細胞週期及 sub-G1 的影響

Propidium iodine (PI)是核酸的螢光染劑，具專一性可與核酸鍵 結。正常的情況下細胞膜是呈完整性，所以 PI 染劑是無法染進穿透細 細胞死亡的時候，其細胞膜會呈現不完整狀態，利用 Propidium Iodine

（PI）染劑，使細胞核的 DNA 被 PI 染上。被染上 PI 的細胞再利用流式 細胞計數儀可以在 488 nm 的位置激發出螢光，而死亡的細胞會有較高 的紅色螢光，存活的細胞則有較弱的紅色螢光。再以 Cell Quest 軟體分

析計算。

細胞增值率計算公式：

(實驗組存活細胞數÷對照組存活細胞數)×100%

圖 十三 進行流式細胞計數儀分析出來的細胞週期標準圖。

COLO 205細胞使用6 well的培養盤，以2×10⁵ cells/well的密度培養 實驗需要的時數，以DMSO為溶媒，加入Cantharidin （濃度為20μM）

的最終濃度是1﹪，DMSO為control組。等培養時間（分別培養12、24、

48小時）到之後，利用trypsin反應約3分鐘使細胞游離培養盤的表面，以 1X PBS 清洗兩次，以1500 rpm離心5分鐘，去上清液，將細胞打散以4

℃、70﹪的酒精固定細胞，放入-20 ℃冰箱隔夜存放overnight。隔天，

將細胞懸浮液以1500 rpm、5分鐘離心去除酒精上清液，再以1X PBS 清 洗兩次之後，再離心去上清液，將細胞打散，加入400~500μL的低張PI stain染劑(0.1% sodium citrate, 0.1% Triton X-100, 20 μg/ml PI)，避光30分 鐘之後轉移到FACS專用小管，進行流式細胞計數儀檢測，以一秒細胞 數不超過100顆細胞，每個數據收集10000顆細胞，數據以Modfit LT®軟

體進行處理分析⁽⁸³⁾。記錄G1、S、G2/M phase、sub-G1的比例。每個實 驗組皆以三重複增加實驗的準確度。

2. Annexin-V assay⁽⁸⁴⁾

細胞在凋亡時，首先DNA 會斷裂，此部份可利用 TUNEL assay 來 觀察，再來原本存在於細胞膜內的phosphotidylserine (PS)會外翻到細胞 膜外側表面。Annexin-V 是一種分子量約 35-36KD 的 Ca⁺⁺依賴性磷脂結 合蛋白，可與PS 有高親和力，與 PS 結合會發出黃綠色螢光。然後用流 式細胞儀分析凋亡細胞的百分率(圖 十四)。

圖 十四 Annexin-V 的作用示意圖

COLO 205 經Cantharidin (20mM)處理6-12小時，離心收集細胞，用 PBS 清洗細胞兩次，加入 1X binding buffer (0.1 M HEPES, pH 7.4; 1.4 M NaCl; 25 mM CaCl2)，取出100 μL 的溶液，加入 Annexin-Ⅴ-FITC，

避光室溫靜置15 分鐘，然後每個試管加入 400 μL 的 1X binding buffer，在 1 小時內用流式細胞儀分析⁽⁸⁵⁾ 。

3. 檢測細胞內粒線體膜電位的變化⁽⁸⁶⁾

DiOC6 (3-3’-dihexyloxacarbocyanine)為對粒線體具專一性之親脂 性陽離子螢光染劑，容易和帶有負電性之粒線體內膜結合，當粒線體受 刺激去極化而失去內膜之負電荷時，內膜被標定 DiOC6 會減少，因此 螢光強度也會降低，可作為偵測粒線體膜電位（MMP）之指標。在流式 細胞儀中可由488 nm 雷射激發出 525 nm 的螢光，以 FL1 之濾鏡偵測所 放出的螢光強度，藉以分析MMP。而粒線體的退極化（mitochondria membranes depolarization）伴隨早期的細胞凋亡發生，因此亦可做早期 凋亡偵測上的指標。

