第三章 實驗材料與方法
3.2 培養基組成與配製
3.2.4 計數平板培養基
本實驗使用的計數平板培養基成分為Nutrient Agar (簡稱為 NA)，配製條件 如下：
(1) 於每 1 L 去離子水中加入 20 g 的 NA 粉末，攪拌溶解後置入滅菌釜以 121℃、
15 psi 進行滅菌 20 分鐘。
(2) 取出置入無菌操作台，待其溫度降至 40~50℃ (NA 溶液熔點約為 35℃) 後，
分裝至8 cm 的培養且中。
(3) 靜置約 2 小時冷卻並除去多餘霧氣水分，以 parafilm 密封。
(4) 接著將其放入 30℃烘箱中，經過 2 天後若沒有長出其他微生物的菌落，代 表沒有被污染，即可保存或使用。
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0 5 10 15 20 25 30 35 40
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
OD 600
Incubation time (hr)
3.3 實驗方法
3.3.1 菌株的活化及生長曲線
(1) 取出存放於 4℃冰箱中的固態菌株保存培養基放入無菌操作台，利用以酒精 燈消毒的白金接種環取出固態培養基上的NTU-1 菌落，接種至 3.2.3 節中配 置好的NB 營養液中。
(2) 將接種好的 NB 營養液瓶口以酒精燈消毒，並以 parafilm 密封，置放於 30
℃迴旋式恆溫培養箱下培養，轉速為100 rpm。
(3) 開始培養後，每 1 個小時取出 2 mL 測量 OD600值，以無菌的NB 培養液作 為對照組，將測得的OD600值相減後對培養時間作圖，即可得到NTU-1 的 生長曲線，如圖3.3.1-1 所示。
圖3.3.1-1 NTU-1 菌株在 Nutrient Broth (NB) 營養液中的生長曲線。
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3.3.2 礦物培養基菌液製作
礦物培養基菌液
(1) 步驟同 3.3.1 節所示，以白金接種環取出菌株保存培養基上的 NTU-1 菌落，
接種至NB 營養液中，在 30℃、100 rpm 的條件下進行活化培養。經過 18 ~ 20 小時，菌株生長至穩定期初期後停止培養。
(2) 將活化菌株後的 NB 培養液以 15℃、4800 rpm 的條件下離心 15 分鐘，之後 在無菌操作台內移除離心後的上清液。
(3) 此時再加入相同體積無菌 MSM 礦物培養基 (如 3.2.1 節中配置)，充分搖晃 使底部細胞再次懸浮並達到清洗的目的。接著以同樣條件離心15 分鐘，離 心完成後於無菌的環境下移除上層礦物培養基。
(4) 最後在濃縮的 NTU-1 細胞中加入適量的無菌礦物培養基，充分搖晃使其均 勻懸浮，測量OD600吸收值，將OD600值控制在1 左右即完成 NTU-1 液態 礦物培養基菌液。本研究中即以此作為正十六烷生物復育實驗中的植菌來 源。
細胞生菌數之測定
(1) 取上一部分製作完成的 NTU-1 液態礦物培養基菌液 (OD600值約為1)，以無 菌礦物培養基進行連續稀釋，將濃度稀釋為原本濃度的10-1、10-2、10-3…10-7 至所需倍率，通常為10-5 ~ 10-7倍。
(2) 分別取出 50 μL 稀釋液，以無菌玻璃勾環均勻塗抹在 NA 計數平板培養基上 (配置方法如 3.2.4 節)，接著利用 parafilm 將其密封。使用後的玻璃勾環以酒 精潤洗後再用酒精燈殺菌，以供下一次塗菌用。
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(3) 將密封的 NA 計數平板培養基置放於 30℃培養箱中， 2 天後觀察計算生長 的菌落數。經由換算可知此OD600值下每1 mL 菌液中下有多少活菌。
