第四章 實驗結果與討論
4.3 利用正十六烷培養的 NTU-1 細菌結塊冷凍乾燥後其存活率及降解包覆能
4.3.3 超音波震碎 NTU-1 結塊並進行冷凍乾燥後之應用
4.3.2 節中發現以正十六烷培養的 NTU-1 細菌結塊進行冷凍乾燥後會失去活 性，但其再形成細胞聚集體 (結塊) 包覆正十六烷的能力並沒有受到影響，推測 是因為NTU-1 結塊的疏水性表面在冷凍乾燥過程中沒有受到破壞。而這一節中，
我們將測試冷凍乾燥後細胞表面完整性與否對於 NTU-1 再形成結塊能力的影響。
首先將NTU-1 結塊利用超音波震碎成細胞碎片，接著進行冷凍乾燥，並於乾燥 後進行正十六烷的包覆移除實驗。
實驗條件如下：
NTU-1 結塊製備：5 mL (OD600 ≒ 1) 礦物培養基菌液與 2000 ppmv 正十 六烷加入100 mL MSM 礦物培養基，培養 3 天後取得 NTU-1 細菌結塊。
添加劑：10%麥芽糖溶液 (w/v)
利用超音波將細胞震碎
強度：4 (約 100 瓦)
時間：15 分鐘
Sonicate：1 秒
Pulse：0.5 秒
冷凍條件：－20℃下冷凍 24 hr
真空乾燥條件：－50℃以下，100 millitorr 以下，24 小時
乾燥後存放條件：0 天
乾燥後初始取樣重量：0.161 g
培養基 pH 值：7 6.8 (滅菌後)
添加培養基正十六烷濃度：2000 ppmv
培養基體積：100 mL
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培養溫度：30℃
培養箱及轉速：往復式恆溫震盪水槽，100 rpm
分析時間點：第 24 小時
超音波震碎細胞的原理主要是利用高頻率的聲波產生強而有力的剪切作用 力進而將細胞打碎。利用乾燥後的NTU-1 碎片進行正十六烷的包覆移除實驗，
培養時間經過24 小時以後發現，不同於 4.3.2 節中乾燥 NTU-1 結塊能再次形成 聚集將正十六烷包覆，NTU-1 碎片沒有再次形成結塊，而呈現棉絮狀聚集體懸 浮在礦物培養基的表面，如照片4.3.3-1 所示。這樣的實驗結果顯示，乾燥後 NTU-1 細胞結塊表面的完整性與否對於再次形成結塊的能力會有很大的影響。至於 NTU-1 結塊在經過超音波震碎後，細胞表面疏水性是否受到影響，將於 4.4.2 中 討論。在此推測乾燥後的NTU-1 結塊除了表面的疏水性要存在以外還需具有完 整的細胞表面才能再次形成聚集將正十六烷包覆。
照片4.3.3-1 培養條件 30℃、往復式震盪培養 100 rpm、初始 pH 值 6.8，MSM 礦 物培養基中加入冷凍乾燥後的NTU-1 碎片 (經超音波震碎)，處理 2000 ppmv 正 十六烷，第24 小時之 NTU-1 細胞形態圖。
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4.3.4 討論
4.2 節中發現以 NB 培養的 NTU-1 在冷凍乾燥前加入糖類或是多元醇類為保 護劑時，NTU-1 可以在冷凍乾燥後仍具有很高的存活率，且其降解及包覆正十 六烷的特性並不會受到影響。然而在4.3.2 節實驗中發現以正十六烷培養的 NTU-1 細菌結塊在冷凍乾燥的過程中，不管加入的是 10%麥芽糖、10%甘露糖醇 或是10%的乳糖作為添加劑，冷凍乾燥後的 NTU-1 結塊所呈現包覆正十六烷的 能力並沒有太大的差異，這是因為冷凍乾燥後的NTU-1 結塊活性很低或已不具 活性，添加劑的功能是幫助冷凍乾燥的步驟能夠順利完成。
實驗發現若加入的NTU-1 結塊量較少，正十六烷的移除效果會較差 (4.3.2 (2) 部分)，當初始加入的 NTU-1 結塊量大於 0.02 g (每 100 mLMSM 礦物培養基) 時，
系統中正十六烷 (2000 ~ 2500 ppmv) 總移除效率就會維持在 80 ~ 90%左右，且 不會因為添加更多NTU-1 結塊量而提高。