培養細胞之細胞數約 2×10⁵/well，要有 1-2 個 well 做 blank。將人 類大腸直腸癌細胞株（COLO 205）種於 12 well 培養盤中，培養 24 小 時，給予 Catharidine 藥物，分別培養 3 小時、6 小時、12 小時後收集細 胞，PBS 清洗，離心後去除上清液，加入 MMP 試劑（10 μl DioC6/500 μl 之 1 倍的 PBS），量視細胞數多寡而定，混合均勻，Blank 只加等量 1X PBS，放入水浴鍋 37℃中，避光 30 分鐘，之後移置 FACS 管上流式細 胞儀分析。將 blank（斜線的 peak）調在 10⁰~10¹之間，control (格線的 control)調在 10¹～10²之間，樣品上機後，分析 MMP （peak 往右移代 表樣品的粒線體膜電位上升，表示藥物對粒線體沒影響。往左移代表粒 線體膜電位下降，導致細胞凋亡）。

4. 活性氧化物（Reactive oxygen species, ROS）產生之檢測⁽⁸⁷⁾

2’,7’- Dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)，為一種具 有螢光性質可通過細胞膜並具特異性追蹤評估細胞內產生 ROS 的多 寡，進行細胞染色。當H2DCF-DA 細胞內的乙醯脂酶（easterase）去乙 醯化（deacetylate）後會形成非螢光性的 DCFH，DCFH 會被細胞內的 H₂O 氧化成具螢光性質的 DCF，並聚集在粒線體中，在流式細胞儀中可 由 488 nm 雷射激發出 355 nm 的螢光，藉以分析細胞內的 ROS 含量。

培養細胞之細胞數約 2×10⁵/well，要有 1-2 個 well 做 blank。將人 類大腸直腸癌細胞株（COLO 205）種於 12 well 培養盤中，培養 24 小 時，給予Cantharidin (20 μM)，分別培養 3 小時、6 小時、12 小時後收 集細胞，1X PBS 清洗，離心後去上清液，加入 ROS 試劑（每支離心管 所需的量是 1 μl H2DCF-DA/500 μl 之 1X PBS）500 μl，混合均勻，Blank 只加等量1X PBS。放入水浴鍋 37℃中避光 30 分鐘，之後上流式細胞儀 分析。將 blank （斜線的 peak）調在 10⁰~10¹之間，control (格線的 control) 調在10¹～10²之間，樣品上機後，分析ROS （peak 往右移代表樣品的 ROS 增加，往左移則代表 ROS 被清除(抗氧化)）。

5. Caspase-3,-8,-9 活性分析⁽⁸⁸⁾

PhiPhiLux 是利用設計一段可供 Caspase-3 及 Caspase-3-like 蛋白 辨識, 且能主動被細胞嗜入, loop 結構兩端標有螢光的 peptide,此段 peptide 稱為 PhiPhiLux。當此 PhiPhiLux 與受到刺激而產生凋亡現象的 細胞 (suspension / adherence ) 共同培養時, 會主動被這些已經 Induced Living Cell 大量噬入,由於此活細胞內部產生的 Caspase-3 結合到 PhiPhiLux 上的 GDEVDGI, 加上序列 PNP 的輔助, 造成 PhiPhiLux 結構上的斷裂, 使 Loop 結構兩端的螢光物質結合, 因而產生螢光。也 因此設計原理, PhiPhiLux 有放大活細胞內 Caspase-3 與 Caspase-3-like 的訊號放大的功能，另外偵測 Caspase-8,-9 活性亦以相同原理，但用 CaspaLux 染劑來偵測。之後用流式細胞儀以 488 nm 激發光,偵測定量與 定性，偵測到更早期、更完整、更準確的活細胞凋亡狀態。

培養細胞之細胞數約2×10⁵/well。將人類大腸直腸癌細胞株（COLO 205）種於 12 well 培養盤中，培養 24 小時，給予 Cantharidin （20 μM）