(4) 生菌數的計數單位為 CFU (colony-forming units)，是假設一個活菌只會生成 一顆菌落的情況，通常計數平板培養基中的菌落數控制在30 ~ 200 的範圍內 較準確。
(5) 上述方法也可測得不同 OD600值菌液所對照的生菌數。
(6) 長出菌落的計數平板培養基可存放於 4℃冰箱中，以供之後活化菌株使用。
3.3.3 正十六烷之生物降解與生物復育實驗
正十六烷生物復育實驗的流程與各項測定
(1) 將 3.2.1 節中配置好的液態礦物培養基 (pH=7) 取 100 mL 倒入 250 mL 錐形 瓶，此時錐形瓶中依照不同實驗條件可能置入不同孔徑大小及不同折角的篩 網。
(2) 接著置入滅菌釜以 121℃、15 psi 的條件下滅菌 20 分鐘。待其冷卻並噴灑 75%酒精後置入無菌操作台，滅菌後的液態礦物培養基 pH 值會降至 6.8。
(3) 以酒精燈將錐形瓶口殺菌後，依照實驗條件以微量滴管加入 200 μL 的正十 六烷及5 mL 的 NTU-1 液態礦物培養基菌液，此時初始 NTU-1 細胞量 OD600
值約為0.05 (初始細胞密度約 0.035g/L)。
(4) 完成植菌動作後同樣以酒精燈將瓶口殺菌，並以 parafilm 封住瓶口。接著依 不同實驗條件將培養錐形瓶放入往復式恆溫震盪水槽或是迴旋式恆溫培養 箱中，以溫度30℃、轉速 100 rpm 的條件進行培養。
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(5) 實驗進行至 20、32、44、56 及 68 小時後，取出幾瓶錐形瓶停止培養，拍照 記錄細胞生長外觀的變化，並進行培養基酸鹼值的測量。
(6) 若培養過程中 NTU-1 產生細胞聚集現象，則利用 60 mesh 的濾網 (孔徑大小：
0.246 mm) 進行菌塊與培養基液體的分離，並量測培養基液體的 pH 值。分 離後的菌塊以去離子水加入至初始反應體積100 mL。
(7) 完成分離及 pH 值量測後，每組錐形瓶中加入 30 mL 的乙酸乙酯進行殘餘培 養基或細胞顆粒內包覆正十六烷的萃取，同時也加入100 μL 的正十二烷作 為GC 氣相層析儀量測的內標準品。
(8) 接著用不透氣矽膠塞將瓶口塞住並以 parafilm 密封後，均勻的搖晃以混合水 相及有機相，接著放入30℃的培養箱中靜置萃取，約 2 個小時後取出上層 有機相溶液2 mL 加入微量試管中保存。若沒有要馬上利用 GC 量測的話，
可存放至－20℃冰箱中，以避免有機相揮發過快造成日後量測上的誤差。
(9) 萃取且完成保存有機相溶液的步驟後，利用烘乾後的濾紙 (ADVANTEC GF-75, 厚度：0.35 mm, 孔徑大小：0.3 μm) 進行抽氣過濾，使細胞留在濾 紙上，過濾完成後將濾紙放入80℃烘箱中約 24 小時，待其乾燥後取出置放 於室溫下1 小時回溫並秤重，測得的重量再減去初始濾紙重則可得到 NTU-1 細胞乾重，並可換算成細胞密度。
(10) 步驟 (8) 中保存於微量試管的萃取液以微量注射針取出 2 μL，利用氣相層 析儀 (GC) 分析正十六烷的含量。將積分軟體所顯示的波峰面積對照校正曲 線，經過換算可得不同培養時間及實驗條件下的培養基殘餘及NTU-1 細菌 結塊中正十六烷的量。
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0 5000 10000 15000 20000 25000
0 500 1000 1500 2000
n-Hexadecane (ppmV, V/V)
