正十六烷之生物降解與生物復育實驗

正十六烷生物復育實驗的流程與各項測定

(1) 將 3.2.1 節中配置好的液態礦物培養基 (pH=7) 取 100 mL 倒入 250 mL 錐形 瓶，此時錐形瓶中依照不同實驗條件可能置入不同孔徑大小及不同折角的篩 網。

(2) 接著置入滅菌釜以 121℃、15 psi 的條件下滅菌 20 分鐘。待其冷卻並噴灑 75%酒精後置入無菌操作台，滅菌後的液態礦物培養基 pH 值會降至 6.8。

(3) 以酒精燈將錐形瓶口殺菌後，依照實驗條件以微量滴管加入 200 μL 的正十 六烷及5 mL 的 NTU-1 液態礦物培養基菌液，此時初始 NTU-1 細胞量 OD600

值約為0.05 (初始細胞密度約 0.035g/L)。

(4) 完成植菌動作後同樣以酒精燈將瓶口殺菌，並以 parafilm 封住瓶口。接著依 不同實驗條件將培養錐形瓶放入往復式恆溫震盪水槽或是迴旋式恆溫培養 箱中，以溫度30℃、轉速 100 rpm 的條件進行培養。

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(5) 實驗進行至 20、32、44、56 及 68 小時後，取出幾瓶錐形瓶停止培養，拍照 記錄細胞生長外觀的變化，並進行培養基酸鹼值的測量。

(6) 若培養過程中 NTU-1 產生細胞聚集現象，則利用 60 mesh 的濾網 (孔徑大小：

0.246 mm) 進行菌塊與培養基液體的分離，並量測培養基液體的 pH 值。分 離後的菌塊以去離子水加入至初始反應體積100 mL。

(7) 完成分離及 pH 值量測後，每組錐形瓶中加入 30 mL 的乙酸乙酯進行殘餘培 養基或細胞顆粒內包覆正十六烷的萃取，同時也加入100 μL 的正十二烷作 為GC 氣相層析儀量測的內標準品。

(8) 接著用不透氣矽膠塞將瓶口塞住並以 parafilm 密封後，均勻的搖晃以混合水 相及有機相，接著放入30℃的培養箱中靜置萃取，約 2 個小時後取出上層 有機相溶液2 mL 加入微量試管中保存。若沒有要馬上利用 GC 量測的話，

可存放至－20℃冰箱中，以避免有機相揮發過快造成日後量測上的誤差。

(9) 萃取且完成保存有機相溶液的步驟後，利用烘乾後的濾紙 (ADVANTEC GF-75, 厚度：0.35 mm, 孔徑大小：0.3 μm) 進行抽氣過濾，使細胞留在濾 紙上，過濾完成後將濾紙放入80℃烘箱中約 24 小時，待其乾燥後取出置放 於室溫下1 小時回溫並秤重，測得的重量再減去初始濾紙重則可得到 NTU-1 細胞乾重，並可換算成細胞密度。

(10) 步驟 (8) 中保存於微量試管的萃取液以微量注射針取出 2 μL，利用氣相層 析儀 (GC) 分析正十六烷的含量。將積分軟體所顯示的波峰面積對照校正曲 線，經過換算可得不同培養時間及實驗條件下的培養基殘餘及NTU-1 細菌 結塊中正十六烷的量。

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0 5000 10000 15000 20000 25000

0 500 1000 1500 2000

n-Hexadecane (ppmV, V/V)

Integration value y = 0.09884x

R2= 0.9995 正十六烷校正曲線

(1) 利用微量滴管取 50、100、150、200 μL 的正十六烷 (n-hexadecane) 各加入 含100 mL 礦物培養基的錐形瓶中，同時各加入 100 μL 的正十二烷

(n-dodecane) 作為內標準品。

(2) 取 30 mL 的乙酸乙酯 (ethyl acetate) 分別倒入錐形瓶中，並以矽膠塞密封。

均勻搖晃後置放於30℃下進行萃取， 2 小時後取出上層有機液約 2 mL 存 放於微量試管中。

(3) 以微量注射針取出 2 μL 溶液並以氣相層析儀進行分析正十六烷的含量，將 積分面積與濃度作圖可即可得到正十六烷的校正曲線，如圖3.3.3-1。

圖3.3.3-1 正十六烷在氣相層析儀中之校正曲線

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氣相層析儀之條件設定

 型號： Perkin Elmer Autosystem

 管柱： 填充物材質 fused silica capillary column、管長 30 m、內直徑 0.53 mm、

填充物膜厚0.25 μm。

 偵測器：FID

 氣體流量：空氣 450 mL/min、氫氣 45 mL/min

 載運氣體 (carrier gas)：氮氣 5 mL/min

 爐溫 (oven temperature) 變化：起始溫度 80℃，停留 2 分鐘後以 40℃/min 的速率升溫至280℃後停留 2 分鐘。

 注入器溫度 (injector)：250℃

 偵測器溫度 (detector)：300℃

 積分軟體：ABDC Chrommanager Multisystem 層析總管，立行科技有限公司