NTU-1 細菌結塊在冷凍乾燥後降解及包覆正十六烷的能力

4.3.2 NTU-1 細菌結塊在冷凍乾燥後降解及包覆正十六烷的能力

將 NTU-1 細菌結塊冷凍乾燥的目的在於大量且長期的儲存乾燥的細菌結塊，

因而一有需要時就能馬上應用，希望其可在短時間內重新形成聚集進而移除掉污 染源碳氫化合物。

4.3.1 節中確定了未經冷凍乾燥的 NTU-1 細菌結塊能夠因為培養基的更換及 添加入新的正十六烷而繼續生長並能降解且包覆掉大部分未降解的正十六烷。在 這個過程中，培養基的酸鹼值會降低且細胞的密度也會隨時間增加。另外，由 4.2 節知道以 NB 培養的 NTU-1 在冷凍乾燥後仍維持一定的活性，且對正十六烷 仍有很好的移除效果。故接下來將探討冷凍乾燥後的NTU-1 細菌結塊是否具有 相同的特性，能使正十六烷在短時間被包覆降解，並能使細胞密度提升及使培養 基的酸鹼值降低。實驗中分別會討論幾個不同初始克數的乾燥NTU-1 結塊對於 正十六烷復育實驗結果。

由於冷凍乾燥過程中，有添加保護劑來減少冷凍乾燥對於NTU-1 細菌結塊 的傷害，所以乾燥後的產品除了細菌結塊以外，其他大部分皆為乾燥後的保護劑，

故無法很準確的量測我們加入的初始NTU-1 細菌結塊之重量，不過大概可以將 其固定在某一個範圍內。下面則分別討論幾個初始乾燥後NTU-1 細菌結塊重量 (每 100 mL 的 MSM 礦物培養基)：(1) 初始乾燥 NTU-1 結塊重量為 0.024 ~ 0.025 g。(2) 初始乾燥 NTU-1 結塊重量為 0.007 ~ 0.008 g。(3) 初始乾燥 NTU-1 結塊 重量為0.018 ~ 0.02 g。

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(1) 初始乾燥 NTU-1 結塊重量為 0.024 ~ 0.025 g

首先選擇加入的初始NTU-1 細菌結塊重量為 0.024 ~ 0.025 g，主要是因為在 4.1 節的實驗中發現利用液態礦物培養基菌液來進行正十六烷生物復育實驗時，

當NTU-1 長到約 0.02 g (每 100 mL 礦物培養基) 以上時就會聚集形成結塊並把 未降解的正十六烷包覆起來。接下來的實驗會探討不同的保護劑、不同存放溫度 及時間對於乾燥後NTU-1 結塊之降解包覆能力的影響。

實驗條件如下：

 NTU-1 結塊製備：5 mL (OD600 ≒ 1) 礦物培養基菌液與 2000 ppmv 正十六 烷 加入 100 mL MSM 礦物培養基，培養 3 天後取得 NTU-1 細菌結塊。

 保護劑：10%麥芽糖或 10%甘露糖醇 (w/v)

 混合 NTU-1 結塊與保護劑：NTU-1 結塊重與保護劑重量比值控制在 0.1 左 右，即 ^結塊重

保護劑重

≒ 0.1

 冷凍條件：－20℃下冷凍 24 hr

 真空乾燥條件：－50℃以下，100 mTorr 以下，24 小時

 乾燥後存放條件：

 10%麥芽糖組：0 天

 10%甘露糖醇組：－20℃下 30 天

 乾燥後初始取樣重量 (保護劑 + NTU-1 結塊)：

 10%麥芽糖組：0.249 (± 0.0013) g

 10%甘露糖醇組：0.283 (± 0.008) g

 乾燥後初始 NTU-1 結塊重量 (經過加入培養基復水後以 0.3 μm 濾紙過濾)：

 10%麥芽糖組：0.0238 (± 0.0008) g

 10%甘露糖醇組：0.0256 (± 0.0005) g

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 培養基 pH 值：7  6.8 (滅菌後)

 添加培養基正十六烷濃度：2000 ppmv

 培養基體積：100 mL

 培養溫度：30℃

 培養箱及轉速：往復式恆溫震盪水槽，100 rpm

 分析時間點：第 12、24、36、48 小時

這部分的實驗中皆採取添加濃度為10%的保護劑，主要是因為由 4.2 節中可 知道以麥芽糖為保護劑時，不管是1%或是 10%的濃度皆能對 NB 培養的 NTU-1 產生很好的保護效果。若以重量來比較的話，以NB 培養的 NTU-1 細胞 (OD600 ≒ 2) 在 5 mL 下重量大約為 0.006 g；換算 1%的麥芽糖 5 mL 下的重量約為 0.05 g、

