NTU-1 細菌結塊降解及包覆正十六烷的能力 (未經冷凍乾燥)

在進行NTU-1 細菌結塊冷凍乾燥以前，必需先知道 NTU-1 在利用正十六烷 後形成的細菌結塊是否具有再包覆及降解新添加正十六烷的能力，同時觀察培養 基酸鹼值及細胞密度隨時間的變化。

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實驗條件如下：

 培養基 pH 值：7  6.8 (滅菌後)

 初始植菌量：5 mL 液態礦物培養基菌液 (OD600 ≒ 1)

 培養基體積：100 mL

 更換培養積時間：第 72、102 小時

 培養基總正十六烷濃度：2000 (0 – 72 hr)、4000 (72 – 102 hr)、6000 (102 – 146 hr) ppmv

 添加正十六烷時間：第 0、72、102 小時

 篩網孔徑大小：10 mesh (1.7 mm)

 篩網折角：180°

 培養溫度：30℃

 培養箱及轉速：迴旋式恆溫培養箱 100 rpm

 分析時間點：第 72、102、146 小時

實驗流程如下：首先利用2000 ppmv 正十六烷來培養 NTU-1，經過 72 個小 時以後，NTU-1 已形成聚集體並把未降解的正十六烷包覆於其中，此時將結塊 與培養基分離，如照片4.3.1-1 (A) 所示。並於含結塊的錐形瓶中再加入 100 mL 新的MSM 培養基，使酸鹼值回復到初始值 6.8。同時分析培養三天後分離培養 基的酸鹼值、殘餘正十六烷的量及殘餘在培養基中的細胞密度。錐形瓶中加入新 的MSM 培養基後，同時重新再添加 2000 ppmv 的正十六烷，並置於 30℃迴旋 式培養箱中培養，觀察形成結塊的NTU-1 是否能因為培養基中酸鹼值回復到適 合生長的值而再繼續降解包覆正十六烷。反應經過5 個小時可發現 NTU-1 結塊 會分散成結塊前的棉絮狀聚集體，如照片4.3.1-1 (B) 所示。經過 30 個小時以後，

NTU-1 會重新聚集形成結塊，使培養基呈現澄清的狀態，如照片 4.3.1-1 (C) 所 示。此時又將培養基與細菌結塊分離並測量培養基中的酸鹼值、殘餘正十六烷的 量及殘餘細胞的密度。接著如上面的步驟再加一次新的培養基及2000 ppmv 的正

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十六烷。反應時間再經過約44 小時後可以看到錐形瓶中生成的結塊比在第 72、

102 小時都來得大一些，如照片 4.3.1-1 (D) 所示，顯示 NTU-1 的細菌結塊能因 為培養基酸鹼值的提升及添加入新的正十六烷而繼續生長並形成更大的結塊將 正十六烷包覆於其中。

(A) (B)

(C) (D)

照片4.3.1-1 NTU-1 細菌結塊在重新更換培養基及添加 2000 ppmv 正十六烷後，

不同時間下，細胞結塊的情形。(A) 反應經過 72 小時後，移除培養基；(B) 第 77 小時；(C) 第 102 小時；(D) 第 146 小時。

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接下來分別來探討培養過程中培養基酸鹼值變化、NTU-1 細胞密度變化及 培養過程中正十六烷殘餘在培養基的量、降解量及包覆量的分布情形，如圖 4.3.1-1 ~ 3 所示。

由圖4.3.1-1 培養基中酸鹼值變化的趨勢可以看到隨著培養時間的增加，

NTU-1 降解正十六烷產生酸性的代謝物使 pH 值下降。當反應到第 72 個小時後，

將培養基移除並更換成新的培養基，使pH 值回復到 6.8，同時再加入新的正十 六烷，再經過約30 個小時後已有明顯的 NTU-1 細菌結塊形成且 pH 值會由 6.8 降至4.3 左右。此時再將結塊與培養基分離並加入新的培養基及正十六烷，再經 過44 小時以後，NTU-1 再次聚集包覆大部分未降解的正十六烷形成更大的細菌 結塊且pH 值也由 6.8 降到 4 左右。這個現象顯示了結塊後的 NTU-1 能在較短時 間內利用新添加的正十六烷且重新聚集形成結塊並包覆未降解的正十六烷。

