第四章 實驗結果與討論
4.2 以 NB 培養的 NTU-1 冷凍乾燥後細胞存活率及降解包覆能力探討
4.2.1 利用 NB 培養的 NTU-1 經過冷凍乾燥後之存活率探討
這一節的實驗中固定了培養NTU-1 時的其他條件，主要探討不同的保護劑 對於NTU-1 冷凍乾燥後的存活率，並觀察在不同溫度下存放及存放時間的長短 對於NTU-1 存活率是否會造成影響。文獻中指出，保護劑的種類主要是要依據 不同微生物來選擇，不同的微生物對於不同的保護劑所產生的保護效果也會有很 大的差異 (De Valdez et al. 1983)。實驗中，我們選擇了幾種較常見且本實驗室現 有又不會影響結果分析的保護劑來進行比較。
進行冷凍乾燥前，微生物生長期的選擇對於冷凍乾燥的結果也會有差異，而 實驗中選定在穩定期初期的微生物來進行冷凍乾燥，主要是因為生長週期至穩定
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期的微生物由於此時的碳源已接近用盡，故細胞會激發出逆境反應 (stress responses) 並容易誘導出不同生理的狀態，使其能夠保護細胞並維持活性。文獻 中指出，初始細菌濃度的選擇通常要高於108 CFU/mL 較佳，故在實驗中會將 NTU-1 的初始濃度控制在 109 CFU/mL 左右。選擇較高的細胞濃度是因為微生物 會在冷凍乾燥的過程中受到傷害或是死亡，此時若有較高濃度的初始微生物量的 話，相對的也會有較多的微生物存活下來，進而可以繼續繁殖增長，並維持其生 理特性 (Morgan et al. 2006)。
實驗條件如下：
NTU-1 在 NB (0.8%) 中的生長時間：20 小時 (穩定期初期)
離心取得濃縮 NTU-1: 15℃、4800 rpm，15 分鐘
加入保護劑：(1) 去離子水 or (2) 1%麥芽糖 or (3) 10%麥芽糖 or (4) 10%甘露 糖醇 (w/v)
初始 NTU-1 濃度：0.54 ~ 1.49×109 CFU/mL
冷凍菌液體積：5 mL
冷凍溫度及時間：－20℃，24 小時
真空乾燥條件：－50℃以下，100 mTorr 以下，24 小時
存放條件：真空封瓶後於 30、4、－20℃下存放 0，10，30 天
復水培養基：MSM 礦物培養基 5 mL (初始體積)
復水條件：30℃下於迴旋式培養箱中搖晃 10 分鐘
NTU-1 存活率計算 (%) = 乾燥 復水後的濃度
初始 濃度 100
接下來分別討論以NB 培養之 NTU-1 加入不同保護劑並經過冷凍及冷凍乾 燥後的細胞存活率，同時討論存放溫度與時間對於細胞存活率的影響。
首先探討NTU-1 在冷凍後的細胞存活率，如圖 4.2.1-1 表示。在濃縮的 NTU-1
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Cell Viability (%)
Protectant (w/v) 學反應速率的提高，造成蛋白質變性及細胞膜破壞 (Bozoglu et al. 1987)。由實驗 結果圖4.2.1-1 可以看出不管 NTU-1 是加入不同保護劑或是加入沒有任何保護作
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Cell Viability (%)
Protectant (w/v) 胞表面具有抵抗化學性傷害、疏水性以及抵禦脫水等性質 (Collins et al. 1982)，
故其在冷凍乾燥後仍能維持較高的存活率。
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接下來探討冷凍乾燥後貯存溫度的選擇及存放的時間，實驗測試了三個保存 溫度，分別是－20、4 及 30℃且存放於這些溫度下 0、10 及 30 天後來進行 NTU-1 存活率的實驗，以圖4.2.1-3 (A) －20℃、(B) 4℃、(C) 30℃表示。由實驗結果圖 4.2.1-3 可以很明顯看出，不管是哪一種保護劑的添加，菌體存放的溫度越高，死 亡率隨著存放時間增長也跟著提高。故當保存的溫度為－20℃時，細胞的存活率 最高，4℃次之，而 30℃的組別則存活率為最低。造成如此的差異主要是由於在 乾燥過程中，引起蛋白質變性的時間尺度為小時；然而對於貯存而言，時間的尺 度通常較長，是日、月甚至是年，因此當乾燥後的菌株貯存溫度越低時，細胞狀 態較穩定，也可降低細胞膜上脂肪酸的氧化反應、延緩蛋白質的變性，因而存活 率也會較高 (Castro et al. 1995)。
