冷凍乾燥時保護劑的添加

由上一小節我們知道冷凍及乾燥的步驟對於微生物可能會造成傷害，而其他 影響冷凍乾燥後細胞存活率的因素還有微生物生長條件 (Palmfeldt and

Hahn-Hagerdal 2000)、初始菌體濃度 (Bozoglu et al. 1987)、保護劑種類 (De Valdez et al. 1983)、復水條件 (Sinha et al. 1982)。其中以保護劑的種類對於微生 物冷凍乾燥後的存活率影響最為顯著 (Zhao and Zhang 2005)。

許多微生物若只加入去離子水或緩衝溶液並進行冷凍乾燥，存活率大多不高，

例如 Lactobacillus brevis 及 Oenococcus oeni 加入磷酸鹽緩衝溶液後進行冷凍乾 燥後的存活率只有8.7%及 7.2%，若加入 10%海藻糖為保護劑時，存活率可提高 到56.8%及 40.2%(Zhao and Zhang 2005)。因此，保護劑的添加對於微生物冷凍 乾燥後存活率多寡扮演著重要的角色。保護劑的種類很多，而保護的效果也會隨 著菌株的不同而有所差異 (De Valdez et al. 1983)。一般來說，一個好的保護劑必 須有以下的特點：提供微生物在低溫冷凍及乾燥時良好的保護、無毒性、容易乾 燥、凍乾後容易溶解、貯存時能維持其穩定性。表2.7.1.2-1 為一些保護劑的選擇 使微生物在冷凍乾燥及貯存的過程中能維持高存活率。

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表2.7.1.2-1 使微生物在冷凍乾燥及貯存的過程中仍可維持高存活率的保護劑選 擇 (LAB: lactic acid bacteria) (Carvalho et al. 2004)。

接下來將針對常見保護劑的種類及保護機制作個介紹：

(1) 糖類：

糖類又可分為單糖 (如葡萄糖、果糖)、雙糖 (如蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻 糖) 及多糖類 (如聚乙二醇、麥芽糊精)。其中又以雙糖類的蔗糖及海藻糖對大部 分菌株保護的效果最好 (Rudolph and Crowe 1985, Leslie et al. 1995, Morgan et al.

2006)。目前糖類的保護機制主要可分為以下兩種假說。

 水替代假說：由於糖類表面含有大量氫氧基 (－OH)，在凍乾過程中糖類的 氫氧基可與細胞膜上蛋白質中的極性基團形成氫鍵，進而代替蛋白質極性基 團周圍的水分子，使蛋白質表面形成一層水化膜，可避免氫鍵連接位置曝露 於環境中，穩定蛋白質的結構和功能，因而不會在冷凍及乾燥失水的情況下 變性 (Leslie et al. 1995 , 徐致遠等 2006)。此外，糖類的氫氧基也能與水分

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子結合，避免細胞內外冰晶的產生 (Burke 1986)。

 玻璃態假說：含足夠濃度的糖溶液在乾燥過程中，糖類不會形成結晶，而會 形成玻璃態的糖-水混合物。此狀態下，物質兼有固體及流體的行為，黏度 高，且分子擴散係數低，因而具有黏性的保護劑會包圍在蛋白質分子周圍，

形成一種結構上與冰相似的碳水化合物玻璃體，可維持蛋白質的三級結構，

進而達到保護作用。研究指出，單糖、雙糖、多氫氧基化合物及結構蛋白質 皆能有玻璃化行為，只是玻璃轉化溫度各不相同 (Israeli et al. 1993)。

(2) 多元醇：

包含甘露糖醇、山梨醇、木糖醇…等。多元醇表面具有 5 個以上的氫氧基，

能與微生物表面的自由基作聯結，也可與膜上蛋白質形成氫鍵取代水，維持蛋白 質的穩定性 (Moriche 1970, Hanafusa 1985)。Efiuvwevwere 等學者的研究發現乳 酸菌的冷凍乾燥中以甘露糖醇為保護劑的存活率較高 (Efiuvwevwere et al. 1999)。

Carvalho 等學者則發現，山梨醇能冷凍乾燥過程中提供 L. plantarum 及 L.

rhamnosus 很好的保護 (Carvalho et al. 2002)。

(3) 胺基酸及蛋白質：

谷氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、天門冬氨酸及酵母萃取物…等是胺基酸中常被 用來當作保護劑的物質。胺基酸的保護機制被認為是胺基酸上的胺基 (amino group) 與菌體蛋白質上的羧基 (carboxyl groups) 能產生反應，穩定了蛋白質結 構(Moriche 1970)。然而 Font de Valdez 等學者指出，半胱氨酸 (Cystene) 的保護 機制主要是避免蛋白質上的硫醇基 (SH groups) 氧化 (De Valdez et al. 1983)。

蛋白質類的保護劑主要有脫脂奶粉，其對於微生物的保護效果已被許多研究 證實 (Carvalho et al. 2002, Abadias et al. 2001)。脫脂奶粉溶於水中易形成過冷狀 態的溶液，使溫度在凝固點以下時溶液中溶質濃度較小，蛋白質較不易變性，且 脫脂奶粉中的乳清蛋白可在細菌表面形成蛋白膜、固定冷凍乾燥後膜上的蛋白質，

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避免菌體的曝露及傷害 (Champagne et al. 1991)。

(4) 其他物質：

其他常被用來作為冷凍乾燥的保護劑還有抗壞血酸 (ascorbic acid)、谷胺酸 鈉 (monosodium glutamate) (Teixeira et al. 1995)、谷胺酸鹽、檸檬酸、維生素 C…

等。