在4.3.3 節的實驗中，我們先將 NTU-1 結塊震碎再拿去冷凍乾燥，接著發現 震碎後的NTU-1 碎片無法再次形成結塊，故推測細胞表面的完整性會影響細胞 再次形成聚集的能力。我們認為，一般冷凍乾燥的步驟雖然使細胞失去活性，但 細胞表面並不會完全受到破壞，所以乾燥後的NTU-1 結塊表面仍具有很強的疏 水性及完整性，可再次吸附正十六烷進而聚集形成結塊並把培養基中大部分的正 十六烷給包覆起來。
而推測造成培養基中總是會殘餘10 ~ 20%正十六烷的原因可能是因為我們 加入的乾燥NTU-1 結塊並不是全部都具有完整的表面，還是會有少部分的細胞 在冷凍乾燥的過程中破碎，因而無法全部再次聚集並把全部正十六烷給包覆起來。
有些細胞碎片，其表面能貼附正十六烷然而並無法形成大的結塊，所以在以60 mesh 篩網進行分離結塊時，就會因為顆粒太小而通過篩網，使培養基中總是殘 餘一些正十六烷，這也是為什麼我們每次進行細胞密度量測時，總是會測到一些
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殘餘在培養基中的NTU-1 細胞密度，詳細的討論可參考 4.4.8 節。
接著探討同樣是菌株NTU-1 但是在利用不同營養源 (NB 及正十六烷) 培養 並經過冷凍乾燥後的存活率卻相差這麼多，造成差異的原因推測可能是以下2 點：
(1) 以 NB 培養的 NTU-1 是以均勻分散的形態分布在添加的保護劑中，然而以 正十六烷培養的NTU-1 是以結塊的形態分布於保護劑 (添加劑) 中，雖然實 驗中會以搖晃的方式使結塊均勻分散在保護劑中，但由於NTU-1 結塊表面 貼附有正十六烷使整體密度小於1，故當將結塊搖散接著靜置一段時間後，
結塊又會重新聚集且趨向於浮在保護劑的表面 (如照片 4.3.5-1 (B) )。因而加 入的保護劑對於NTU-1 結塊的保護面積會相對於以 NB 培養均勻分散的 NTU-1 (照片 4.3.5-1 (A) ) 來得小。此外，形成結塊後的 NTU-1，其細胞表 面性質如脂肪酸的成份也會在培養過程中而有所改變，故在冷凍乾燥這個過 程中，NTU-1 的存活率是有可能呈現如此差異的。
(2) 以正十六烷培養後的 NTU-1 結塊在加入保護劑 (添加劑) 後，除了因為結塊 的形態使保護劑與NTU-1 細胞表面接觸面積較小外，由於結塊表面有正十 六烷的貼附，使加入的添加劑更加難以接觸到NTU-1 的表面故無法在冷凍 乾燥期間保護NTU-1，所以易造成 NTU-1 在冷凍乾燥期間不可復原的傷 害。
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(A) (B)
照片4.3.5-1 冷凍乾燥前，以不同碳源培養 NTU-1 產生不同形態的 NTU-1 加入 保護劑 (添加劑) 後 NTU-1 的分布情形。(A) 以 NB 培養後的 NTU-1 均勻分散 在保護劑的情形；(B) 以正十六烷培養後的 NTU-1 結塊懸浮在添加劑表面的情 形。
生物復育過程中，一般都會遇到微生物降解速率緩慢使其成效無法在短時間 內顯現這個問題。而由以上的實驗知道，雖然冷凍乾燥後的NTU-1 結塊活性很 低或已經不具活性，但我們發現礦物培養基中含0.2 g/L 以上的 NTU-1 結塊密度 與2000 ppmv 的正十六烷，經過往復式搖晃的培養，NTU-1 結塊可以在 1 ~ 2 小 時內再次吸附正十六烷並聚集形成結塊，在取樣的時間點第12 小時配合物理撈 除NTU-1 形成的聚集體，能移除掉 80 ~ 90%的正十六烷。這個結果顯示將 NTU-1 結塊以冷凍乾燥的方式來保存對於石油復育的研究中是有其潛力及發展性的。
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