藥物，收集細胞，離心到第二次，去上清液，避光加入染劑，每管加25 μl (10 μM substrate [Phiphilux for Caspase-3, CaspaLux L1D2 for Caspase-8 CaspaLux M₁D₂ for Caspase-9])，於 37℃中避光 60 分鐘。60 分鐘後，離 心 1500 rpm、5 分鐘，先把染劑倒掉，再用 1X PBS 把殘留染劑洗 1~2 次後，每管加入 500μl 之 1X PBS，並移至 FACS 管，之後上流式細胞 儀分析。Control (格線的 control)調在 10¹～10²之間，樣品上機後，分析 Caspase-3,-8,-9 活性（peak 往右代表樣品的 Caspase-3,-8,-9 活性產生）。

六、 細胞內分子螢光染色—TUNEL/DAPI 螢光染色法

1. TUNEL (Terminal deoxynucltidetransferase dUTP Nick End Labeling) / DAPI （4-6-diamidine-2-phenyl indole）染色

DNA 雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列 DNA 的 3’-OH 末端可在脫氧核糖核酸末端轉移脢（TdT）的作用下，將脫氧核 糖核酸和熒光素、過氧化物脢、堿性磷酸化脢或生物 Living beings 素形 成的衍生物 Living beings 標記到 DNA 的 3’-末端，從而可進行凋亡細 胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核酸末端轉移脢介導的缺口末端 標記法（TUNEL）。DAPI 是一種核酸螢光染劑，會專一性的結合在 DNA 雙螺旋之小溝上的 AT 區，當細胞產生凋亡時會有染色質皺縮、DNA 片

Formaldehyde / 1X PBS，固定 15 分鐘，吸掉 3% Formaldehyde，用 1X PBS 洗二次，加入 0.1% Triton X-100 / in 1X PBS (1 ml)反應 15 分鐘，

再用1X PBS 洗二次，加入 In Situ Cell Death Detection Kit (TUNEL)中提 供的螢光染劑，在 37℃下避光反應 60 分鐘後用 1×PBS 清洗細胞三次，

再於避光環境加入加入 DAPI 染液 ( 1 μg/1 ml )約 300 μl，在 37℃避光 30 分鐘，吸掉染劑，用 1X PBS 洗三次，於倒立螢光顯微鏡 F = 200X

觀察細胞核與DNA 斷裂之變化並照相。 buffer、5μl ATP (1mM)與 5μl biotinylated MV peptide 當受質於 30℃反應 30 分鐘，再加入 200μl stop reagent 終止反應。然後離心(14,000 rpm，15 秒)，將 100μl 的上清液移至經處理的 96-well 之培養皿中，於 25℃中避 光反應 1 小時後，去上清液，以 1X PBS 清洗 5 次，再加入 100μl POD-streptavidin 於 25℃中避光反應 30 分鐘，以 1X PBS 清洗 5 次最後 加入POD substrate 於 25℃中避光反應 5 分鐘，用 ELISA reader 於波長 492 nm 下測吸光值。

八、 即時定量聚合酵素連鎖反應（Real-time Polymerase Chain Reaction）（Real-time PCR）

係利用對雙股 DNA 具有特異性結合能力的螢光染料，加入 PCR 反應過程之中。利用螢光信號積累即時監測整個 PCR 反應過程，最後 利用過程中的螢光信號及反應循環次數的數據，以數學計算分析得知未 知標本的DNA 的起始含量。每個標本的 Ct 值與該標本的起始拷貝數的

對數存在線性關係，起始拷貝數越多，Ct 值越小。

利用Gene QuantⅡ (Pharmacia Biotech)測量 RNA 濃度及 A260/280 在 1.8~2.0 之間確保 RNA 的純度及品質。

biotin / dNTP mixture 和 1 μl klenow enzyme (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)，混合均勻並放入 37℃水浴槽作用 20 小時。合成 好的探針須放在-20℃保存。

4. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR)的分析

利用LightCycler (Roche Applied science, Mannheim,

Germany) 進行 Real-time PCR，取 1μl 之 cDNA (約 50ng RNA)，加 1μl 之 LC Fast Start DNA Master SYBR Green Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 及 3-4mM MgCl₂ 和 0.5mM 待偵測基因 primers，

最後體積為 10μl。 PCR 條件為 95℃，5 秒，Anneal 溫度依 primer 而 異，時間為5 秒，最後 72℃ (temperature ramp was 20 ℃ / sec)，8 秒，

進行45 cycles。擴增產物的專一性由 Melting curve 來判定。以 GAPDH gene 當作 internal control 來校正相對的 mRNA concentrations，為了要 保證實驗的準確性及再現性，在不同的時間點重覆實驗，Real-time PCR 之資料利用 LightCycler Software Version3.5 軟體內之 second derivative maximum method 來訂定 Ct，最後再用 ΔCt 方法來計算基因之表現量。

九、西方墨點法

1. 細胞總蛋白質的抽取⁽⁹³⁾

培養細胞之細胞數約 1×10⁷ cells。將人類大腸直腸細胞癌細 胞株（COLO 205）種於 75T 培養瓶中，培養 24 小時，給予 Cantharidin

（20 μM）至培養液中，分別培養 6 小時、12 小時、18 小時、24 小 時，分別以 trypin 處理，將細胞收集至離心管離心 1500 rpm、5 分鍾，

離心後去除上清液，加入適量1X PBS，將細胞收取下移至 1.5 ml 的 eppendorf tube，再離心一次，然後加入適量的 lysis buffer (pH 7.4 Tris-HCl 50 mM、EDTA 0.5 mM、EGTA 0.5 mM、5 μg/μuL Aprotinin 0.3% 2-Mercaptoethanol、0.2 mM PMSF、5 μg/μl Leupeptin、)，置於 -80℃冰箱放置 24 小時後，取出然後離心 12000 rpm、20 分鐘、4℃，

取所有上清液此為總蛋白質，接著用 100℃沸水煮 5~10 分鍾，即可 置於-20℃冰箱保存備用，待所有時間點收齊再進行下面實驗。

2. 蛋白質定量

a. 檢量線的製作

以Bradford 定量法，使用胎牛血清白蛋白(Bovine serum albumin;

BSA)做為蛋白質標準品，利用酵素免疫分析儀（ELISA reader）在 O.D. 570 nm 測定蛋白質標準品吸光平均值來做檢量線（standard

curve），以計算蛋白質濃度，並求出趨勢線方程式及 r²值。

先取 Bradford reagent 染劑適量備用。取適量已配製好的標準品

（BSA 1mg/ml）加等量的二次水調配最終濃度梯度為 1、0.5、0.25、

0.125、0.0625、0 mg/ml，各取 10 μl 加 100 μl Bradford reagent 混合均 勻，置於 96 well plate 中（二重複），靜置 5 分鐘後以 O.D. 570 nm 測 量吸光值，測得標準品之吸光平均值，以 O.D. value (Y) 對蛋白質濃 度μg/ml（X），求出趨勢線方程式 y=ax+b，r²值趨近於0.99。

b.樣品定量

將待測蛋白稀釋10 倍，取 10 μl 已配製好的待測蛋白質加 100 μl Bradford reagent 混和均勻，置於 96 well plate 中（二重複），靜置 5 分鐘後以O.D. 570 nm 測量吸光值，所測得的 O.D. value (Y)，帶入趨 勢線方程式y=ax+b，求出該待測蛋白的蛋白質濃度（μg/ml）。

3. SDS-PAGE 凝膠電泳

a.SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)電泳：

電泳法是利用外加電場，對溶液中的帶電分子造成影響而使這些 分子移動，進而分離不同分子量的蛋白質。先配製下層膠，然後注入 膠台，緩緩用二次水去除氣泡並壓平下層膠的上緣，靜置一段時間待