當了解不同保護劑的選擇及存放的溫度對於冷凍乾燥後NTU-1 存活率的影 響後，另一個重點即是存放時間的長短，其對於微生物的保存也非常重要。因為 冷凍乾燥菌株的目的就是希望能長時間的保存菌株，希望在經過長時間的保存後 還能維持很高的存活率，並維持其生理特性。由圖4.2.1-3 可以看出隨著存放的 時間增加，細菌的存活率會逐漸降低，其中以存放溫度為30℃下的存活率下降 最快，而貯放溫度為－20℃及 4℃且有加入保護劑的實驗組別細菌在經過 30 天 的存放後仍具有相對高的存活率。
同時由圖4.2.1-3 也可以看出三種添加的保護劑中，以麥芽糖的保護效果較 好，其在－20℃下經過 30 天的存放，存活率仍有 80%左右；存放在 4℃經過 30 天也有70%左右的存活率，甚至將存放溫度提高到 30℃，經過 30 天也仍有 65%
左右的存活率。這個現象顯示出以NB 培養的 NTU-1，適合利用麥芽糖來作為冷 凍乾燥時的保護劑並適合存放在－20℃的環境中，這樣的條件可以使乾燥後的 NTU-1 經過長時間的存放後仍具有很高的存活率。
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Cell Viability (%)
Storage Time (days)
DI-water 10% Maltose 10% Mannitol
(B) 4 deg C
Cell Viability (%)
Storage Time (days)
DI-water 10% Maltose 10% Mannitol
(C) 30 deg C
Cell Viability (%)
Storage Time (days)
DI-water 10% Maltose 10% Mannitol (A) -20 deg C
圖4.2.1-3 以 NB 培養的 NTU-1，添加不同保護劑並在冷凍乾燥後存放於不同溫 度下0，10 及 30 天後的存活率。 (A) －20℃、(B) 4℃、(C) 30℃。
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由以上實驗結果可知道以麥芽糖溶液作為NTU-1 冷凍乾燥時的保護劑是較 佳的選擇，故接下來測試不同濃度的麥芽糖溶液來探討不同濃度對於NTU-1 的 保護效果是否會有明顯的差異。我們以保護劑1%及 10%濃度的麥芽糖測試了三 個不同的貯存溫度，分別為－20、4 及 30℃，且存放於這些溫度下 0、10 及 30 天後進行細菌存活率的實驗，實驗結果以圖4.2.1-4 (A) －20℃、(B) 4℃、(C) 30
℃表示。
由圖4.2.1-4 可以看出以 1%麥芽糖的溶液作為保護劑，其保護效果仍然是非 常的好，其在－20℃下經過 30 天的存放，存活率仍有 92%左右；存放在 4℃經 過30 天也有 89%左右的存活率，甚至將存放溫度提高到 30℃，經過 30 天也仍 有51%左右的存活率。顯示了濃度約為 109 CFU/mL 的 NTU-1 細胞並不需要太 高濃度的麥芽糖就可以提供相當的保護效果。
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Cell Viability (%)
Storage Time (days)
10% Maltose
Cell Viability (%)
Storage Time (days)
10% Maltose
Cell Viability (%)
Storage Time (days)
10% Maltose
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