接著來看圖4.3.1-2 細胞密度的變化趨勢圖，由於實驗中是利用形成結塊後 的NTU-1 來作為每次更換培養基及添加正十六烷的細菌來源，所以無法在第 72 及102 小時來測得 NTU-1 細菌結塊的乾重，只能測得殘餘在舊培養基中的細胞 密度。但由4.1.2.1 節的實驗中可知道加入篩網的實驗組別中，在培養時間至 68 小時的細胞密度皆約為0.3 g/L。本節實驗結果發現反應時間到 146 個小時所測 得的總細胞密度約有0.7 g/L (約有 0.6 g/L 為細胞結塊、0.1 g/L 為殘餘在培養基 中的細胞密度)。由此可知，NTU-1 細菌結塊會隨著更換培養基及添加新的正十 六烷而成長，細胞密度也會提升。

圖4.3.1-3 為 NTU-1 細菌結塊重新更換 MSM 培養基及添加 2000 ppmv 正十 六烷後，不同時間下培養基中正十六烷分布的變化。這個部分與細胞密度的測量 一樣，由於是利用形成結塊後的NTU-1 來作為每次更換培養基及添加正十六烷 的細菌來源，所以無法在第72 及 102 小時測得 NTU-1 細菌結塊內包覆的正十六 烷量，只能測得其殘餘在MSM 培養基中的正十六烷。而因為知道初始添加正十 六烷的量，也知道殘餘在培養基中正十六烷的量，所以可以推出正十六烷的總移 除量 (總移除量 = 烷類的初始添加量 – 烷類殘餘量)。圖上的黑線代表的是不

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0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

pH

Incubation Time (hr)

同時間的總正十六烷量 (72 小時前培養基內正十六烷的總量有 2000 ppmv、72 ~ 102 小時之間總正十六烷的量有 4000 ppmv 而 102 ~ 146 小時間總正十六烷的量 為6000 ppmv)。由圖 4.3.1-3 可以看出在第 72 小時就可以移除掉約 1920 ppmv 的 正十六烷，在第102 小時內則可移除掉約 3700 ppmv 的正十六烷。而到達第 146 小時後，NTU-1 總共約包覆了 3600 ppmv 的正十六烷而降解掉 1900 ppmv 的正 十六烷，使6000 ppmv 的正十六烷在 146 小時內移除掉 90%以上。

圖4.3.1-1 培養條件 30℃、迴旋式搖晃培養 100 rpm、初始 pH 值 6.8，NTU-1 形 成細菌結塊後重新更換MSM 培養基及添加 2000 ppmv 正十六烷，不同時間下培 養基中酸鹼值的變化。(更換 MSM 時間：第 72、102 小時)。

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Cell Density (g/L)

Incubation Time (hr)

Cell Density in Suspension Biofloccules Cell Density

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165

Incubation Time (hr)

Residual C16 Trapped C16

Biodegradation of C16 Removal C16

= (Biodegradation + Trapped)

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4.3.2 NTU-1 細菌結塊在冷凍乾燥後降解及包覆正十六烷的能力

將 NTU-1 細菌結塊冷凍乾燥的目的在於大量且長期的儲存乾燥的細菌結塊，

因而一有需要時就能馬上應用，希望其可在短時間內重新形成聚集進而移除掉污 染源碳氫化合物。

4.3.1 節中確定了未經冷凍乾燥的 NTU-1 細菌結塊能夠因為培養基的更換及 添加入新的正十六烷而繼續生長並能降解且包覆掉大部分未降解的正十六烷。在 這個過程中，培養基的酸鹼值會降低且細胞的密度也會隨時間增加。另外，由 4.2 節知道以 NB 培養的 NTU-1 在冷凍乾燥後仍維持一定的活性，且對正十六烷 仍有很好的移除效果。故接下來將探討冷凍乾燥後的NTU-1 細菌結塊是否具有 相同的特性，能使正十六烷在短時間被包覆降解，並能使細胞密度提升及使培養 基的酸鹼值降低。實驗中分別會討論幾個不同初始克數的乾燥NTU-1 結塊對於 正十六烷復育實驗結果。

由於冷凍乾燥過程中，有添加保護劑來減少冷凍乾燥對於NTU-1 細菌結塊 的傷害，所以乾燥後的產品除了細菌結塊以外，其他大部分皆為乾燥後的保護劑，

故無法很準確的量測我們加入的初始NTU-1 細菌結塊之重量，不過大概可以將 其固定在某一個範圍內。下面則分別討論幾個初始乾燥後NTU-1 細菌結塊重量 (每 100 mL 的 MSM 礦物培養基)：(1) 初始乾燥 NTU-1 結塊重量為 0.024 ~ 0.025 g。(2) 初始乾燥 NTU-1 結塊重量為 0.007 ~ 0.008 g。(3) 初始乾燥 NTU-1 結塊 重量為0.018 ~ 0.02 g。