第四章 實驗結果與討論
4.2 以 NB 培養的 NTU-1 冷凍乾燥後細胞存活率及降解包覆能力探討
4.2.2 以 NB 培養的 NTU-1 經過冷凍乾燥後對於正十六烷降解及包覆能力
接下來的實驗將討論經過冷凍乾燥後的NTU-1，對正十六烷的生物降解及 包覆能力是否會受到影響。由於4.2.1 節中發現利用 NB 培養的 NTU-1 在選擇正 確的保護劑並進行冷凍乾燥後仍然具有相常高的存活率，由菌落形態也可以看出 其與初始的菌落形態並沒有差異，如照片4.2.2-1 所示。故推測 NTU-1 的細胞生 理特性應該不會因為冷凍乾燥的這個步驟而受到影響或改變。為了確定此項推論，
我們測試以1%麥芽糖作為 NTU-1 冷凍乾燥的保護劑，並在冷凍乾燥後來進行正 十六烷生物復育實驗，探討其生物降解及包覆的效果為何。
(A) (B)
照片4.2.2-1 以 1%麥芽糖為保護劑不同條件下的菌落形態。(A) 初始 NTU-1 菌 落形態；(B) 冷凍乾燥的 NTU-1 進行復水後的菌落形態。
實驗條件如下：
培養基 pH 值：7 6.8 (滅菌後)
培養基正十六烷濃度：2000 ppmv
培養基體積：100 mL
培養溫度：30℃
篩網孔徑大小：10 mesh (1.7 mm)
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篩網折角：180°
培養箱及轉速：迴旋式恆溫培養箱 100 rpm
初始植菌量：1%麥芽糖為保護劑冷凍乾燥後的 NTU-1，以初始體積 5 mL MSM 礦物培養基進行復水後，測得初始濃度：9 × 108 CFU/mL。
存放條件：－20℃下，10 天
分析時間點：20、32、44、56、68 hr
接下來觀察討論實驗中培養基酸鹼值變化，細胞生長曲線、正十六烷生物降 解量及總移除效率。實驗結果以圖4.2.2-1 ~ 4 表示。由圖 4.2.2-1 可以看出培養 基內的酸鹼值一樣會隨著時間的增加而下降，到達第44 小時以後即為持在 4 左 右，主要的原因與4.1 節中所討論的一樣，因為在 32 ~ 44 小時間，NTU-1 即形 成結塊並把未降解的正十六烷給包覆起來且此時pH 值已下降到 4 左右，不利 NTU-1 繼續生長，而使培養基酸鹼值維持在 4 附近。
由NTU-1 生長曲線圖 4.2.2-2 可觀察到隨著時間的增加，NTU-1 的細胞密度 也會增加，不過可看到NTU-1 細胞密度在第 32 小時後即長到 0.3 g/L，且開始呈 現持平的趨勢。推測這是因為在這一組實驗下，初始的植菌密度 (0.065 g/L) 相 對於4.1.2.1 節 (約 0.035 g/L) 中高，而培養基中含有保護劑麥芽糖可作為 NTU-1 的另一個碳源，故細胞生長速率較快，且在第35 小時左右即會形成細菌結塊，
因而NTU-1 細胞密度約在第 32 小時候即呈現持平的狀態。
接著探討圖4.2.2-3 正十六烷的生物降解量，圖中可以看到 NTU-1 降解正十 六烷的情形與4.1.2.1 節中以液態 NTU-1 植菌液作為菌種來源的趨勢差不多。在 形成結塊後，正十六烷的降解速率即開始趨緩，到達第68 小時約可降解掉 600 ppmv。
最後將實驗中的正十六烷生物降解量及包覆量匯集成圖4.2.2-4，由此圖也可 看出正十六烷的移除效果在第44 小時以後即可達到 95%以上，在第 68 小時約可 以降解掉600 ppmv 及包覆 1380 ppmv 的正十六烷。這樣的結果顯示，以 NB 培
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Incubation Time (hr)
0 12 24 36 48 60 72
Cell Density (g/L)
Incubation Time (hr)
養的NTU-1 在經過冷凍乾燥且存放的步驟後，其生物降解及包覆的能力皆不會
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Incubation Time (hr)
0 12 24 36 48 60 72
Incubation Time (hr) Biodegradation
Trapped C16
圖4.2.2-3 培養條件 30℃、迴旋式搖晃培養 100 rpm、初始 pH 值 6.8，培養基中
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4.2.3 討論
大部分的文獻指出，海藻糖及蔗糖為糖類中最佳的保護劑，使菌株在冷凍乾 燥後仍維持很高的存活率 (Berny and Hennebert 1991, Morgan et al. 2006)。而本 實驗中採用的保護劑為實驗室現有的藥品，且由實驗結果發現以麥芽糖為保護劑 也可提供NTU-1 相當的保護性。另外實驗發現以去離子水加入 NTU-1 並進行冷 凍乾燥，存放於－20℃下經過 30 天以後，NTU-1 仍維持約有 70%的存活率，顯 示NTU-1 本身的抗冷凍及抗乾燥的能力很強，主要可能是跟其細胞表面的特性 有關，其為革蘭氏陽性且表面具有分枝酸 (mycolic acid) 的放線菌。在存放溫度 方面，貯存於－20℃下的環境 NTU-1 存活率最高。
並由4.2.2 節實驗證實，NTU-1 在經過冷凍乾燥後，其生物降解及包覆烷類 的能力並不會受到影響，故我們可以利用冷凍乾燥的方法來進行NTU-1 (NB 培 養) 的保存，使其能在長時間貯藏下仍具有其生理特性。而接下來也將探討冷凍 乾燥對於以正十六烷培養形成的NTU-1 細菌結塊的影響，進一步研究其對於正 十六烷生物復育的應用。
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