而換算10%麥芽糖溶液 5 mL 下重量約為 0.5 g。所以在 NTU-1 細胞與保護劑重 量比值約在0.012 ~ 0.12 時 (即 ^重

保護劑重 ≒ 0.012~0.12)，保護劑皆能達到

保護NTU-1 的效果。因此，本實驗中將 NTU-1 細菌結塊與保護劑的重量比值控 制在0.1 左右。

實驗流程大至如下：首先我們將5 mL 礦物培養基 NTU-1 菌液與 200 μL 的 正十六烷一同加入體積為100 mL 的礦物培養基，經過培養 72 小時後，利用孔 徑大小14mesh (1.18 mm) 的篩網將形成的 NTU-1 結塊分離放入玻璃真空瓶中，

此時每100 mL 礦物培養基中產生的 NTU-1 結塊量大約為 0.02 ~ 0.025 g。接著我 們加入10%保護劑 (w/v) 2 mL ( NTU-1 細菌結塊與保護劑的重量比值約為 0.1)，

將結塊與保護劑充分搖晃混合後，置入－20℃的冰箱冷凍 24 小時。24 小時後進 行真空冷凍乾燥的步驟將水份移除，所需時間一樣為24 小時。冷凍乾燥完成後，

將乾燥完成的NTU-1 結塊在真空下封瓶並置放於不同環境下保存。接著依實驗 條件秤取乾燥後的產品，而由於乾燥產品中不僅含有乾燥NTU-1 結塊且含有乾 燥後的保護劑，因而要知道實際初始的NTU-1 結塊重量，必須先將乾燥後的成

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品加入礦物培養基復水之後，再利用0.3 μm 的濾紙過濾，過濾完成後置入烘箱 中乾燥，進而測得初始乾燥NTU-1 結塊量。而我們將乾燥後的產品 (含乾燥保 護劑及NTU-1 結塊) 與 2000 ppmv 正十六烷再加入 100 mL 礦物培養基後，則開 始進行正十六烷的生物復育實驗。

以下以培養基酸鹼值變化、NTU-1 細胞密度分布變化及正十六烷之分布來 觀察討論NTU-1 的生長情形，分別以圖 4.3.2-1 ~ 3 表示。由圖 4.3.2-1 中可以發 現培養基中酸鹼值的變化在兩組不同保護劑及存放條件下的變化趨勢並不明顯。

以10%麥芽糖為保護劑的組別到達第 48 個小時，培養基酸鹼值的變化大約從 6.8 降到6.4 左右。而以 10%甘露糖醇為保護劑的組別則更明顯的沒有太大的變化，

從第12 小時開始就維持在 6.6 左右。這個現象顯示了乾燥後 NTU-1 細菌結塊的 活性可能很低或是已經不具活性，所以對正十六烷不會進行降解而產生酸性代謝 物。

為了更清楚的了解乾燥後的NTU-1 細菌結塊是否具有活性，接著來看圖 4.3.2-2 NTU-1 細胞密度的分布圖。圖 4.3.2-2 也可明顯看出細胞密度的分布及趨 勢，由變化趨勢來看可以看出在48 小時內，以 10%麥芽糖為保護劑的組別其總 細胞密度由初始的0.24 g/L 增加到 0.29 g/L，變化量在 48 小時中只增加了 0.05 g/L。

另外一組以10%甘露糖醇為保護劑的組別，其細胞密度變化由初始的 0.25 g/L 到 第48 小時約為 0.27 g/L，也只提升了 0.02 g/L。由這樣的變化趨勢來看可以知道 細胞的生長速率很緩慢甚至可以說是幾乎沒有生長，再次的顯示乾燥後的NTU-1 結塊活性很低。

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Incubation Time (hr)

10% Maltose, 0day

10% Mannitol, -20deg for 30days

圖4.3.2-1 培養條件 30℃、往復式震盪培養 100 rpm、初始 pH 值 6.8，MSM 礦

Cell Density (g/L)

Incubation Time (hr)

Dispersed cells(10% Maltose, 0day) Cell pellets

Total

Dispersed cells(10% Mannitol, 30days) Cell pellets

Total

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接著將初始正十六烷的量及反應過程中正十六烷殘餘在培養基及被NTU-1 細菌結塊包覆的量匯集成圖4.3.2-3。由圖中第 0 個小時來看，可以看出初始正十 六烷的濃度不只有實驗中所添加的2000 ppmv，而有 2500 ~ 2600 ppmv 左右。這 是因為實驗中是先利用 NTU-1 礦物培養基菌液來降解正十六烷並聚集形成結塊，

接著利用這些細菌結塊來進行冷凍乾燥，所以乾燥後的NTU-1 細菌結塊上含有 一些殘留的正十六烷，乾燥後NTU-1 細菌結塊如照片 4.3.2-1 (A)、(B) 所示。因 而當將乾燥後的結塊加入MSM 礦物培養基時，同時也會把一部分的正十六烷帶 進到培養基中。

