大的差距，因此部分科學家認為，人類的基因數目應該不僅衹於此，他們認為人類的基因數目不會少於25,000個，但是上限可能還有討論的空間。圖譜顯示，人類基因組中雖然僅有1.1％

～1.5％的序列可能會表現蛋白質，但是平均而言，每個基因可以表現3個以上的蛋白質，因此要研究人體的蛋白質組成將是非常艱鉅的挑戰。另外一個現象是，有些區域的單一核甘酸多型性變異