Integration value y = 0.09884x
R2= 0.9995 正十六烷校正曲線
(1) 利用微量滴管取 50、100、150、200 μL 的正十六烷 (n-hexadecane) 各加入 含100 mL 礦物培養基的錐形瓶中，同時各加入 100 μL 的正十二烷
(n-dodecane) 作為內標準品。
(2) 取 30 mL 的乙酸乙酯 (ethyl acetate) 分別倒入錐形瓶中，並以矽膠塞密封。
均勻搖晃後置放於30℃下進行萃取， 2 小時後取出上層有機液約 2 mL 存 放於微量試管中。
(3) 以微量注射針取出 2 μL 溶液並以氣相層析儀進行分析正十六烷的含量，將 積分面積與濃度作圖可即可得到正十六烷的校正曲線，如圖3.3.3-1。
圖3.3.3-1 正十六烷在氣相層析儀中之校正曲線
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氣相層析儀之條件設定
型號： Perkin Elmer Autosystem
管柱： 填充物材質 fused silica capillary column、管長 30 m、內直徑 0.53 mm、
填充物膜厚0.25 μm。
偵測器：FID
氣體流量：空氣 450 mL/min、氫氣 45 mL/min
載運氣體 (carrier gas)：氮氣 5 mL/min
爐溫 (oven temperature) 變化：起始溫度 80℃，停留 2 分鐘後以 40℃/min 的速率升溫至280℃後停留 2 分鐘。
注入器溫度 (injector)：250℃
偵測器溫度 (detector)：300℃
積分軟體：ABDC Chrommanager Multisystem 層析總管，立行科技有限公司
3.3.4 以 NB 培養的 NTU-1 進行冷凍乾燥及其存活率測試
(1) 以下每項操作步驟皆在無菌的條件下進行。將菌株保存培養基上的 NTU-1 菌落以白金接種環取下並放入0.8 % (w/v) NB 營養液中。接著置放於 30℃、
100 rpm 迴旋式恆溫培養箱中進行活化培養。
(2) 經過 20 小時後停止培養，此時為 NTU-1 生長期的穩定期初期。接著利用冷 凍離心機，以15℃、4800 rpm 的條件下進行離心 15 分鐘。離心完成後分離 上清液並加入同體積的無菌去離子水進行清洗。
(3) 接著以同樣的條件進行離心 15 分鐘。離心完成後，分離上層去離子水而得 到下層濃縮的NTU-1 細胞。
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(4) 將配置好不同濃度的無菌保護劑溶液加入濃縮的 NTU-1 細胞，以加入去離 子水的組別作為對照組，均勻搖晃讓在底部的NTU-1 懸浮於溶液後靜置 10 分鐘，靜置10 分鐘的目的是使細胞重新適應環境。另外，若保護劑為糖類 的話，可利用0.22 μm 孔徑的濾膜來除菌。
(5) 測量含保護劑 NTU-1 溶液的 OD600值，並將其值控制在2 左右。接下來以 3.3.2 節中所介紹的計數平板培養基來測量初始的 NTU-1 活菌數 (約在 0.54
~ 1.49 × 109 CFU/mL 的範圍內)。
(6) 接著將含保護劑 NTU-1 溶液以微量吸管吸取 5 mL 放入真空玻璃瓶 (總體積 10 mL)，並置入－20℃的冰箱中冷凍 24 小時。
(7) 經過 24 小時後，將其取出並放入真空冷凍乾燥機中進行真空乾燥 24 小時。
真空冷凍乾燥機設定條件：溫度－50℃以下、壓力小於 100 mTorr。
(8) 冷凍乾燥步驟完成後，於真空的環境將真空瓶密封，使乾燥的 NTU-1 處於 真空的環境下。接者依不同實驗條件存放於－20、4、30℃下 0、10、30 天。