實驗過程中發現反應經過1 ~ 2 小時以後，NTU-1 乾燥的粉末就能再形成結 塊把正十六烷包覆起來，但結塊形成的初期形態顯得較鬆散，且由於我們希望能 看到細胞生長的情形，所以選擇把分析的時間延長至第12 個小時才開始取第一 個點。

由正十六烷分布圖4.3.2-3 可以看出，乾燥後的 NTU-1 結塊能在 12 小時內 把大部分在培養基中的正十六烷給包覆起來因而能以60 mesh 的篩網來進行分 離。其結塊形態如照片4.3.2-1 (C)、(D) 所示。但隨著時間的增加，正十六烷包 覆的量並沒有明顯的提升，顯示在第12 小時以內，NTU-1 能包覆的正十六烷的 量已經達到平衡。另外由正十六烷分布圖4.3.2-3 (A)、(B) 這兩張圖的每個時間 點來看，第12 及 24 小時正十六烷分布於礦物培養基及被包覆的量總和與初始的 正十六烷量差不多，而在第36 及 48 小時的總正十六烷分布和則相較於初始正十 六烷的值來得少一些，大概少了100 ~ 200 ppmv。這個 100 ~ 200 ppmv 的正十六 烷有可能是被NTU-1 降解掉的量，但也有可能是實驗中取樣及測量的誤差值。

這樣的實驗結果顯示，乾燥後NTU-1 細菌結塊的活性是很低的，可見實驗中添 加的保護劑對於NTU-1 細菌結塊的保護效果有限，至於為什麼保護效果有限，

將於4.3.4 節進行討論。

由以上結果也可以發現，雖然乾燥後的NTU-1 細菌結塊存活率不高，然而 其包覆正十六烷的能力並沒有因為NTU-1 的活性降低而喪失。故接著討論乾燥

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後NTU-1 細菌結塊對於正十六烷的包覆效果，以第 24 個小時為例，實驗結果發 現10%麥芽糖為保護劑的組別，其 NTU-1 以 0.19 g/L 的結塊密度即包覆了約 2000 ppmv 的正十六烷。10%甘露糖醇為保護劑的組別在 24 個小時則以約 0.21 g/L 的 結塊密度包覆了約2100 ppmv 的正十六烷，這個結果顯示條件為初始乾燥菌量 0.24 ~ 0.25 g/L 的 NTU-1 能夠以每單位重量的細胞包覆約 8 倍重左右的正十六 烷。

最後將正十六烷在此系統中的總移除百分比表示於圖4.3.2-4 中。因為正十 六烷在此實驗中的降解量很低，甚至可能根本沒有降解而只是實驗的誤差值，所 以在這裡計算正十六烷總移除百分比的方法是將測得殘餘在培養基與包覆在結 塊中的正十六烷量之和當作正十六烷的總量，再以被包覆於結塊中的正十六烷量 除上正十六烷的總量來當作移除的效率。

 總移除百分比 (%) = ^{包覆於 結塊中正十六烷的量}

正十六烷的總量

100

 正十六烷的總量 = 殘餘在礦物培養基中正十六烷的量 + 包覆於 NTU-1 結 塊中正十六烷的量

由圖4.3.2-4 顯示，以 10%麥芽糖或是以 10%甘露糖醇為 NTU-1 細菌結塊冷 凍乾燥中的保護劑組別皆在第12 小時內即可移除掉 80% ~ 90%的正十六烷，但 在12 小時後並沒有因為搖晃培養時間的增加而提升其移除效果。

這個部分的實驗結果皆顯示乾燥後NTU-1 細菌結塊的存活率不高，但可能 因為細胞的疏水性表面並沒有遭受破壞，因而保存30 天後仍具有相當高的包覆 能力，在12 小時以內就可以移除掉 80 ~ 90%的正十六烷，對比之前的實驗中要 到第32 ~ 44 小時才有明顯結塊產生，將冷凍乾燥後 NTU-1 結塊應用在烷類移除 上，不僅可提早結塊形成的時間並能快速移除大量的烷類。故此方法對於石油碳

這個部分的實驗結果皆顯示乾燥後NTU-1 細菌結塊的存活率不高，但可能 因為細胞的疏水性表面並沒有遭受破壞，因而保存30 天後仍具有相當高的包覆 能力，在12 小時以內就可以移除掉 80 ~ 90%的正十六烷，對比之前的實驗中要 到第32 ~ 44 小時才有明顯結塊產生，將冷凍乾燥後 NTU-1 結塊應用在烷類移除 上，不僅可提早結塊形成的時間並能快速移除大量的烷類。故此方法對於石油碳