(9) 經過不同實驗條件下的存放後，取出含乾燥 NTU-1 的真空瓶並放入無菌操 作台內。接著進行復水的動作，加入液態礦物培養基 (MSM) 至其初始體積 5 mL，復水完成後置放於 30℃、100 rpm 的迴旋式培養箱中搖晃 10 分鐘，
搖晃10 分鐘的目的是為了讓 NTU-1 恢復活性，且不會因為搖晃時間太長而 使NTU-1 開始繁殖影響實驗結果。
(10) 搖晃 10 分鐘後，同樣利用 3.3.2 節中所介紹的計數平板培養基計算活菌數的 方法來測量復水後NTU-1 的生菌數。乾燥後 NTU-1 的存活率計算式子如下：
NTU-1 存活率 (%) = 乾燥 復水後的濃度
乾燥前初始 濃度 100
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3.3.5 以正十六烷培養的 NTU-1 細菌結塊進行冷凍乾燥
不同於3.3.4 節中以 NB 培養的 NTU-1 是以自由的細胞狀態 (free cells) 均勻 的存在於溶液中。這一節所使用的NTU-1 是利用正十六烷培養後所呈現細胞聚 集體 (cell aggregates or biofloccules) 的狀態來進行冷凍乾燥。
(1) 同 3.3.3 節中所介紹的正十六烷生物復育實驗步驟 (1) ~ (4)，NTU-1 以 2000 ppmv 的正十六烷培養 3 天，此時 NTU-1 已形成細胞聚集體並將大量正十六 烷包覆於其中。
(2) 利用 14 mesh 篩網 (1.18 mm) 將 NTU-1 菌塊與培養基分離，並將 NTU-1 菌 塊放入10 mL 的真空瓶中，接著依不同實驗條件加入不同濃度及成份的無 菌保護劑溶液。每10 mL 的真空瓶中約加入 2 ~ 3 瓶反應錐形瓶產生的 NTU-1 菌塊，並各加入 5 mL 的保護劑溶液，使 NTU-1 菌塊重量與保護劑 的重量比值約為0.1 左右 (詳細原因如 4.3.2 (1) 部分所示)。
(3) 將保護劑與 NTU-1 菌塊劇烈搖晃使結塊分散並均勻混合後放入－20℃冰箱 中冷凍24 小時。
(4) 經過 24 小時後，將其取出並放入真空冷凍乾燥機中進行真空乾燥 24 小時。
真空冷凍乾燥機設定條件：溫度－50℃以下、壓力小於 100 mTorr。
(5) 冷凍乾燥步驟完成後，於真空的環境將真空瓶密封，使乾燥的 NTU-1 處於 真空的環境下。接者依不同實驗條件存放於－20、4、30℃下 0、10、30 天。
(6) 冷凍乾燥後的 NTU-1 菌塊能作為正十六烷生物復育的植菌來源，詳細步驟 參照3.3.7 節。
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3.3.6 烘乾以正十六烷培養的 NTU-1 細菌結塊
(1) 同 3.3.3 節中所介紹的正十六烷生物復育實驗步驟 (1) ~ (4)，NTU-1 以 2000 ppmv 的正十六烷培養 3 天，此時 NTU-1 已形成細胞聚集體並將大量正十六 烷包覆於其中。
(2) 利用 14 mesh 篩網 (1.18 mm) 將 NTU-1 菌塊與培養基分離，將 NTU-1 菌塊 平鋪於直徑7 公分的鋁箔紙盤上，置入烘箱中進行烘乾。
(3) 烘乾的溫度測試了 60、80、100、120、160℃，烘乾所需時間分別為 48、15、
6、2、0.5 小時。不同溫度所需乾燥時間不同，對於乾燥後 NTU-1 結塊的表 現也會有影響。
(4) 烘乾後的 NTU-1 菌塊以勺子刮取下來，放入小血清瓶後置於 30℃培養箱中 進行保存。
(5) 烘乾後的 NTU-1 菌塊能作為正十六烷生物復育的植菌來源，詳細步驟參照
(5) 烘乾後的 NTU-1 菌塊能作為正十六烷生物復育的植菌來源，詳細步驟參照